Name: in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency
Uploaded: 2020-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency at JoVE.com

Д-р Сильви Моржо и д-р Jean-Michel Chapsal должны быть признаны за их ключевое участие в создании анализа ELISA по вакцинам партий и организовать международные семинары и совместные исследования. Мы благодарим Сабрину Кали за критическое прочтение рукописи. Д-р Пьер Перрен отвечал за изоляцию и характеристику mAb-D1. Эта работа в основном поддерживается за счет средств Института Пастера.

1. Меры предосторожности
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод применим как к живой RABV, так и к инактивированной вакцине.
<ol><li>Используйте хорошие лабораторные процедуры и процедуры безопасности.</li>
	<li>Носите адекватное оборудование для личной защиты (PPE), включая одноразовое пальто, пе...

Эпитоп, признанный mAb-D1, находится в антигенном участке III гликопротеина RABV, который является не только иммунодоминирующим для индукции VNAbs, но и участвует в нейровирулении, патогенности40,41 и распознавании рецепторов42. Существует еще один важ...

С более чем 50 лет, тест NIH1 используется в качестве золотого стандарта метод для оценки потенции вакцины против бешенства до выпуска партии. Этот тест состоит из интраперитонеальной иммунизации групп мышей с вакциной, которая должна быть протестирована с последующим внутримозговой (IC) вызов 14 дней спустя с Challenge Virus Standard (CVS) штамм вируса бешенства (RABV). Потенция оценивается по доле мышей, переживших вызов IC. Хотя ВОЗ2 и Европейская Фармакопея3 по-прежнему требуют теста NIH для оценки потенции вакцины, этот тест страдает от нескольких препятствий: результаты весьма изменчивы4; инфекционные RABV используется во время вызова, и это требует как технические навыки и строгие меры биобезопасности; большое количество животных используются, и тяжесть проблемы вызывает серьезные этические проблемы5. Менее серьезные изменения этого теста была разработана: через две недели после внутриперитонеальной иммунизации, мышей не оспаривается IC, но кровь и испытания на наличие конкретных RABV нейтрализующих антител (VNAbs) в сыворотке крови с помощью теста на нейтрализацию in vitro. Тем не менее, этот тест по-прежнему требует жертвования большое количество лабораторных мышей, хотя он уже используется для ветеринарных вакцин6,7 и был рассмотрен для человекавакцины 8.
В настоящее время как международные9, так и европейские10 рекомендаций поощряют производителей и национальные лаборатории контроля (Official Medicine Control Laboratories - OMCLs) к внедрению замены, сокращения и уточнения лабораторных испытаний на животных, именуемых стратегией 3Rs. Европейская директива 2010/63/EU (действует с 2013/01/01), касающаяся защиты и благополучия животных, также усилила ограничения для производителей вакцин и лабораторий, участвующих в контроле качества вакцин против бешенства, а также в исследованиях бешенства11. В результате этого разработка, проверка и использование альтернативных подходов in vitro стали в настоящее время приоритетными. Это не только этически обоснованные, но и могут также сократить расходы на пакетное тестирование и сократить время для результатов до часов, а не недель3.
На поверхности частицы RABV гликопротеин принимает тримерическую форму12,,13,,14,,15,,16. В вакцине против бешенства, эта родная форма тримерической представляет собой основной иммуноген индуцирования VNAbs17 в то время как мономерные, растворимые или денатурированные гликопротеины плохо иммуногенных18,19. Таким образом, сохранение тримеров гликопротеина в процессе производства вакцины является хорошим показателем сохранения оптимального иммуногенного потенциала. Несколько иммунохимических методов, таких как антитела-связывающий-тест20,21, один радиальный иммунодиффузии (SRD) тест22 и тест ELISA23,24,25,26,27 рекомендованы ВОЗ Технический доклад серии2 и европейской монографии3 для количественной оценки содержания антигена в вакцинах против бешенства.26 Они используются производителями для мониторинга согласованности производства вакцин и OMCL для оценки последовательной формулировки партий вакцин для человека28, даже если тест NIH по-прежнему рассматривается для потенции.
Однако все эти иммунохимические методы не являются эквивалентными. Тест SRD требует предварительной обработки, которая может изменить мембранно-якорные тримеры и привести к растворимым или денатурированной форме гликопротеина22,29. Таким образом, SRD не очень эффективно в дискриминации между иммуногенными и неиммуногенных гликопротеинов в результате несовершенной оценки иммуногенности вакцины много. В отличие от этого, тест ELISA является более чувствительным22, сохраняет родную структуру гликопротеина, и более подходит для определения содержания родной сложенные тримеры гликопротеина. Тест ELISA может использовать либо поликлональные поликлональные или мыши моноклональные антигликопротеиновые антитела очищены или концентрированы с сульфатом аммония. Исследования показали хорошее соответствие между тестом NIH и содержанием антигена, оцененным ELISA в вакцинах, и пришли к выводу, что методы ELISA подходят для теста на пробирку. Это выступает за то, что тесты ELISA могут по крайней мере дополнить или даже заменить тест NIH4,26,,27,30,31,32,33. Сегодня Европейская Фармакопея рекомендует использовать проверенные серологические или иммунохимические анализы в качестве альтернативы тесту NIH3. Полное избегание использования животных для вакцины потенции стала реалистичной точки зрения.
Метод, представленный ниже, основан на косвенном иммунозахвате сэндвича ELISA с помощью клона моноклонального антитела мыши (mAb-D1), который распознает антигенные участки III (aa 330 до 338) тримерного гликопротеина RABV15,34. Этот метод был разработан первоначально в ИнститутеПастера 26,30 затем оптимизированы и проверены ВАГении Посев де Медурат дю Медудемент и де produits де Санте (ANSM) лаборатории, т.е. французский OMCL4,33. mAb-D1 используется как для сенсибилизации пластины, так и для обнаружения захваченного антигена. Это позволяет проводить конкретную количественную оценку тримеров гликопротеинов, т.е. иммуногенного антигена RABV. mAb-D1, используемый для обнаружения, маркируется пероксидазой, которая раскрывается в присутствии субстрата и хромогена. Сравнение абсорбции, измеренной для испытанной вакцины и эталонной вакцины, позволяет определить содержание иммуногенного гликопротеина. Следует отметить, что один и тот же тип анализ может быть применен для различных mAbs признавая различные антигенные участки ГЛИкопротеина RABV35. Метод получения и очистки или концентрации с аммонием сульфат анти-гликопротеин поликлональных кролика иммуноглобулины G (IgG) или моноклональные мышки глобулины были широко описаны ранее36 вместе с методом сопряжения антител с пероксидазы37.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1523px;" width="1522">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:340px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">10445753</td>
			<td style="width:456px;">if titrating live virus</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:465px;">Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 &#181;L, MAXISORP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>439454</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:85px;width:465px;">Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12576606</td>
			<td>for the preparation of sulfuric acid</td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:113px;width:465px;">Immunology Plate Strong 
			Adsorption MAXISORP Flat Bottom 
			Well F96</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>55303</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate Sealing Tape(100 sheets)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate&#160; single mode reader Sunrise</td>
			<td style="width:340px;">TECAN</td>
			<td style="width:262px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate shaker-incubator</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>441504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate washer Wellwash</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5165000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:465px;">Multichannel pipette (30-300 &#181;L) 12 channels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">4661180N</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:104px;width:465px;">Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 &#956;L micro, 2-20 &#956;L, 20-200 &#956;L &#38; 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4700880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency

Растущая глобальная забота о благополучии животных поощряет производителей и Национальные контрольные лаборатории (OMCLs) следовать стратегии 3Rs по замене, сокращению и уточнению лабораторных испытаний на животных. Разработка подходов в пробирке рекомендуется на уровне ВОЗ и Европы в качестве альтернативы тесту NIH для оценки потенции вакцины против бешенства. На поверхности частиц вируса бешенства (RABV) тримы гликопротеина являются основным иммуногеном, вызывающим вирусные нейтрализующие антитела (VNAbs). Тест ELISA, где нейтрализующие моноклональные антитела (mAb-D1) распознают тримеральную форму гликопротеина, был разработан для определения содержания родного сложенного тримерного гликопротеина наряду с производством партий вакцины. Этот тест на пробирку продемонстрировал хорошее соответствие с тестом NIH и был признан подходящим в совместных испытаниях производителями вакцин RABV и OMCLs. Предотвращение использования животных является достижимой целью в ближайшем будущем.
Представленный метод основан на косвенном иммунозахвате сэндвича ELISA с использованием mAb-D1, который распознает антигенные участки III (aa 330 до 338) тримерного гликопротеина RABV, т.е. иммуногенного rabV. mAb-D1 используется как для покрытия, так и для обнаружения тримеров гликопротеинов, присутствующих в партии вакцины. Так как эпитоп распознается из-за его конформационных свойств, потенциально денатурированный гликопротеин (менее иммуногенный) не может быть захвачен и обнаружен mAb-D1. Вакцина, которая будет протестирована инкубируется в пластине сенсибилизированы с mAb-D1. Связанные тримерные гликопротеины RABV идентифицируются путем добавления mAb-D1 снова, помечены пероксидаза, а затем выявлены в присутствии субстрата и хромогена. Сравнение абсорбции, измеренной для испытанной вакцины и эталонной вакцины, позволяет определить содержание иммуногенного гликопротеина.

В следующем примере используется эталонная вакцина Lot 09, состоящая из очищенных инактивированных частиц вируса бешенства (pV-вакцина. Содержание гликопротеинов (10 мкг/мл) в этом виде было установлено после определения общего количества вирусных белков (тест BCA) и оценки...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency at JoVE.com

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Здесь мы описываем непрямой иммунозахват сэндвича ELISA для определения иммуногенного содержания гликопротеинов в вакцинах против бешенства. Этот тест использует нейтрализующее моноклональные антитела (mAb-D1), распознавающее тримеры гликопротеина. Это альтернатива тесту in vivo NIH, чтобы следить за согласованностью потенции вакцин во время производства.

В Vitro ELISA тест для оценки бешенства вакцины потенции

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

В связи с сокращением тестирования на животных и изменчивостью теста NH ВОЗ рекомендует разработать подходы в пробирке для оценки потенции вакцины против бешенства. Этот тест ELISA показывает хорошее согласие с классическим тестом NH в признании иммуногенной формы гликопротеина, показывает высокую чувствительность, и может быть выполнен в течение одного дня. Оценка потенции вакцины против бешенства в пробирке ELISA является альтернативой тесту In vivo NH.Он продвигается производителями и национальными лабораториями контроля. Очень важно распределить предварительно размера объемов в дубликат для каждого разбавления и хорошо высушить пластину на абсорбирующим бумаге после моет, чтобы избежать, чтобы начать эту процедуру, надеть адекватное оборудование личной защиты, включая одноразовые пальто, перчатки, маски и очки. Лечить загрязненные материалы, погружая его в раствор 2,6% гипохлорита натрия в течение 30 минут для обеззараживания.Затем установите 96-хорошо иммуноанализной пластины и добавить 200 микролитров моноклональных антител, разбавленных в карбонат буфера для каждой хорошо. Обложка пластины с клейкой пленкой и инкубировать микроплюрат при 37 градусов по Цельсию в течение трех часов во влажной среде. Затем тщательно аспирировать и передать содержимое хорошо в получателя, содержащего раствор 2,6% гипохлорита натрия.Переверните микроплотину и дайте ей высохнуть на абсорбющей бумаге при комнатной температуре в течение пяти минут. Во-первых, добавьте 300 микролитров буфера пассивации к каждой колодец. Накройте пластину клейкой пленкой и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут.После этого перенесите содержимое колодец в раствор 2,6% гипохлорита натрия. Чтобы вымыть тарелку, добавьте 300 микролитров стирального буфера к каждому хорошо. Затем аспирировать тщательно и передать содержимое колодец в получателя, содержащего раствор 2,6% гипохлорита натрия.Повторите этот процесс стирки еще пять раз, чтобы тщательно вымыть сенсибилизированную тарелку. После этого переверните микропластить и дайте ему высохнуть на куске абсорбянтной бумаги при комнатной температуре в течение одной минуты. Восстановить эталонную вакцину в одном миллилитре дистиллированной воды таким образом, чтобы окончательная концентрация вируса бешенства гликопротеина составляет 10 микрограмм на миллилитр.Подготовка 10-кратного разбавления восстановленной эталонной вакцины в разбавлении для достижения концентрации гликопротеина вируса бешенства в один микрограмм на миллилитр. Далее выполните шесть серийных двукратных разбавления этой эталонной вакцины в разбавлении, изложенном в таблице одного из текстовых протоколов. Распространение 200 микролитров разбавляя в дублирующих скважинах в качестве слепого контроля и 200 микролитров на скважину для каждого эталонного разбавления вакцины в дубликате.Затем подготовьте 10-кратное разбавление тестуемой вакцины в разбавлении и подготовьте семь двукратных серийных разбавлений испытанной вакцины разбавлением, как указано во второй таблице текстового протокола. Распространение 200 микролитров каждой испытанной вакцины разбавления в дубликат к каждой колодец микроплюта. Обложка микроплюрат с клейкой пленкой и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа.После этого снимите пленку. Аспирировать тщательно и передать содержимое каждого хорошо в получателя, содержащего 2,7% гипохлорита натрия раствор. Чтобы вымыть пластину, добавьте 300 микролитров стирального буфера к каждой хорошо, аспирировать тщательно и передать содержимое каждого хорошо в получателя, содержащего 2,6% гипохлорита натрия раствор.Повторите процесс стирки еще пять раз, чтобы удалить несвегаемый антиген и сохранить G-белковые тримеры, связанные с покрытым антителом. Переверните промытую микроплюй и дайте ей высохнуть на куске абсорбянтной бумаги при комнатной температуре в течение одной минуты. Затем распределите 200 микролитров рекомендуемого разбавления пероксидазы помечены моноклональным антителом D1 в разбавлении каждой хорошо.Обложка микроплюрат с клейкой пленкой и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа. Затем удалите пленку, аспирировать тщательно, и передать содержимое каждого хорошо в получателя, содержащего 2,6% гипохлорита натрия раствор. Для мытья микроплюта добавьте в каждую колодец 300 микролитров стирального буфера.Аспирировать тщательно и передать содержимое каждого хорошо в получателя, содержащего 2,6% гипохлорита натрия раствор. Повторите этот процесс стирки еще пять раз, чтобы удалить несвехую пероксидаза помечены антитела. Переверните промытую микроплюй и дайте ей высохнуть на куске абсорбянтной бумаги при комнатной температуре в течение одной минуты.Затем распределим по 200 микролитров субстратно-хромогенного раствора в каждую колодец. Запечатать микроплюй с пленкой и инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. Затем добавьте 50 микролитров раствора остановки в каждый колодец, чтобы остановить реакцию.Аккуратно протрите дно микроплюта и поместите его в спектрофотометр. Определите оптическую плотность на уровне 492 нанометров для всех используемых скважин. Соберите эти данные в файле электронной таблицы для анализа.После этого создайте участки как для кривой эталонной вакцины, так и для значений оптической плотности, изложенных в текстовом протоколе. В этом исследовании, тест in vitro ELISA используется для оценки потенции вакцины против бешенства. Здесь показаны репрезентативные оптические значения плотности из типичного эксперимента.Эти значения используются для построения эталонной кривой вакцины путем построения средней оптической плотности для различных разбавлений эталонной вакцины на вертикальной оси и концентрации гликопротеина на горизонтальной оси. Содержание гликопротеина в тестуемой вакцине затем оценивается с помощью этой кривой. Оценка точна для разбавления, которые имеют среднее значение оптической плотности в области лайнера кривой эталонной вакцины.С учетом разбавления от одного до 40 вертикальная проекция OD 1534 на х-оси соответствует 500 нанограммам на миллилитр. Таким образом, протестированная вакцина оценивается в 20 микрограмм на миллилитр гликопротеина. При установке потенции in vitro необходимо сравнить испытанную вакцину со ссылкой на шесть международных стандартов ВОЗ, откалиброванных в международных подразделениях.Тот же метод может быть использован с другими антителами, чтобы увеличить обнаружение большего количество штаммов вакцин, включая те, которые используются в ветеринарных вакцинах, которые классически более изменчивы. Антитела также могут быть использованы в конкуренции за титрован антирабии антител в конной или человеческой сыворотке. Меры предосторожности должны быть приняты с вакцинами, которые не инактивированы или с вирусами.Обязательно используйте средства индивидуальной защиты, носите перчатки и обеззараживать все должным образом. Кроме того, будьте осторожны с таблетками, поскольку они являются канцерогенными и с кислым раствором гипохлорита натрия.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Человеческий Т-лимфоцитов изоляции, культуры и анализ миграции In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Рестриктазой основе Клонирование метод оценки<em&gt; В пробирке</em&gt; Репликация Емкость ВИЧ-1 подтипа С Gag-MJ4 химерных вирусов

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro анализ MyD88-опосредованной клеточного иммунного ответа на вирус Западного Нила мутантный штамм инфекции

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Изображение на основе проточной цитометрии Методика оценки изменений в Гранулоцита функции<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Роман в Vitro раны исцеления Assay для оценки миграции клеток

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Улучшенное наблюдение за бешенством с помощью прямого быстрого иммуногистохимического теста

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Resource-Limited Settings with Further Molecular Applications

Полевой посмертный бешенство Быстрый иммунохроматографический диагностический тест для ресурсно-ограниченных настроек с дальнейшим молекулярным применением

Functional rabies surveillance systems are crucial to provide reliable data and increase the political commitment necessary for disease control. To date, ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Иммуногистохимический тест для обнаружения лиссавирусного антигена из формалин-фиксированных тканей

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

Opsono-Adherence Assay для оценки функциональных антител в разработке вакцин против bacillus anthracis и других инкапсулированных патогенов

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Очистка и расширение мышечных инвариантных естественных Т-киллеров для исследований in vitro и in vivo

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...