Name: in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency
Uploaded: 2020-05-11T12:30:00
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Dr. Sylvie Morgeaux e Dr. Jean-Michel Chapsal devem ser reconhecidos por sua participação fundamental para estabelecer o ensaio ELISA em lotes de vacinas e organizar workshops internacionais e estudos colaborativos. Agradecemos a Sabrina Kali pela leitura crítica do manuscrito. O Dr. Pierre Perrin foi responsável pelo isolamento e caracterização do mAb-D1. Este trabalho tem sido apoiado principalmente pelo financiamento do Institut Pasteur.

1. Precauções de segurança
NOTA: Este método é aplicável tanto ao RABV vivo quanto à vacina inativada.
<ol><li>Use bons procedimentos de prática e segurança laboratorial.</li>
	<li>Use equipamentos de proteção individual adequados (EPI) incluindo casaco descartável, luvas, máscara, óculos, etc.</li>
	<li>Quando o vírus vivo for titulado, use um gabinete de segurança biológica classe II.<ol>
<li>Considere qualquer material em contato com as amostras (reagentes, soluções de ...

O epítopo reconhecido pelo mAb-D1 está localizado no sítio antigênico III da glicoproteína RABV que não só é imuno-dominante para a indução de VNAbs, mas também envolvido em neurovibramento, patogenicidade40,,41 e reconhecimento de receptorescaneamento 42. Há outro importante local antigênico ao longo da glicoproteína, o local II43, contra o qual vários MAbs foram isolados, como o mAb-WI-1112<sup clas...

Há mais de 50 anos, o teste NIH1 é usado como método padrão-ouro para avaliar a potência da vacina antirrábica antes da liberação do lote. Este teste consiste em uma imunização intraperitoneal de grupos de camundongos com a vacina a ser testada seguida de um desafio intra-cerebral (IC) 14 dias depois com a cepa Challenge Virus Standard (CVS) do vírus da raiva (RABV). A potência é avaliada a partir da proporção de camundongos que sobreviveram ao desafio do IC. Embora a OMS2 ea Farmacopéia 3 ainda exijam o teste do NIH para avaliar a potência da vacina, este teste sofre vários obstáculos: os resultados são altamente variáveis4; O RABV infeccioso é utilizado durante o desafio e isso requer habilidade técnica e medidas rigorosas de biossegurança; um grande número de animais é utilizado, e a gravidade do desafio levanta sérias preocupações éticas5. Uma variação menos severa deste teste foi desenvolvida: duas semanas após a imunização intra-peritoneal, os camundongos não são desafiados pelo IC, mas sangraram e foram testados para a presença de anticorpos neutralizantes RABV específicos (VNAbs) em seu soro usando um teste de neutralização in vitro. No entanto, este teste ainda requer sacrificar um grande número de ratos de laboratório, embora já esteja em uso para as vacinas veterinárias6,7 e tenha sido considerado para vacinas humanas8.
A partir de agora, tanto as recomendações internacionais9 quanto aseuropeias 10 incentivam os fabricantes e os Laboratórios Nacionais de Controle de Medicamentos (Laboratórios Oficiais de Controle de Medicamentos - OMCLs) a implementar a Substituição, Redução e Refinamento de testes em animais de laboratório, referida como a estratégia 3Rs. A Diretiva Europeia 2010/63/UE (em vigor desde 2013/01/01) relacionada à proteção e bem-estar dos animais também reforçou as restrições para os fabricantes de vacinas e laboratórios envolvidos no Controle de Qualidade das vacinas antirrábicas, bem como na pesquisa antirrábica11. Como resultado, o desenvolvimento, a validação e o uso de abordagens alternativas in vitro tornaram-se agora uma prioridade. Estes não são apenas eticamente sólidos, mas também podem reduzir os custos de teste em lote e reduzir o tempo para os resultados para horas em vez de semanas3.
Na superfície da partícula RABV, a glicoproteína adota uma forma trimérica12,,13,14,,15,16. Na vacina antirrábica, esta forma trimérica nativa constitui o maior imunogênio indutor de VNAbs17, enquanto as glicoproteínas monoméricas, solúveis ou desnaturadas são mal imunogênicas18,19. Assim, a preservação dos aparadores da glicoproteína ao longo do processo de produção da vacina é um bom indicador para a preservação de um potencial imunogênico ideal. Vários métodos imunoquímicos, tais como o anticorpo-binding-test20,21, o teste de imunodifusão radial única (SRD)22 e o teste ELISA23,24,25,26,27 sãorecomendados pelo Relatório Técnico da OMS Série2 e a monografia europeia3 para quantificar o teor de antígeno nas vacinas antigen raes. Estes são utilizados pelos fabricantes para monitorar a consistência da produção de vacinas e pela OMCL para avaliar a formulação consistente de lotes de vacinas humanas28, mesmo que o teste do NIH ainda seja considerado para a potência.
No entanto, todos esses métodos imunoquímicos não são equivalentes. O teste SRD requer um pré-tratamento que pode alterar os aparadores ancorados na membrana e resultar em uma forma solúvel ou desnaturada da glicoproteína22,29. Portanto, o SRD não é muito eficiente em discriminar as glicoproteínas imunogênicas e não imunogênicas, resultando em uma avaliação imperfeita da imunogenicidade de um lote vacinal. Em contraste, o teste ELISA é mais sensível22, preserva a estrutura nativa da glicoproteína, e é mais apropriado para determinar o conteúdo dos aparadores nativamente dobrados de glicoproteína. O teste ELISA pode usar anticorpos antiglicoicos monoclonais de coelho ou de camundongos purificados ou concentrados com sulfato de amônio. Estudos demonstraram boa concordância entre o teste do NIH e o teor de antígeno avaliado pela ELISA nas vacinas e concluíram que os métodos ELISA são adequados para o teste de potência in vitro. Isso defende que os testes ELISA podem pelo menos complementar ou mesmo substituir o teste NIH4,,26,27,30,,31,32,33. Hoje, a Farmacopoeia europeia recomenda o uso de ensaios sorológicos ou imunoquímicos validados como alternativas ao teste DO NIH3. A completa evitação do uso animal para a potência da vacina tornou-se uma perspectiva realista.
O método apresentado abaixo baseia-se em uma imunocaptura indireta do sanduíche ELISA usando um clone de anticorpo monoclonal de rato (mAb-D1) que reconhece os sítios antigênicos III (aa 330 a 338) da glicoproteína rabv trimeric15,34. Este método foi desenvolvido inicialmente no laboratório Institut Pasteur26,30 depois otimizado e validado pela Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), ou seja, o Francês OMCL4,33. O mAb-D1 é usado tanto para sensibilizar a placa quanto posteriormente para detectar o antígeno capturado. Isso permite a quantificação específica dos aparadores de glicoproteína, ou seja, o antígeno rabv imunogênico. O mAb-D1 utilizado para a detecção é rotulado com peroxidase, o que é revelado na presença do substrato e do cromógeno. A comparação da absorvância medida para a vacina testada e da vacina de referência permite determinar o teor de glicoproteína imunogênica. Note-se que o mesmo tipo de ensaio pode ser aplicado para diferentes mAbs reconhecendo diferentes locais antigênicos da glicoproteína RABV35. O método para obter e purificar ou concentrar-se com sulfato de amônio antiglicoproteína poliglobulinas de coelho g (IgG) ou globulinas de camundongos monoclonais foram extensivamente descritos anteriormente36 juntamente com o método para conjugar anticorpos com peroxidase37.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1523px;" width="1522">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:340px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">10445753</td>
			<td style="width:456px;">if titrating live virus</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:465px;">Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 &#181;L, MAXISORP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>439454</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:85px;width:465px;">Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12576606</td>
			<td>for the preparation of sulfuric acid</td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:113px;width:465px;">Immunology Plate Strong 
			Adsorption MAXISORP Flat Bottom 
			Well F96</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>55303</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate Sealing Tape(100 sheets)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate&#160; single mode reader Sunrise</td>
			<td style="width:340px;">TECAN</td>
			<td style="width:262px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate shaker-incubator</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>441504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate washer Wellwash</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5165000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:465px;">Multichannel pipette (30-300 &#181;L) 12 channels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">4661180N</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:104px;width:465px;">Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 &#956;L micro, 2-20 &#956;L, 20-200 &#956;L &#38; 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4700880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency

A crescente preocupação global com o bem-estar animal está incentivando os fabricantes e os Laboratórios Nacionais de Controle (OMCLs) a seguir a estratégia do 3Rs para a substituição, redução e refinamento dos testes em animais de laboratório. O desenvolvimento de abordagens in vitro é recomendado nos níveis da OMS e da Europa como alternativas ao teste do NIH para avaliar a potência da vacina antirrábica. Na superfície da partícula do vírus da raiva (RABV), os aparadores de glicoproteína constituem o maior imunogênio para induzir anticorpos neutralizantes virais (VNAbs). Um teste ELISA, onde os anticorpos monoclonais neutralizantes (mAb-D1) reconhecem a forma trimérica da glicoproteína, foi desenvolvido para determinar o conteúdo da glicoproteína trimérica dobrada nativa, juntamente com a produção dos lotes da vacina. Este teste de potência in vitro demonstrou uma boa concordância com o teste do NIH e foi encontrado adequado em ensaios colaborativos por fabricantes de vacinas RABV e OMCLs. Evitar o uso de animais é um objetivo alcançável em um futuro próximo.
O método apresentado baseia-se em uma imunocaptura indireta do sanduíche ELISA utilizando o mAb-D1 que reconhece os sítios antigênicos III (aa 330 a 338) da glicoproteína rabv trimérico, ou seja, o antígeno rabv imunogênico. mAb-D1 é usado tanto para revestimento quanto para detecção de aparadores de glicoproteína presentes no lote da vacina. Uma vez que o epítopo é reconhecido por causa de suas propriedades conformacionais, a glicoproteína potencialmente desnaturada (menos imunogênica) não pode ser capturada e detectada pelo mAb-D1. A vacina a ser testada é incubada em uma placa sensibilizada com o mAb-D1. As glicoproteínas rabv triméricas atadas são identificadas adicionando novamente o mAb-D1, rotulado com peroxidase e depois revelado na presença de substrato e cromógeno. A comparação da absorvância medida para a vacina testada e da vacina de referência permite determinar o teor de glicoproteína imunogênica.

No exemplo a seguir, é utilizada a vacina de referência Lote 09, composta por partículas purificadas do vírus da raiva inativada (cepa de vacina FOTO), é utilizada. O teor de aparadores de glicoproteína (10 μg/mL) foi estabelecido após a determinação da quantidade total de proteínas virais (teste BCA) e avaliação da porcentagem da glicoproteína por eletroforese em gel de poliacrilamida. Alternativamente, pode-se utilizar uma vacina de referência calibrada, por exemplo, a<su...

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In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Aqui descrevemos uma imunocaptura indireta do sanduíche ELISA para determinar o conteúdo de glicoproteína imunogênica em vacinas antirrábicas. Este teste usa um anticorpo monoclonal neutralizante (mAb-D1) reconhecendo aparadores de glicoproteína. É uma alternativa ao teste in vivo NIH para acompanhar a consistência da potência vacinal durante a produção.

Teste in vitro ELISA para avaliar a potência da vacina antirrábica

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Com o objetivo de reduzir os testes em animais e por causa da variabilidade do teste de NH, a OMS incentiva a desenvolver abordagens in vitro para avaliar a potência da vacina antirrábica. Este teste ELISA mostra uma boa concordância com um teste clássico de NH no reconhecimento da forma imunogênica da glicoproteína, mostra uma alta sensibilidade, podendo ser realizado em apenas um dia. A avaliação da potência da vacina antirrábica in vitro pela ELISA é uma alternativa ao teste in vivo NH.É promovido pelos fabricantes e laboratórios nacionais de controle. É fundamental distribuir volumes pré-dimensionados em duplicação para cada diluição e secar bem a placa em papel absorvente após lavagens Para evitar Para iniciar este procedimento, coloque equipamentos de proteção pessoal adequados, incluindo casaco descartável, luvas, máscara e óculos. Trate os materiais contaminados imergindo-os em uma solução de hipoclorito de sódio de 2,6% por 30 minutos para descontaminação.Em seguida, estabeleça uma placa de imunoensaio de 96 poços e adicione 200 microliters do anticorpo monoclonal diluído no tampão de carbonato a cada poço. Cubra a placa com filme adesivo e incubar a microplacão a 37 graus Celsius por três horas em um ambiente umidificado. Em seguida, aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo do poço para um receptor contendo uma solução de hipoclorito de sódio de 2,6%.Inverta a microplacão e deixe secar em papel absorvente à temperatura ambiente por cinco minutos. Primeiro, adicione 300 microliters do buffer de passivação a cada poço. Cubra a placa com filme adesivo e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos.Depois disso, transfira o conteúdo do poço para um contendo uma solução de hipoclorito de sódio de 2,6%. Para lavar a placa, adicione 300 microliters do tampão de lavagem a cada poço. Em seguida, aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo do poço para um destinatário contendo uma solução de hipoclorito de sódio de 2,6%.Repita este processo de lavagem mais cinco vezes para lavar extensivamente a placa sensibilizada. Depois disso, inverta a microplacão e deixe-a secar em um pedaço de papel absorvente à temperatura ambiente por um minuto. Reconstitua a vacina de referência em um mililitro de água destilada de tal forma que a concentração final do vírus da raiva glicoproteína é de 10 microgramas por mililitro.Prepare uma diluição 10 vezes da vacina de referência reconstituída no diluente para atingir a concentração de glicoproteína do vírus da raiva de um micrograma por mililitro. Em seguida, realize seis diluições em série duas vezes desta vacina de referência no diluído, conforme descrito na tabela um do protocolo de texto. Distribua 200 microlitres do diluído em poços duplicados para servir como controle cego e 200 microliters por poço para cada diluição vacinal de referência em duplicata.Em seguida, prepare uma diluição 10 vezes da vacina testada no diluído e prepare sete diluições seriais duplas da vacina testada em diluente, conforme descrito na tabela dois do protocolo de texto. Distribua 200 microlitadores de cada diluição vacina testada em duplicação para cada poço da microplacão. Cubra a microplacão com filme adesivo e incubar a 37 graus Celsius por uma hora.Depois disso, remova o filme. Aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um receptor contendo uma solução de hipoclorito de sódio de 2,7%. Para lavar a placa, adicione 300 microliters de tampão de lavagem a cada poço, aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um recipiente contendo uma solução de hipoclorito de sódio de 2,6%.Repita o processo de lavagem mais cinco vezes para remover o antígeno desvinculado e conservar os aparadores de proteína G ligados ao anticorpo revestido. Inverta a microplacão lavada e deixe secar em um pedaço de papel absorvente à temperatura ambiente por um minuto. Em seguida, distribua 200 microliters da diluição recomendada de peroxidase rotulado anticorpo monoclonal D1 em diluente para cada poço.Cubra a microplacão com filme adesivo e incubar a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, remova o filme, aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um receptor contendo uma solução de hipoclorito de sódio de 2,6%. Para lavar a microplacão, adicione 300 microliters de tampão de lavagem a cada poço.Aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um receptor contendo 2,6% de solução de hipoclorito de sódio. Repita este processo de lavagem mais cinco vezes para remover o anticorpo rotulado peroxidase não ligado. Inverta a microplacão lavada e deixe secar em um pedaço de papel absorvente à temperatura ambiente por um minuto.Em seguida, distribua 200 microliters de solução substrato-cromógeno em cada poço. Sele a microplacão com filme e incubar à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. Em seguida, adicione 50 microliters de solução de parada em cada poço para parar a reação.Limpe cuidadosamente a parte inferior da microplacão e coloque-a no espectotúmetro. Determine a densidade óptica em 492 nanômetros para todos os poços utilizados. Colete esses dados em um arquivo de planilha para análise.Depois disso, crie gráficos tanto para a curva de vacina de referência quanto para os valores de densidade óptica descritos no protocolo de texto. Neste estudo, o teste ELISA in vitro é utilizado para avaliar a potência da vacina antirrábica. Valores de densidade óptica representativos de um experimento típico são mostrados aqui.Esses valores são utilizados para desenhar a curva de vacina de referência, traçando a densidade óptica média para as diferentes diluições da vacina de referência no eixo vertical e a concentração da glicoproteína no eixo horizontal. O teor de glicoproteína da vacina testada é então estimado usando esta curva. A avaliação é precisa para diluições que tenham um valor médio de densidade óptica na área do forro da curva de vacina de referência.Levando-se em conta a diluição de um a 40, a projeção vertical de OD 1534 no eixo x corresponde a 500 nanogramas por mililitro. Assim, a vacina testada é estimada em 20 microgramas por mililitro de glicoproteína. Quando a potência in vitro é estabelecida, é necessário comparar a vacina testada com a referência de seis padrões internacionais da OMS calibrados em unidades internacionais.O mesmo método pode ser usado com outros anticorpos para ampliar a detecção de mais cepas de vacinas, incluindo aquelas usadas em vacinas veterinárias que são classicamente mais variáveis. Anticorpos também podem ser usados na competição para titulação de anticorpos antirrábios em equinos ou soro humano. Precauções devem ser tomadas com vacinas que não estão inativadas ou com vírus.Certifique-se de usar equipamentos de proteção individual, usar luvas e descontaminar tudo corretamente. Além disso, tenha cuidado com comprimidos de como são cancerígenos e com a solução de hipoclorito de sódio ácido.

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