Name: implantation of an isoproterenol mini-pump to induce heart failure in mice
Uploaded: 2019-10-03T13:00:00
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Los autores reconocen a NIH K08 HL133491 por su apoyo a la financiación.

Este protocolo se adhiere a las directrices de cuidado animal de la Universidad de California, Los Angeles (protocolo ARC #2010-075). Se aconseja a los lectores que se adhieran a su propio protocolo aprobado por la IACUC, ya que el cuidado del ratón periprocedimiento y la gestión de la analgesia pueden ser específicos de la institución.
1. Preparación de la bomba osmótica isoproterenol
NOTA: Este procedimiento se ha aplicado con éxito en ratones hembra de más ...

<ol>
	<li>Hartupee, J., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurohormonal+activation+in+heart+failure+with+reduced+ejection+fraction.">Neurohormonal activation in heart failure with reduced ejection fraction.</a> Nature Review Cardiology. 14 (1), 30-38 (2017).</li><li>Wang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Dissection+of+Cardiac+Remodeling+in+an+Isoproterenol-Induced+Heart+Failure+Mouse+Model.">Genetic Dissection of Cardiac Remodeling in an Isoproterenol-Induced Heart Failure Mouse Model.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006038 (2016).</li><li>Balakumar, P., Singh, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+beta-adrenergic+receptor+function+influences+myocardial+responses+to+isoproterenol+stimulation+in+mice.">Strain-dependent beta-adrenergic receptor function influences myocardial responses to isoproterenol stimulation in mice.</a> American Journal of Physiology-Heart Circulation Physiology. 289 (1), 30-36 (2005).</li><li>Zhang, G. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+oxidative+stress+in+acute+and+chronic+isoproterenol-infused+rats.">Cardiac oxidative stress in acute and chronic isoproterenol-infused rats.</a> Cardiovascular Research. 65 (1), 230-238 (2005).</li><li>Boluyt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoproterenol+infusion+induces+alterations+in+expression+of+hypertrophy-associated+genes+in+rat+heart.">Isoproterenol infusion induces alterations in expression of hypertrophy-associated genes in rat heart.</a> American Journal of Physiology. 269 (2), 638-647 (1995).</li><li>Hohimer, A. R., Davis, L. E., Hatton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+daily+injections+and+osmotic+pump+infusion+of+isoproterenol+cause+similar+increases+in+cardiac+mass+but+have+different+effects+on+blood+pressure.">Repeated daily injections and osmotic pump infusion of isoproterenol cause similar increases in cardiac mass but have different effects on blood pressure.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 83 (2), 191-197 (2005).</li><li>Cross, H. R., Murphy, E., Koch, W. J., Steenbergen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+mice+overexpressing+the+beta(2)-adrenergic+receptor+exhibit+differences+in+ischemia/reperfusion+injury:+role+of+nitric+oxide.">Male and female mice overexpressing the beta(2)-adrenergic receptor exhibit differences in ischemia/reperfusion injury: role of nitric oxide.</a> Cardiovascular Research. 53 (2), 662-671 (2002).</li><li>Klingman, G. I., McKay, G., Ward, A., Morse, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+isoproterenol+treatment+of+mice:+effects+on+catecholamines+and+rectal+temperature.">Chronic isoproterenol treatment of mice: effects on catecholamines and rectal temperature.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 62 (5), 798-801 (1973).</li></ol>

Hemos aplicado este método a más de 100 cepas de ratones endogámicos para evaluar los resultados cardíacos debido a la estimulación beta-adrenérica crónica2,13. Se sabe que existen diferencias significativas en la susceptibilidad al isoproterenol entre las cepas de ratón y pueden personalizarse para la cepa de interés según sea necesario16. Esto puede deberse a la variación en la función del receptor beta-adrenérgico entre las...

La insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida (HFrEF) va acompañada de una respuesta compensatoria bien reconocida del sistema nervioso simpático para mantener la homeostasis cardiovascular1. Estrés hemodinámico y efectos nocivos en el corazón y la circulación se observaron con activación crónica. Estos se han convertido en la piedra angular de la farmacoterapia contemporánea para la insuficiencia cardíaca y son mecanismos importantes en la progresión de la insuficiencia cardíaca y el antagonismo terapéutico de los sistemas neurohormonales1.
Hay varios modelos de ratón disponibles para investigaciones básicas de insuficiencia cardíaca. Los modelos genéticos son atractivos para explorar terapias moleculares e investigar las vías de señalización. Sin embargo, estos modelos pueden no ser relevantes para las formas comunes de insuficiencia cardíaca. Otros modelos comunes incluyen ligadura de la arteria descendente anterior izquierda (LAD), constricción transaortica (TAC) e isoproterenol (ISO), cada uno apuntando a una etiología patológica diferente2,3,4,5 ,6. La ligadura de la arteria LAD induce un infarto de miocardio de pared anterior creando así un modelo específico para la cardiomiopatía isquémica. TAC induce sobrecarga de presión aguda para crear un modelo hipertensivo de insuficiencia cardíaca. Aunque se puede medir el gradiente de presión, lo que permite la estratificación de la hipertrofia, la aparición aguda de la hipertensión carece de relevancia clínica directa4. Los modelos LAD y TAC requieren un alto nivel de experiencia quirúrgica para ejecutarse. El modelo ISO agudo de insuficiencia cardíaca imita la cardiomiopatía inducida por el estrés, también conocida como enfermedad de Takotsubo, que se caracteriza por un marcado aumento de las catecolaminas y la actividad en el ventrículo izquierdo que imita el infarto agudo de miocardio7, 8. Por el contrario, los modelos ISO crónicos de insuficiencia cardíaca presentan síntomas características de insuficiencia cardíaca avanzada, con niveles crónicamente elevados de catecolaminas1. Las ventajas del modelo ISO crónico son que proporciona estimulación adrenérgica crónica que imita la insuficiencia cardíaca avanzada y que es relativamente fácil de crear. El investigador debe elegir un modelo que recapitule mejor su patología de interés.
El objetivo general de este método es inducir la insuficiencia cardíaca en ratones utilizando una mini bomba implantada que libera ISO continuamente para imitar la activación simpática crónica que se encuentra en pacientes con insuficiencia cardíaca1. El método es simple y reproducible. Aunque hay una clara variación entre las cepas de ratón, ISO administrado durante 3 a 4 semanas a 30 mg/kg/día es suficiente para inducir la remodelación cardíaca en la mayoría de los ratones. Específicamente, ISO conduce a una fase compensatoria pro-hipertrófica durante la semana 1 seguida de adelgazamiento de la pared, dilatación ventricular y disminución de la función sistólica para la semana 2 y 32. El éxito para la creación del modelo ISO puede evaluarse in vivo mediante ecocardiografía en serie que demuestra hipertrofia, dilatación y disfunción ventricular, así como ex vivo a través de la evaluación histológica y molecular del tejido cardíaco cosechado para intramiocardio acumulación de lípidos, fibrosis, estrés urgencial, apoptosis y expresión génica9,10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Micro-Osmotic Pump System with Flow Moderator in Place</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>Model 1004</td>
			<td>Includes filling tube, flow moderator and pump body</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(-)-Isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16504-1G</td>
			<td>(-)-Isoproterenol hydrochloride is a powder that needs to be stored at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml sterile syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 W LED Fiber optic O-ring light microscope illuminator</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SKU: LED-30WR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 COATED VICRYL (polyglactin 910) Suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J303H</td>
			<td>5-0, absorbable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>FST</td>
			<td>18000-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizers</td>
			<td>FST</td>
			<td>18000-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Look Sharpoint 6-0, 18&#34; Black Nylon Monofilament Suture</td>
			<td>LOOK</td>
			<td>AA-2176</td>
			<td>6-0, non-absorbable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>15926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline, 0.9% NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>89167-772</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of an isoproterenol mini-pump to induce heart failure in mice

El isoproterenol (ISO), es un agonista beta-adrenérgico no selectivo, que se utiliza ampliamente para inducir lesiones cardíacas en ratones. Mientras que el modelo agudo imita la cardiomiopatía inducida por el estrés, el modelo crónico, administrado a través de una bomba osmótica, imita la insuficiencia cardíaca avanzada en los seres humanos. El propósito del protocolo descrito es crear el modelo de insuficiencia cardíaca crónica inducida por ISO en ratones utilizando una minibomba implantada. Este protocolo se ha utilizado para inducir insuficiencia cardíaca en más de 100 cepas de ratones endogámicos. Las técnicas sobre la implantación de bombas quirúrgicas se describen en detalle y pueden ser relevantes para cualquier persona interesada en crear un modelo de insuficiencia cardíaca en ratones. Además, se presentan los cambios semanales de remodelación cardíaca basados en parámetros ecocardiográficos para cada cepa y el tiempo esperado para el desarrollo del modelo. En resumen, el método es simple y reproducible. La ISO continua administrada a través de la minibomba implantada durante 3 a 4 semanas es suficiente para inducir la remodelación cardíaca. Por último, el éxito para la creación del modelo ISO puede evaluarse in vivo mediante ecocardiografía en serie que demuestra hipertrofia, dilatación ventricular y disfunción.

En nuestro estudio publicado anteriormente, administramos una dosis ISO de 30 mg/kg/d durante 21 días a través de la bomba osmótica a través de 105 cepas del Panel híbrido de diversidad de ratones (HMDP)2,13. Evaluamos los resultados utilizando ecocardiograma realizado al inicio, semana 1, 2 y 3 del tratamiento ISO(Figura 1). Al igual que un estudio previo donde los autores estudiaron el impacto del isoproterenol entre 23 cepas ...

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Implantation of an Isoproterenol Mini-Pump to Induce Heart Failure in Mice

La administración crónica de isoproterenol a través de una bomba osmótica implantada se ha utilizado ampliamente para imitar la insuficiencia cardíaca avanzada en ratones. Aquí, describimos métodos detallados en la implantación quirúrgica de minibombas para la administración continua de isoproterenol durante 3 semanas, así como, evaluación ecocardiográfica para la creación exitosa del modelo.

Implantación de una minibomba de isoproterenol para inducir insuficiencia cardíaca en ratones

Isoproterenol (ISO), is a non-selective beta-adrenergic agonist, that is used widely to induce cardiac injury in mice. While the acute model mimics ...

La administración crónica de isoproterenol a través de una bomba osmótica se ha utilizado ampliamente para recapitular los cambios en la insuficiencia cardíaca avanzada en ratones. Este método es simple y requiere menos experiencia quirúrgica que otros modelos, como LAD y TAC. Demostrando el procedimiento estará el Dr. Vincent Ren, un científico de investigación del laboratorio del Dr.Yibin Wang.Después de pesar y registrar el peso corporal de cada ratón, calcule la cantidad y concentración apropiadas de isoproterenol para cada animal, y disuelva el isoproterenol en 120 microlitros de cloruro de sodio estéril al 0,9%. Mezclar bien durante un minuto para solubilizar completamente el isoproterenol, y pesar y registrar el peso de una bomba osmótica vacía, junto con y sin su moderador de flujo, por ratón. Coloque un tubo de llenado de calibre 27 y puntas contundentes provisto de las bombas osmóticas y cargue una jeringa de un mililitro con 120 microlitros de la solución isoproterenol por ratón.Sosteniendo una bomba en posición vertical, inserte el tubo de llenado a través de la abertura de la bomba en la parte superior hasta que la punta del tubo de llenado se sitúe cerca de la parte inferior del depósito de la bomba, y presione lentamente el émbolo de la jeringa hasta que la solución isoproterenol se llene hasta la abertura de la bomba. Cuando la bomba haya sido cargada, retire cuidadosamente el tubo de llenado y limpie el exceso de solución. Inserte hacia atrás el moderador de flujo para cerrar la bomba y limpie cualquier solución sobrante.A continuación, vuelva a pesar la bomba para confirmar que se ha llenado más del 90% del volumen del depósito. Coloque el ratón en la posición supina sobre una almohadilla calentada y retire el aire de la parte inferior del abdomen. Para la implantación quirúrgica de bombas osmóticas, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo en un ratón anestesiado, y aplique ung ón en los ojos del animal.Limpie la piel expuesta con un desinfectante adecuado y haga una incisión de la piel de una línea media de un centímetro. Usa un par de tijeras de punta contundente para diseccionar cuidadosamente la piel de las paredes peritoneales subyacentes, y usa fórceps para alejar las paredes peritoneales del intestino subyacente. Utilice tijeras finas para cortar un agujero de 0,8 centímetros en la pared peritoneal e inserte el extremo del moderador de flujo de la bomba osmótica primero en la cavidad peritoneal.Cuando la bomba esté en su lugar, utilice suturas absorbibles 5-0 de forma interrumpida para cerrar el agujero en la pared peritoneal, y utilice suturas no absorbibles 6-0 para cerrar la piel. A continuación, coloque el ratón en una incubadora dedicada con monitoreo hasta la recumbencia completa antes de devolver el animal a su jaula de origen. Aquí, se presenta un resumen de los cambios semanales basados en los parámetros ecocardiográficos seleccionados y el tiempo esperado para el desarrollo del modelo.Aunque se observan variaciones entre las cepas del ratón, en promedio, el espesor de la pared interventricular del tabique al final de la diásola final y el acortamiento fraccional aumentan en la primera semana, pero disminuyen en puntos de tiempo posteriores. El diámetro interno ventricular izquierdo al final de la diástole y la masa ventricular izquierda aumentan durante un período de tres semanas. Además, los corazones de ratón demuestran dimensiones visiblemente más grandes de la cámara ventricular izquierda bajo isoproterenol, así como mayores cantidades de fibrosis en relación con los controles tratados con solución salina.Es fundamental mantener un ambiente quirúrgico estéril durante la cirugía de supervivencia para minimizar la infección postoperatoria y la morbilidad. La creación exitosa del modelo se puede evaluar in vivo mediante ecocardiografía serial para hipertrofia, dilatación y disfunción, así como ex vivo a través de la evaluación histológica y molecular del tejido cardíaco cosechado. Hemos aplicado este método a más de 100 cepas de ratones endogámicos para evaluar los rasgos de remodelación cardíaca debido a la estimulación beta-adrenérgica crónica.Los resultados se publican y están fácilmente disponibles.

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