Name: in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency
Uploaded: 2020-05-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency at JoVE.com

Dr Sylvie Morgeaux och Dr Jean-Michel Chapsal måste erkännas för deras viktigaste deltagande för att upprätta ELISA analys på vaccin partier och att organisera internationella workshops och samarbetsstudier. Vi tackar Sabrina Kali för kritisk läsning av manuskriptet. Dr Pierre Perrin var ansvarig för isolering och karakterisering av mAb-D1. Detta arbete har huvudsakligen fått stöd av Institut Pasteur-finansieringen.

1. Säkerhetsåtgärder
OBS: Denna metod är tillämplig på både levande RABV och inaktiverat vaccin.
<ol><li>Använd god laboratoriesed och säkerhetsrutiner.</li>
	<li>Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) inklusive engångsrock, handskar, mask, glasögon etc.</li>
	<li>När det levande viruset titreras, använd ett biologiskt säkerhetsskåp av klass II.<ol>
<li>Betrakta allt material som kommer i kontakt med proverna (reagenser, tvättlösningar etc.) som infektiöst materi...

Epitopet som erkänns av mAb-D1 ligger i det antigena området III av RABV glykoprotein som inte bara är immun-dominerande för induktion av VNAbs men också deltar i neurovirulens, patogenicitet40,41 och receptorerkännande42. Det finns en annan viktig antigen plats längs glykoprotein, plats II43, mot vilken flera MAbs har isolerats såsom mAb-WI-111235. Dessa kan också användas i liknan...

Sedan mer än 50 år används NIH-testet1 som en guldstandardmetod för att utvärdera rabiesvaccinpotensen innan partiet släpps ut. Detta test består av en intraperitoneal immunisering av grupper av möss med det vaccin som ska testas följt av en intra-cerebral (IC) utmaning 14 dagar senare med Challenge Virus Standard (CVS) stam av rabiesvirus (RABV). Styrkan utvärderas från andelen möss som överlever IC-utmaningen. Även om WHO2 och European Pharmacopeia3 fortfarande kräver NIH-testet för att bedöma vaccinets styrka, lider detta test av flera hinder: resultaten är mycket varierande4; Infektiös RABV används under utmaningen och detta kräver både teknisk skicklighet och stränga åtgärder för biosäkerhet. ett stort antal djur används, och utmaningens allvar ger upphov till allvarliga etiska betänkligheter5. En mindre allvarlig variation av detta test har utvecklats: två veckor efter den intra peritoneala immuniseringen utmanas möss inte av IC utan avblodas och testas för förekomst av specifika RABV-neutraliserande antikroppar (VNAbs) i serumet med hjälp av ett in vitro-neutraliseringstest. Detta test kräver dock fortfarande att man offrar ett stort antal laboratoriemöss även om det redan används för veterinärmedicinskavaccinerna 6,,7 och har övervägts för humanvaccin8.
Från och med nu, både International9 och Europeiska10 rekommendationer uppmuntra tillverkare och nationella kontrolllaboratorier (officiella laboratorier för medicin kontroll - OMCLs) att genomföra ersättning, minskning och förfining av laboratoriedjur testning, kallad 3Rs strategi. Eu-direktiv 2010/63/EU (som varit i kraft sedan 2013/01/01) om djurskydd och djurskydd har också förstärkt de begränsningar för vaccintillverkare och laboratorier som deltar i kvalitetskontrollen av rabiesvacciner samt rabiesforskning11. Som ett resultat av detta har utvecklingen, valideringen och användningen av alternativa in vitro-metoder nu blivit en prioritet. Dessa är inte bara etiskt sunda men kan också minska partiets testkostnader och förkorta tiden för resultat till timmar istället för vecka3.
På ytan av RABV partikel, glykoprotein antar en trimeric form12,13,14,15,16. I rabies vaccin, denna inhemska trimeric form utgör de viktigaste immunogen inducera VNAbs17 medan monomeric, lösliga eller denaturerade glykoproteiner är dåligt immunogenic18,19. Således är bevarandet av trimers av glykoproteinet längs vaccinproduktionsprocessen en bra indikator för bevarandet av en optimal immunogen potential. Flera immunokemiska metoder, såsom antikroppsbindningstestet20,21, test22 av en radiell immundiffusion (SRD) och ELISA-testet23,,24,,25,26,27 rekommenderas av WHO:s tekniska rapport serie2 och den europeiska monografin3 för att kvantifiera antigenhalten i rabiesvacciner. Dessa används av tillverkarna för att övervaka konsekvensen i vaccinproduktionen och av OMCL för att bedöma den konsekventa formuleringen av partier avhumanvacciner 28, även om NIH-testet fortfarande övervägs för styrkan.
Emellertid, alla dessa immunokemiska metoder är inte likvärdiga. SRD-testet kräver en förbehandling som kan förändra de membranförankrade trimers och resultera i en löslig eller denaturerad form av glykoproteinet22,29. Därför är SRD inte mycket effektivt när det gäller att diskriminera mellan immunogena och icke-immunogena glykoproteiner som resulterar i en ofullständig bedömning av immunogeniciteten hos ett vaccinparti. Däremot är ELISA-testet känsligare22, bevarar glykoproteinets ursprungliga struktur och är lämpligare för att bestämma innehållet i de inbyggda vikta trimersna av glykoprotein. ELISA-testet kan använda antingen kaninpolyklonala eller mus monoklonala anti-glykoproteinantikroppar som renats eller koncentrerats med ammoniumsulfat. Studier har visat god överensstämmelse mellan NIH-testet och det antigeninnehåll som utvärderats av ELISA i vacciner och kommit fram till att ELISA-metoderna är lämpliga för in vitro-potenstestet. Detta förespråkar att ELISA-tester åtminstone kan komplettera eller till och med ersätta NIH-testet4,,26,,27,,30,,31,,32,33. I dag rekommenderar Europeiska farmakopén användning av validerade serologiska eller immunokemiska analyser som alternativ till NIH-testet3. Det fullständiga undvikandet av djuranvändning för vaccinpotens har blivit ett realistiskt perspektiv.
Den metod som presenteras nedan är baserad på en indirekt ELISA sandwich immunocapture med hjälp av en mus monoklonal antikropp klon (mAb-D1) som känner igen antigena platser III (aa 330 till 338) av trimeric RABV glykoprotein15,34. Denna metod utvecklades ursprungligen vid Institut Pasteur26,30 sedan optimeras och valideras av Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) laboratorium, dvs den franska OMCL4,33. MAb-D1 används både för att sensibilisera plattan och därefter för att upptäcka det fångade antigenet. Detta möjliggör specifik kvantifiering av glykoproteintrimmarna, dvs det immunogena RABV-antigenet. Den mAb-D1 som används för detektion är märkt med peroxidas, vilket avslöjas i närvaro av substratet och chromogen. En jämförelse av den absorbans som uppmätts för det testade vaccinet och referensvaccinet gör det möjligt att fastställa den immunogena glykoproteinhalten. Det är att notera att samma typ av analys kan tillämpas för olika mAbs erkänner olika antigena platser av RABV glykoprotein35. Metoden för att erhålla och rena eller koncentrera med ammoniumsulfat anti-glykoprotein polyklonanal kanin immunglobuliner G (IgG) eller monoklonala musglobuliner har beskrivits utförligt tidigare36 tillsammans med metoden att konjugate antikroppar med peroxidas37.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1523px;" width="1522">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Class II Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:340px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">10445753</td>
			<td style="width:456px;">if titrating live virus</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:465px;">Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 &#181;L, MAXISORP</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>439454</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:85px;width:465px;">Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12576606</td>
			<td>for the preparation of sulfuric acid</td>
		</tr>
		<tr height="112">
			<td height="112" style="height:113px;width:465px;">Immunology Plate Strong 
			Adsorption MAXISORP Flat Bottom 
			Well F96</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>55303</td>
			<td>good for binding to the loaded antibody</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate Sealing Tape(100 sheets)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate&#160; single mode reader Sunrise</td>
			<td style="width:340px;">TECAN</td>
			<td style="width:262px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Microplate shaker-incubator</td>
			<td style="width:340px;">Dutscher</td>
			<td>441504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:465px;">Microplate washer Wellwash</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5165000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:63px;width:465px;">Multichannel pipette (30-300 &#181;L) 12 channels</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:262px;">4661180N</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:104px;width:465px;">Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 &#956;L micro, 2-20 &#956;L, 20-200 &#956;L &#38; 100-1000 &#956;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4700880</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro elisa test to evaluate rabies vaccine potency

Den växande globala oron för djurens välbefinnande uppmuntrar tillverkare och nationella kontrolllaboratorier att följa 3R-strategin för ersättning, minskning och förfining av laboratoriedjursförsök. Utveckling av in vitro-metoder rekommenderas på WHO-nivå och europeisk nivå som alternativ till NIH-testet för utvärdering av rabiesvaccinpotensen. På ytan av rabiesvirus (RABV) partikel, trimers av glykoprotein utgör de viktigaste immunogen att inducera viral neutraliserande antikroppar (VNAbs). Ett ELISA-test, där neutraliserande monoklonala antikroppar (mAb-D1) känner igen den trimeriska formen av glykoproteinet, har utvecklats för att bestämma innehållet i det inbyggda vikta trimeric glykoproteinet tillsammans med produktionen av vaccinsatserna. Detta in vitro-potenstest visade en god överensstämmelse med NIH-testet och har befunnits lämpligt i samarbetsstudier av RABV vaccintillverkare och OMCLs. Undvikande av djuranvändning är ett uppnåeligt mål inom en snar framtid.
Den metod som presenteras är baserad på en indirekt ELISA sandwich immunocapture med hjälp av mAb-D1 som erkänner antigena platser III (aa 330 till 338) av trimeric RABV glykoprotein, dvs immunogenic RABV antigen. mAb-D1 används för både beläggning och detektion av glykoproteintrimmer som finns i vaccinpartiet. Eftersom epitopet är erkänt på grund av dess konformationsegenskaper, kan det potentiellt denaturerade glykoproteinet (mindre immunogent) inte fångas upp och detekteras av mAb-D1. Vaccinet som ska testas inkuberas i en plattsensibiliserad med mAb-D1. Bundna trimeric RABV glykoproteiner identifieras genom att lägga till mAb-D1 igen, märkt med peroxidas och sedan avslöjas i närvaro av substrat och chromogen. En jämförelse av den absorbans som uppmätts för det testade vaccinet och referensvaccinet gör det möjligt att fastställa den immunogena glykoproteinhalten.

I följande exempel används referensvaccinet Lot 09, bestående av renade inaktiverade rabiesviruspartiklar (PV-vaccinstam). Glykoproteintrimmers (10 μg/ml) i detta har fastställts efter bestämning av den totala mängden virusproteiner (BCA-test) och utvärdering av procentandelen av glykoproteinet av SDS-polyarylamidgelelektrofores. Alternativt kan ett kalibrerat referensvaccin, t.ex.th
Tabell 3 ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency at JoVE.com

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Här beskriver vi en indirekt ELISA sandwich immunocapture att bestämma immunogenic glykoprotein innehållet i rabies vacciner. Detta test använder en neutraliserande monoklonal antikropp (mAb-D1) som känner igen glykoproteintrimmers. Det är ett alternativ till in vivo NIH-testet att följa konsistensen av vaccinpotens under produktionen.

In Vitro ELISA Test för att utvärdera rabiesvaccin potens

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

I syfte att minska djurförsök och på grund av variabiliteten i NH-testet, uppmuntrar WHO att utveckla in vitro-metoder för utvärdering av rabiesvaccinpotens. Detta ELISA-test visar en god konkordans med ett klassiskt NH-test i att känna igen den immunogena formen av glykoproteinet, visar en hög känslighet, och kan utföras inom endast en dag. Utvärdering av rabiesvaccinpotens in vitro genom ELISA är ett alternativ till testet in vivo NH.Det främjas av producenterna och medborgare kontrollerar laboratorium. Det är viktigt att distribuera förstora volymer i två exemplar för varje utspädning och att väl torka plattan på absorberande papper efter tvättar för att undvika Att börja detta förfarande, sätta på tillräcklig personlig skyddsutrustning inklusive engångsrock, handskar, mask och glasögon. Behandla de förorenade materialen genom att fördjupa det i en lösning på 2,6%natriumhypoklorit i 30 minuter för sanering.Därefter anges en 96-väl immunoassay platta och tillsätt 200 mikroliter av monoklonala antikroppen utspädd i karbonat buffert till varje brunn. Täck plattan med självhäftande film och inkubera mikroplattan vid 37 grader Celsius i tre timmar i en fuktad miljö. Därefter försiktigt aspirera och överföra brunnsinnehållet till en mottagare som innehåller en lösning på 2,6%natriumhypoklorit.Invertera mikroplattan och låt den torka på absorberande papper i rumstemperatur i fem minuter. Först, tillsätt 300 mikroliter av passivation buffert till varje brunn. Täck plattan med självhäftande film och inkubera i 37 grader Celsius i 30 minuter.Efter detta överför innehållet i brunnen till en som innehåller en lösning av 2,6%natriumhypoklorit. För att tvätta plattan, tillsätt 300 mikroliter av tvättbufferten till varje brunn. Därefter aspirera försiktigt och överföra brunnsinnehållet till en mottagare som innehåller en lösning på 2,6%natriumhypoklorit.Upprepa denna tvättprocess fem gånger till för att i stor utsträckning tvätta den sensibiliserade plattan. Efter detta, invertera mikroplattan och låt den torka på en bit absorberande papper i rumstemperatur i en minut. Rekonstruera referensvaccinet i en milliliter destillerat vatten så att den slutliga koncentrationen av rabiesvirus glykoprotein är 10 mikrogram per milliliter.Bered en 10-faldig utspädning av det rekonstituerade referensvaccinet i spädningsvätskan för att nå en rabiesvirus glykoproteinkoncentration på ett mikrogram per milliliter. Därefter utför sex seriell tvåfaldiga utspädningar av detta referensvaccin i spädningsvätskan som beskrivs i tabell ett av textprotokollet. Fördela 200 mikroliter av spädningsvätskan i dubbla brunnar för att fungera som en blindkontroll och 200 mikroliter per brunn för varje referensvaccinutspädning i duplicering.Förbered sedan en 10-faldig utspädning av det testade vaccinet i spädningsvätskan och förbered sju tvåfaldiga serieutspädningar av det testade vaccinet i spädningsvätska enligt skiss i tabell två i textprotokollet. Fördela 200 mikroliter av varje testad vaccinutspädning i duplikat till varje brunn av mikroplattan. Täck mikroplattan med självhäftande film och inkubera i 37 grader Celsius i en timme.Efter detta, ta bort filmen. Aspirera försiktigt och överföra innehållet i varje brunn i en mottagare som innehåller en 2,7%natriumhypokloritlösning. För att tvätta plattan, tillsätt 300 mikroliter av tvättbuffert till varje brunn, aspirera noggrant och överföra innehållet i varje brunn i en mottagare som innehåller en 2,6%natriumhypokloritlösning.Upprepa tvättprocessen ytterligare fem gånger för att ta bort det obundna antigenet och bevara G-proteintrikare som är bundna till den belagda antikroppen. Invertera den tvättade mikroplattan och låt den torka på en bit absorberande papper i rumstemperatur i en minut. Sedan distribuera 200 mikroliter av den rekommenderade utspädning av peroxidas märkt D1 monoklonal antikropp i spädningsvätska till varje brunn.Täck mikroplattan med självhäftande film och inkubera i 37 grader Celsius i en timme. Därefter ta bort filmen, aspirera noggrant, och överföra innehållet i varje brunn i en mottagare som innehåller en 2,6%natriumhypokloritlösning. För att tvätta mikroplattan, tillsätt 300 mikroliter av tvättbuffert till varje brunn.Aspirera försiktigt och överföra innehållet i varje brunn till en mottagare som innehåller 2,6%natriumhypokloritlösning. Upprepa denna tvättprocess fem gånger till för att avlägsna den obundna peroxidasmärkta antikroppen. Invertera den tvättade mikroplattan och låt den torka på en bit absorberande papper i rumstemperatur i en minut.Därefter distribuera 200 mikroliter av substrat-chromogen lösning i varje brunn. Täta mikroplattan med film och inkubera i rumstemperatur i mörker i 30 minuter. Tillsätt sedan 50 mikroliter av stopplösning i varje brunn för att stoppa reaktionen.Torka försiktigt av mikroplattans botten och placera den i spektrofotometern. Bestäm den optiska densiteten vid 492 nanometer för alla de brunnar som används. Samla in dessa data i en kalkylbladsfil för analys.Efter detta skapar du tomter för både referensvaccinkurvan och de optiska densitetsvärdena som de skisseras i textprotokollet. I denna studie används ELISA-testet in vitro för att utvärdera rabiesvaccinpotens. Representativa optiska densitetsvärden från ett typiskt experiment visas här.Dessa värden används för att rita referensvaccinkurvan genom att den genomsnittliga optiska densiteten för referensvaccinens olika utspädningar på den vertikala axeln och koncentrationen av glykoproteinet ritas upp på den horisontella axeln. Glykoproteinhalten i det testade vaccinet uppskattas sedan med hjälp av denna kurva. Utvärderingen är exakt för utspädningar som har ett medelvärde för optisk densitet i referensvaccinkurvans linjeområde.Med hänsyn till utspädningen av en-till-40 motsvarar den vertikala projektionen av OD 1534 på x-axeln 500 nanogram per milliliter. Så det testade vaccinet uppskattas till 20 mikrogram per milliliter glykoprotein. När in vitro-styrkan är etablerad är det nödvändigt att jämföra det testade vaccinet med referens sex AV WHO:s internationella standard som kalibrerats i internationella enheter.Samma metod kan användas tillsammans med andra antikroppar för att förstora detektion av fler vaccinstammar inklusive sådana som används i veterinärvacciner och som är klassiskt mer varierande. Antikroppar kan också användas i konkurrens för titrering av antirabies antikroppar i häst eller humant serum. Försiktighetsåtgärder måste vidtas med vacciner som inte är inaktiverade eller med virus.Var noga med att använda personlig skyddsutrustning, använd handskar och sanera allt ordentligt. Var också försiktig med tabletter av eftersom de är cancerframkallande och med den sura natriumhypokloritlösningen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Humana T-lymfocyter Isolering, Kultur och analys av migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Ett restriktionsenzym Based Kloning metod för att bedöma<em&gt; In vitro</em&gt; Replikering Kapacitet på HIV-1 subtyp C Gag-MJ4 Chimära virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In vitro Analys av MyD88-medierad cellulärt immunsvar till West Nile-virus mutant stam Infektion

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Bild-baserade flödescytometri Technique att utvärdera förändringar i Granulocyt Funktion<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

En roman In Vitro Wound Healing analys för att utvärdera cellmigration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Förbättrad rabies övervakning med hjälp av en direkt snabb immunohistokemisk test

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Resource-Limited Settings with Further Molecular Applications

Fält Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test för resursbegränsade inställningar med ytterligare molekylära tillämpningar

Functional rabies surveillance systems are crucial to provide reliable data and increase the political commitment necessary for disease control. To date, ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Immunohistokemitest för lyssavirusantigendetektering från formalin-fasta vävnader

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

Opsono-adherence assay för att utvärdera funktionella antikroppar i vaccinutveckling mot Bacillus anthracis och andra inkapslade patogener

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Rening och expansion av Musinvarianta naturliga killer T-celler för in vitro- och in vivo-studier

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...