Name: in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin
Uploaded: 2019-07-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin at JoVE.com

يتم اعتماد هذا العمل بواسطة منحNS096030 (MDB). كما نود أن نشكر مدير التصوير الأساسي فيد براكاش. كما نود أن نشكر مركز أوليمبوس ديسكفري/ مرفق التصوير الأساسي في يو تي دالاس على توفير المعدات والدعم

تمت الموافقة على الإجراءات الحيوانية من قبل جامعة تكساس في دالاس المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها، وكانت وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة.  وقد أجريت جميع التجارب باستخدام الفئران الذكور والإناث البالغة من العمر 8-12 أسبوعا ولدت في المنزل على خلفية C57BL/6. تم شراء الفئ?...

<ol>
	<li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system.">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li><li>Poltorak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+LPS+signaling+in+C3H/HeJ+and+C57BL/10ScCr+mice:+mutations+in+Tlr4+gene.">Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene.</a> Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).</li><li>Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-Like+Receptor-4+Signaling+Drives+Persistent+Fibroblast+Activation+and+Prevents+Fibrosis+Resolution+in+Scleroderma.">Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma.</a> Advances in Wound Care. 6 (10), 356-369 (2017).</li><li>Wadachi, R., Hargreaves, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trigeminal+nociceptors+express+TLR-4+and+CD14:+a+mechanism+for+pain+due+to+infection.">Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection.</a> Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).</li><li>Janssens, S., Beyaert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Toll-like+receptors+in+pathogen+recognition.">Role of Toll-like receptors in pathogen recognition.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).</li><li>Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Signalling+Genetics+of+Pain,+Cognitive+Dysfunction+and+Sickness+Symptoms+in+Cancer+Pain+Patients+Treated+with+Transdermal+Fentanyl.">Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl.</a> PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).</li><li>Paish, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+Promote+Inflammation+and+Pain+via+IL-1alpha+Induction+of+the+Monocyte+Chemoattractant+Chemokine+(C-C+Motif)+Ligand+2.">Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2.</a> American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).</li><li>Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+fibroblast+growth+factor+(FGF)+signaling+in+neurological+and+psychiatric+disorders.">Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).</li><li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+chromosome+walking+and+jumping.">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).</li><li>Madiai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fibroblast+growth+factor-2+antibodies+attenuate+mechanical+allodynia+in+a+rat+model+of+neuropathic+pain.">Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).</li><li>Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Fos+and+related+immediate+early+gene+products+as+markers+of+activity+in+neuroendocrine+systems.">c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).</li><li>Ieni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+Cellular+Features+of+Innate+Immune+Reaction+in+Helicobacter+pylori+Gastritis:+A+Brief+Review.">Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+behind+targeting+fibroblast+activation+protein-expressing+carcinoma-associated+fibroblasts+as+a+novel+chemotherapeutic+strategy.">Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>Tsutsumi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGE2+signaling+through+the+EP4+receptor+on+fibroblasts+upregulates+RANKL+and+stimulates+osteolysis.">PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).</li><li>Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+in+vivo+gene+expression:+a+critical+assessment+of+the+methodology+and+associated+technologies.">Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies.</a> Gene Therapy. 11, 85-91 (2004).</li><li>Victora, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germinal+center+dynamics+revealed+by+multiphoton+microscopy+with+a+photoactivatable+fluorescent+reporter.">Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter.</a> Cell. 143 (4), 592-605 (2010).</li><li>Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+random+access+multiphoton+microscopy+for+functional+imaging+of+neuronal+activity.">Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).</li><li>Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+imaging+of+the+gastrointestinal+tract.">Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract.</a> Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).</li><li>Ruthazer, E. S., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+of+neurons+in+living+tissue:+Acquisition+and+analysis+of+time-lapse+morphological+data.">Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data.</a> Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Analysis+of+Dendritic+Cell+Development+and+Homeostasis.">In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis.</a> Science. 324 (5925), 392-397 (2009).</li><li>Barber, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).</li><li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy.">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).</li><li>Gaigalas, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+Fluorescence+Intensity+Standards.">The Development of Fluorescence Intensity Standards.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).</li><li>Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+of+the+cellular+uptake+and+intracellular+trafficking+of+exosomes+by+live-cell+microscopy.">Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).</li><li>Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+multi-lifetime+multi-color+STED+imaging+for+colocalization+analyses.">Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses.</a> Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).</li><li>Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+dorsal+root+ganglion+neurons+induces+hyperexcitability+that+is+maintained+by+increased+responsiveness+to+cAMP+and+cGMP.">Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP.</a> Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).</li><li>Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon-like+microscopy+with+orders-of-magnitude+lower+illumination+intensity+via+two-step+fluorescence.">Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence.</a> Nature Communications. 6, 8184 (2015).</li><li>Makale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended-working-distance+multiphoton+micromanipulation+microscope+for+deep-penetration+imaging+in+live+mice+and+tissue.">Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).</li></ol>

يمكن القول أن أهم الخطوات في الجسم الحي 2-فوتون التصوير هي: 1) اختيار الماوس مراسل الوراثية الحق والبروتين الفلورسنت الموسومة لإعداد الفوتون متعددة والاحتياجات التجريبية21،22؛ 2) تصوير المستوى البؤري الصحيح ليكون لها تمثيل دقيق لسكان الخلايا في الأنسجة<sup class=...

Lipopolysaccharide (LPS) هو إندوتوكسين موجود في الغشاء الخارجي للبكتيريا سلبية الغرام1. LPS لديه تقارب ملزم عالية لمستقبلات مثل الرسوم 4 (TLR4)/CD14/MD2 مستقبلات مجمع2. TLR4 هو مستقبلات التعرف على نمط وجدت عادة على الغشاء الخارجي لمجموعة واسعة من الخلايا المناعية, الخلايا mesenchymal, ومجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحسية3,4,5. يؤدي تنشيط TLR4 المعبر عنه على الخلايا المناعية إلى أنظمة رسول ثانية معتمدة على MyD88 ومستقلة، وتنتهي بنقل بيتا كابا العامل النووي (NFיB) إلى نواة الخلية. وهذا يسبب الخلية المناعية prototypic لإنتاج وإطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل إنترلوكين (IL)-1β، IL-6، و TNF-α6. ومع ذلك, كيف تستجيب أنواع الخلايا الأخرى لتحفيز TLR4 ليست واضحة كما. وقد تورطت الخلايا الليفية في مجموعة واسعة من الأمراض مثل السرطان والتليف الكيسي، وقد ثبت مؤخرا أن تلعب دورا monocyte العلاج الكيميائي الجذب وتعزيز التهاب7،8،9.  يهتم مختبرنا بدور الخلايا الليفية في تطوير الألم الحاد والمزمن، حيث تشير الأدلة المبكرة إلى أن العوامل التي تطلقها الخلايا الليفية (مصفوفة metalloproteinases (MMPs)، مثبطات الأنسجة من metalloproteinases (TIMPs)، والخلايا الليفية عوامل النمو (FGFs)) تشارك في الألم العصبي10.
يمكن تحديد حالات تنشيط الخلايا من خلال مجموعة متنوعة من العوامل التي تشمل: تحريض الجينات الفورية المبكرة، وتغيير التعبير البروتيني، وانتشار الخلايا، والتغيرات المورفولوجية11،12،13. هناك العديد من التقنيات الموجودة للإجابة على الأسئلة التي قد تكون لدينا حول كيفية تنشيط الخلايا يساهم في الأمراض، ولكن لديهم جميعا قيودها. يستخدم الكيمياء المناعية النمطية الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لتسمية البروتينات ذات الأهمية في الأنسجة الثابتة، والتي قد تكون غير محددة وغالبا ما تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها كبيرة قبل أن تسفر عن نتائج مثمرة14. النشاف الغربي هو تقنية مفيدة عند مقارنة مستويات التعبير البروتين في أنسجة ما بعد الوفاة. ومع ذلك، فإن العنصر النسيجي يفتقر إلى هذه التقنية والباحثين غير قادرين على تحديد أي تغييرات في مورفولوجيا15. RNA-Seq يسمح لنا لتحديد كمية وجود RNA رسول في عينة التي في كثير من الحالات تسفر عن بيانات ثاقبة. ومع ذلك، فإن الفجوة بين النسخ والترجمة يجعل من الصعب أن يكون القرار الزمني بعد التحفيز16. التصوير البؤري مفيد في تحديد التعبير والتعريب المشترك للبروتينات الموجودة في مقطع عرضي من الأنسجة17. في كثير من الأحيان، وهذا لا يمثل كامل عينة الأنسجة. وعلى النقيض من ذلك، تسمح المجاهر متعددة الفوتونات للمستخدمين بتصوير ما يقرب من 1 مم في عمق العينة، وخلق تمثيل شامل ثلاثي الأبعاد18. لذلك، نختار التركيز على في الجسم الحي، 2-الفوتون التصوير الإعدادية، والبيانات التي تم جمعها من هذه التجارب هي أكثر مباشرة ذات الصلة إلى البيئة الدقيقة البلاستيكية للغاية ومترابطة من الأنسجة الحية.
ميزة دراسة التفاعلات مستقبلات البروتين في الجسم الحي هو أننا يمكن أن التقاط بوضوح كيف تستجيب الخلايا لتحفيز, في الوقت الحقيقي, في بيئتهم الأصلية دون تأثير ضار وغير متوقع لاستخراج الأنسجة بعد الوفاة19. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء دراسات طولية لتقييم اللدونة الخلوية وفتيلة التي قد تحدث بسبب التنشيط.  باستخدام التصوير 2-فوتون، ونحن الحفاظ على سلامة البيئة الدقيقة موجودة عند تطبيق التحفيز الخارجي. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتحديد الاستفادة من الجزيئات في الخلايا الليفية بعد الحقن المحيطي من LPS الموسومة بشكل فلوري على مدى عدة ساعات في الجسم الحي ودور TLR4 في تنشيط الخلايا الليفية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1520px;" width="1520">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:1131px;">10x PBS, 4 L</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:116px;">BP3994</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precision Glide Needle 30G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue Pad</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1420665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV30-FGR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane, USP 250 mL</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>50989-150-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3665-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MPE-RS TWIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personal Lubricant Jelly (Gel)</td>
			<td>equate</td>
			<td>ZH727 2E F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SGM-4 Stereotaxic Apparatus</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>16030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin

الخلايا الليفية هي الخلايا mesenchymal التي تغير مورفولوجيا عند التنشيط، مما يؤثر في نهاية المطاف على البيئة الدقيقة للأنسجة التي تقع فيها. على الرغم من أن تقنيات التصوير التقليدية مفيدة في تحديد تفاعلات البروتين ومورفولوجيا في الأنسجة الثابتة، فإنها ليست قادرة على إعطاء نظرة ثاقبة حول مدى سرعة الخلايا قادرة على ربط وكمية البروتينات، ومرة واحدة تنشيط كيف يتغير مورفولوجيا في فيفو. في هذه الدراسة، ونحن نسأل 2 الأسئلة الرئيسية: 1) ما هو المسار الزمني لتنشيط الخلايا الليفية عن طريق تأثير مثل مستقبلات-4 (TLR4) وتفاعل lipopolysaccharide (LPS) و 2) كيف تتصرف هذه الخلايا مرة واحدة تفعيلها؟ باستخدام التصوير 2-فوتون، قمنا بتطوير تقنية جديدة لتقييم قدرة LPS-FITC لربط مستقبلات الكونات، TLR4، وأعرب عن الخلايا الليفية الطرفية في خط الماوس مراسل الوراثية. FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox في الجسم الحي. هذا النهج الفريد يسمح للباحثين لخلق أشرطة الفيديو المتعمقة، الفاصل الزمني و / أو صور من البروتينات التفاعل مع الخلايا الحية التي تسمح للمرء أن يكون مستوى متزايد من الحبيبية في فهم كيف يمكن للبروتينات تغيير السلوك الخلوي.

في البداية، حقننا LPS-FITC في الكف الخلفي من الفئران البرية من أجل تصور استيعاب LPS-FITC في جميع أنواع الخلايا الموجودة في الطبقة الجلدية من مخلب. بعد أن لاحظت عددا لا يحصى من الخلايا في الطبقة الجلدية من مخلب الخلفية الاستفادة من الفلورسنت الموسومة LPS في فأر ة نوع البرية (فيديوالشكل 1،2)، ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin at JoVE.com

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

تحدث التغيرات المورفولوجية في الخلايا الليفية المتجاوبة المناعية بعد التنشيط وتعزيز التعديلات في التوظيف الخلوي. استخدام التصوير بفوتونين بالاقتران مع بروتين خاص بالفيبلاف 1 (FSP1) من الفوتونات وراثياً؛ tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) خط الماوس والأخضر الفلورسنت الموسومة lipopolysaccharide-FITC، يمكننا أن نوضح استيعاب محددة للغاية من lipopolysaccharide في الخلايا الليفية الجلدية والتغيرات المورفولوجية في الجسم الحي.

في فيفو اثنين من اللون 2-الفوتون التصوير من الخلايا المراسل الموسومة وراثيا في الجلد

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

بروتوكولنا يسمح لنا بتصور كيف تستجيب الخلايا الموسومة الفلورية إلى التحفيز المحيطي الالتهابي في حي في الوقت الحقيقي. 2-Photon التصوير يسمح التصور في عمق أنسجة العينة الحية، والحفاظ على سلامة خلاياها و البيئة الدقيقة وتوفير تمثيل دقيق للنظام البيولوجي. التنفس يتحرك مخلب مع مرور الوقت، مما تسبب في ضبابية وفقدان الطائرة المحورية.تأكد من لصق الكفب بقوة مع الشريط على سطح مستقر قبل التصوير. في هذا يجب أن تكون قادرة على العثور على الطائرة المناسبة من الفائدة، تأكد من أن الهدف هو قريب من مخلب دون لمس مباشرة فوق موقع الحقن. قبل البدء في الإجراء، قم بتشغيل نظام متعدد الفوتون وحدد 25X ذاتي.ضع جهازًا مجسمًا على خشبة المجهر متعدد الفوتونات، و صل الجهاز بجهاز توصيل التخدير. ضع قطعة من الورق الأسود غير اللامع على سطح الجهاز كنقطة اتصال لمخلب الماوس. تعيين الماسح الضوئي الرنين مع منطقة مسح ثابتة من 512 من قبل 512 ميكرومتر.ضبط أشعة الليزر الإثارة إلى 930 و 1، 100 نانومتر موجات الإثارة لإشارات البروتين الفلورسنت الخضراء والأحمر على التوالي. استخدام مرآة dichroic من 690 إلى 1، 050 نانومتر لتوجيه مسار الضوء من كل من الليزر الإثارة إلى هدف واحد يسمح ليزر الإثارة 930 نان ضبطها أن تنعكس على الماسح الضوئي الرئيسي و1، 100 نانومتر ضبطها الليزر لتمرير مباشرة إلى الماسح الضوئي الرئيسي. ثم تعيين قوة الليزر من FITC إلى 5٪ والبروتين الفلورسنت الأخضر إلى 20٪، وإيقاف الأضواء العلوية.لفي التصوير في الجسم الحي، تخدير الماوس والموجزة في بروتوكول النص. تأكيد عدم وجود استجابة لقرصة إصبع في الماوس مخدر ووضع الماوس في جهاز stereotaxic مع الوصول إلى مخروط الأنف. استخدام الشريط الأسود للصق بقوة مخلب الخلفي إلى قطعة من الورق الأسود على مناطق على حد سواء القريبة وفص إلى منطقة الاهتمام، والتأكد من سطح plantar من مخلب هو دون عائق وتواجه حتى نحو الهدف.ضع كمية سخية من مواد التشحيم القائمة على المياه على سطح اللوح من مخلب. لمس الهدف إلى مواد التشحيم لإنشاء عمود من السائل بين مخلب والهدف. استخدام الضوء الإثارة فيتC للتركيز في طبقة الجلد من مخلب، مؤكدا أن العتمة الطماطم جنبا إلى جنب الموسومة الخلايا الليفية يمكن تصور.صورة منطقة الخلايا الموجودة تحت سطح اللوح الخلفي للمخلب الخلفي مع كل من الليزر. الحصول على فترة زمنية مدتها 15 دقيقة من حوالي 5 إلى 10 شرائح من Z في ما يقرب من ميكرومتر واحد لكل شريحة لإنشاء تمثيل أساسي للبيئة. عندما تم الحصول على التصوير الأساسي ، قم بتحميل حقنة هاملتون الزجاجية 25 ميكرولتر مع خمسة ميكروغرام من السكاريد الدهني المترافقة مع FITC ، أو LPS ، لكل 20 ميكرولترات من PBS.إدارة الحل عن طريق الحقن داخل بلانتانار في مخلب هند التجريبية دون إزعاج موقف مخلب. ثم صورة منطقة من الخلايا الموجودة تحت سطح plantar من مخلب الخلفي مع كل من الليزر. الحصول على 60 إلى 120 دقيقة الفاصل الزمني من حوالي خمسة إلى 10 ز-شرائح في ما يقرب من ميكرومتر واحد لكل شريحة لتحديد امتصاص داخل زرع الخلية بوساطة LPS FITC.كما لا يوجد الفلورانس المتأصلة من قبل الخلايا داخل طبقة الجلد، وعدد لا يحصى من الخلايا في طبقة الجلد من مخلب هند يمكن ملاحظتها أخذ LPS الموسومة الفلورسنت بعد حقن داخل بلانتانار في نوع الماوس البرية. بعد حقن LPS FITC، فقط الليفية بروتين معين واحد الخلايا الليفية الإيجابية التي تعبر عن حصيلة مثل مستقبلات أربعة ربط وامتصاص البروتين حقن مع مستوى عال من التعريب المشترك مع علامة الطماطم الخافتة جنبا إلى جنب التي عبرت عنها هذه الخلايا. في المقابل، الفئران التي لديها حصيلة مثل مستقبلات أربعة خرج من الجسم كله لا ربط وامتصاص LPS بعد الحقن.في الواقع، تظهر الصور الظلية الخلية بعد حقن LPS FITC مما يشير إلى أن المخدرات تتشتت في السائل الخلالي حول الخلايا، ولكن لا يتم في الواقع ملزمة من قبل مستقبلات. أهم شيء يجب تذكره في هذا البروتوكول هو التأكد من أن مخلب شلت بحيث لا توجد تشوهات في الفيديو بسبب الحركة أو التنفس. باستخدام هذا الإجراء، يمكن تتبع تجنيد الخلايا الموسومة بالفلورسنت في منطقة ما بعد الإصابة والتغيرات المورفولوجية في استجابة الخلية للمحفزات بمرور الوقت.لذلك يسمح التصوير 2-Photon للباحثين بالجمع بين فئران المراسلات الجينية والمركبات الموسومة بالفلورسنت لتقييم ما يحدث في الحيوان الحي بعد الحقن.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparametric رسم الخرائط البصرية للقلب الأرنب Langendorff - perfused

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

رسم الخرائط البصرية إمكانيات العمل والعابرون الكالسيوم في القلب ماوس

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

الفيروسية النانوية ل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير ورم

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

جلد كامل عيب نموذج في تقييم الأوعية الدموية من الحيوية<em&gt; في فيفو</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

الكمي لالعالمي الانبساطي وظيفة عن طريق تحليل يستند النمذجة-الحركية من Transmitral التدفق عبر الشكلية ملء Parametrized الانبساطي

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

جيل من سمك ثلاثي الأبعاد الجلد كامل أي ما يعادل واصابة الآلي

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

الدراسات انجذاب كهربي من الرئة خلايا سرطان باستخدام القنوات المتعددة ثنائي الكهربائية الميدان ميكروفلويديك رقاقة

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

جامدة التضمين من الثابتة والملون، إجمالاً، مقياس الملليمتر العينات 3D خالية من قسم علم الأنسجة بالتصوير المقطعي الصغيرة المحسوبة

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...