Name: in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin
Uploaded: 2019-07-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin at JoVE.com

Dette arbejde understøttes af Grant NS096030 (MDB). Vi vil også gerne takke billedbehandlings Core Manager ved Prakash. Vi vil også gerne takke Olympus Discovery Center/Imaging Core Facility hos UT Dallas for at levere udstyr og support

Dyreforsøg blev godkendt af University of Texas i Dallas institutionel dyrepleje og brug udvalg og var i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer.  Alle eksperimenter blev udført ved hjælp af 8-12-ugers gamle mandlige og kvindelige mus opdrættet in-House på en C57BL/6 baggrund. Transgene mus med CRE-rekombinase drevet af den fibroblast-specifikke protein-1 promotor blev købt kommercielt (Jackson, 012641) (FSP1cre)+/- og krydsede med tdtomatoLOX-stop-LOX mus, ...

<ol>
	<li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system.">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li><li>Poltorak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+LPS+signaling+in+C3H/HeJ+and+C57BL/10ScCr+mice:+mutations+in+Tlr4+gene.">Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene.</a> Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).</li><li>Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-Like+Receptor-4+Signaling+Drives+Persistent+Fibroblast+Activation+and+Prevents+Fibrosis+Resolution+in+Scleroderma.">Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma.</a> Advances in Wound Care. 6 (10), 356-369 (2017).</li><li>Wadachi, R., Hargreaves, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trigeminal+nociceptors+express+TLR-4+and+CD14:+a+mechanism+for+pain+due+to+infection.">Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection.</a> Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).</li><li>Janssens, S., Beyaert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Toll-like+receptors+in+pathogen+recognition.">Role of Toll-like receptors in pathogen recognition.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).</li><li>Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Signalling+Genetics+of+Pain,+Cognitive+Dysfunction+and+Sickness+Symptoms+in+Cancer+Pain+Patients+Treated+with+Transdermal+Fentanyl.">Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl.</a> PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).</li><li>Paish, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+Promote+Inflammation+and+Pain+via+IL-1alpha+Induction+of+the+Monocyte+Chemoattractant+Chemokine+(C-C+Motif)+Ligand+2.">Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2.</a> American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).</li><li>Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+fibroblast+growth+factor+(FGF)+signaling+in+neurological+and+psychiatric+disorders.">Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).</li><li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+chromosome+walking+and+jumping.">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).</li><li>Madiai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fibroblast+growth+factor-2+antibodies+attenuate+mechanical+allodynia+in+a+rat+model+of+neuropathic+pain.">Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).</li><li>Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Fos+and+related+immediate+early+gene+products+as+markers+of+activity+in+neuroendocrine+systems.">c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).</li><li>Ieni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+Cellular+Features+of+Innate+Immune+Reaction+in+Helicobacter+pylori+Gastritis:+A+Brief+Review.">Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+behind+targeting+fibroblast+activation+protein-expressing+carcinoma-associated+fibroblasts+as+a+novel+chemotherapeutic+strategy.">Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>Tsutsumi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGE2+signaling+through+the+EP4+receptor+on+fibroblasts+upregulates+RANKL+and+stimulates+osteolysis.">PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).</li><li>Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+in+vivo+gene+expression:+a+critical+assessment+of+the+methodology+and+associated+technologies.">Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies.</a> Gene Therapy. 11, 85-91 (2004).</li><li>Victora, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germinal+center+dynamics+revealed+by+multiphoton+microscopy+with+a+photoactivatable+fluorescent+reporter.">Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter.</a> Cell. 143 (4), 592-605 (2010).</li><li>Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+random+access+multiphoton+microscopy+for+functional+imaging+of+neuronal+activity.">Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).</li><li>Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+imaging+of+the+gastrointestinal+tract.">Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract.</a> Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).</li><li>Ruthazer, E. S., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+of+neurons+in+living+tissue:+Acquisition+and+analysis+of+time-lapse+morphological+data.">Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data.</a> Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Analysis+of+Dendritic+Cell+Development+and+Homeostasis.">In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis.</a> Science. 324 (5925), 392-397 (2009).</li><li>Barber, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).</li><li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy.">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).</li><li>Gaigalas, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+Fluorescence+Intensity+Standards.">The Development of Fluorescence Intensity Standards.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).</li><li>Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+of+the+cellular+uptake+and+intracellular+trafficking+of+exosomes+by+live-cell+microscopy.">Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).</li><li>Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+multi-lifetime+multi-color+STED+imaging+for+colocalization+analyses.">Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses.</a> Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).</li><li>Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+dorsal+root+ganglion+neurons+induces+hyperexcitability+that+is+maintained+by+increased+responsiveness+to+cAMP+and+cGMP.">Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP.</a> Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).</li><li>Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon-like+microscopy+with+orders-of-magnitude+lower+illumination+intensity+via+two-step+fluorescence.">Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence.</a> Nature Communications. 6, 8184 (2015).</li><li>Makale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended-working-distance+multiphoton+micromanipulation+microscope+for+deep-penetration+imaging+in+live+mice+and+tissue.">Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).</li></ol>

Formentlig de vigtigste trin i in vivo 2-photon Imaging er: 1) at vælge den rigtige genetiske reporter mus og fluorescently-mærkede protein til multi-foton setup og eksperimentelle behov21,22; 2) Imaging den korrekte fokal plan for at have en nøjagtig repræsentation af populationen af celler i vævet23; 3) minimering af bevægelse på grund af et uretmæssigt immobiliseret dyr24; og 4) vælge, hvornår data skal...

Lipopolysaccharid (LPS) er et endotoksin, der findes i den ydre membran af gram-negative bakterier1. LPS har en høj bindingsaffinitet til den bompenge lignende receptor 4 (TLR4)/CD14/MD2 receptor Complex2. TLR4 er en mønster anerkendelse receptor almindeligt forekommende på den ydre membran af en bred vifte af immunceller, mesenchymal celler, og en delmængde af sensoriske neuroner3,4,5. Aktivering af TLR4 udtrykt på immunceller fører til MyD88-afhængige og uafhængige anden Messenger-systemer, slutter med nuklear-faktor Kappa Beta (NFκB) translokation til kernen i cellen. Dette får prototypic immun cellen til at producere og frigive pro-inflammatoriske cytokiner såsom interleukin (IL) -1 β, IL-6, og TNF-α6. Men, hvordan andre celle-typer reagerer på TLR4 stimulation er ikke så klar. Fibroblaster har været impliceret i en bred vifte af patologier såsom kræft og cystisk fibrose og har for nylig vist sig at spille en rolle monocyt Chemo-tiltrækning og fremme betændelse7,8,9.  Vores laboratorium er interesseret i rollen som fibroblaster i udviklingen af akutte og kroniske smerter, som tidlige beviser tyder på, at faktorer frigivet af fibroblaster (matrix metalloproteinaser (MMPs), vævs hæmmer af metalloproteinaser (TIMPs), og fibroblast vækstfaktorer (FGFs)) er involveret i neuropatiske smerter10.
Aktiverings tilstande af celler kan bestemmes af en række faktorer, der omfatter: induktion af umiddelbare tidlige gener, ændret protein udtryk, celle proliferation og morfologiske ændringer11,12,13. Der er mange teknikker, der findes til at besvare spørgsmål, vi måtte have om, hvordan aktivering af celler bidrager til patologier, men de har alle deres begrænsninger. Prototypical immunhistochemistry bruger fluorescently mærkede antistoffer til at mærke proteiner af interesse i fast væv, som kan være uspecifik og ofte kræver betydelig fejlfinding, før giver frugtbare resultater14. Western blotting er en nyttig teknik, når man sammenligner niveauer af protein ekspression i post mortem-væv; men den histologiske komponent mangler i denne teknik, og forskerne er ude af stand til at identificere eventuelle ændringer i morfologi15. RNA-SEQ tillader os at kvantificere tilstedeværelsen af Messenger RNA i en prøve, som i mange tilfælde giver indsigtsfulde data; men kløften mellem transkriptionen og oversættelsen gør det vanskeligt at have tidsmæssig opløsning efter en stimulus16. Confocal Imaging er nyttigt til at bestemme ekspression og samlokalisering af proteiner, der findes i et tværsnit af væv17. Ofte er dette ikke repræsentativt for hele vævsprøven. I modsætning hertil giver multiphoton mikroskoper brugerne mulighed for at billede omkring 1 mm dybt ind i en prøve, hvilket skaber en omfattende tredimensionel repræsentation18. Derfor vælger vi at fokusere på in vivo, 2-photon Imaging Preps, da data indsamlet fra disse eksperimenter er mere direkte relatable til den meget plastik og indbyrdes forbundne mikromiljø af levende væv.
En fordel ved at studere protein-receptor interaktioner in vivo er, at vi klart kan fange, hvordan cellerne reagerer på en stimulus, real-time, i deres indfødte miljø uden den skadelige og uforudsigelige indflydelse af post mortem-vævs ekstraktion19. Derudover kan longitudinale undersøgelser udføres for at vurdere cellulær plasticitet og priming, der kan opstå på grund af aktivering.  Ved hjælp af 2-photon Imaging bevarer vi integriteten af det mikromiljø, der er til stede, når der anvendes en ekstern stimulus. Denne protokol giver en måde at identificere optagelsen af molekyler i fibroblaster efter perifer injektion af fluorescently Tagged LPS i løbet af flere timer in vivo og rollen som TLR4 i fibroblast aktivering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1520px;" width="1520">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:1131px;">10x PBS, 4 L</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:116px;">BP3994</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precision Glide Needle 30G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue Pad</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1420665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV30-FGR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane, USP 250 mL</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>50989-150-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3665-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MPE-RS TWIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personal Lubricant Jelly (Gel)</td>
			<td>equate</td>
			<td>ZH727 2E F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SGM-4 Stereotaxic Apparatus</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>16030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin

Fibroblaster er mesenchymal celler, der ændrer deres morfologi ved aktivering, i sidste ende påvirker mikromiljøet i det væv, de er placeret i. Selv om traditionelle billeddannelsesteknikker er nyttige til at identificere protein interaktioner og morfologi i fast væv, er de ikke i stand til at give indsigt i, hvor hurtigt cellerne er i stand til at binde og optagelsen proteiner, og når de er aktiveret, hvordan deres morfologi ændringer i In vivo. I nærværende undersøgelse stiller vi 2 store spørgsmål: 1) Hvad er tidsforløbet af fibroblast aktivering via Toll-lignende receptor-4 (TLR4) og lipopolysaccharid (LPS) interaktion og 2) hvordan opfører disse celler sig, når de er aktiveret? Ved hjælp af 2-photon Imaging, har vi udviklet en ny teknik til at vurdere muligheden for LPS-FITC at binde til sin cognate receptor, TLR4, udtrykt på perifere fibroblaster i den genetiske reporter muse linje; FSP1cre; tdTomatoLOX-stop-LOX in vivo. Denne unikke tilgang giver forskerne mulighed for at skabe dybdegående, time-lapse videoer og/eller billeder af proteiner interagere med levende celler, der giver mulighed for at have en øget detaljeringsgrad i forståelsen af, hvordan proteiner kan ændre cellulære adfærd.

I første omgang injicerede vi LPS-FITC i bagpoten af vilde-type mus for at visualisere optagelsen af LPS-FITC i alle celletyper til stede i dermal lag af pote. Efter at have observeret et utal af celler i dermal lag af bagpote optagelsen fluorescently-Tagged LPS i en vildtype mus (video figur 1,2), vi forsøgte at specifikt målrette fibroblaster, da de er et primært fokus i vores forskning. Før billeddannelse poterne af dyr injiceres med LPS-FITC vi ønskede at være klar over, at der ikke er nogen i...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin at JoVE.com

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Morfologiske ændringer forekommer i immun responderende fibroblast celler efter aktivering og fremme ændringer i cellulære rekruttering. Udnyttelse af 2-photon Imaging i forbindelse med en genetisk manipuleret fibroblast-specifikke protein 1 (FSP1)-CRE; tdtomato floxed-stop-floxed (TB/TB) muse linje og grøn fluorescently Tagged LPS-FITC, vi kan illustrere meget specifik optagelse af lipopolysaccharid i Dermal fibroblaster og morfologiske ændringer in vivo.

In vivo to-farvet 2-foton billeddannelse af genetisk mærkede reporter celler i huden

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Vores protokol giver os mulighed for at visualisere, hvordan fluorescerende mærkede celler reagerer på en inflammatorisk perifer stimulus i et levende dyr i realtid. 2-Foton billeddannelse giver mulighed for visualisering dybt ind i vævet af en levende prøve, bevare integriteten af deres celler og deres mikromiljø og giver en nøjagtig repræsentation af det biologiske system. Vejrtrækning flytter poten over tid, forårsager blurriness og et tab af brændplanet.Sørg for at anbringe poten fast med tape på en stabil overflade før billeddannelse. I denne skal du være i stand til at finde passende plan af interesse, sørg for, at målet er tæt på poten uden at røre og er direkte over injektionsstedet. Før du begynder proceduren, skal du tænde for multi-foton-systemet og vælge 25X subjektive.Anbring et stereoaxisk apparat på scenen af multifotonmikroskopet, og tilslut apparatet til en anæstesileveringsmaskine. Placer et stykke mat sort papir på apparatets overflade som forbindelsespunkt for musepoten. Indstil resonansscanneren med et fast scanningsområde på 512 gange 512 mikrometer.Stil excitation lasere til 930 og 1, 100 nanometer excitation bølgelængder for grønne og røde fluorescerende protein signaler henholdsvis. Brug et dichroic spejl på 690 til 1, 050 nanometer til at dirigere lyset stien af både excitation lasere til det indre mål tillader 930 nanometer tunet excitation laser, der skal afspejles til de vigtigste scanner og 1, 100 nanometer tunet laser til at passere direkte ind i de vigtigste scanner. Derefter indstille laser magt FITC til 5% og grøn fluorescerende protein til 20%og slukke overhead lys.For in vivo imaging, bedøve musen og skitseret i tekstprotokollen. Bekræft manglende reaktion på tå knivspids i bedøvet mus og placere musen i stereotaxic apparat med adgang til en næse kegle. Brug sort tape til fast anbringe bagpoten til det stykke sort papir på områder både proksimale og distale til det område af interesse, og sørg for plantar overfladen af poten er uhindret og vender op mod målet.Placer en generøs mængde vandbaseret smøremiddel på plantar overfladen af poten. Tryk på målet til smøremidlet for at skabe en kolonne af væske mellem poten og målet. Brug FITC excitation lys til at fokusere ind i dermal lag af poten, bekræfter, at tandem dimer Tomat mærkede fibroblaster kan visualiseres.Billede det område af celler placeret lige under plantar overfladen af bagpoten med begge lasere. Anskaf en 15 minutters tidsforskydning på ca. fem til 10 Z-skiver ved ca. et mikrometer pr. skive for at etablere en baseline repræsentation af miljøet. Når baseline billeddannelse er opnået, indlæses en 25 mikroliterglas Hamilton sprøjte med fem mikrogram FITC konjugeret lipopolysaccharid, eller LPS, pr. 20 mikroliter PBS.Administrere opløsningen ved intraplantar injektion i den eksperimentelle bagpote uden at forstyrre pote position. Så billede et område af celler placeret lige under plantar overfladen af bagenden pote med begge lasere. Erhverve en 60 til 120 minutter tid bortfalder på omkring fem til 10 Z-skiver på ca. et mikrometer pr skive til at identificere celle medieret intraplantar optagelse af LPS FITC.Da der ikke er nogen iboende fluorescens af cellerne i det dermale lag, kan et utal af celler i bagpotelaget observeres under fluorescerende mærkede LPS efter intraplantar injektion i en vild type mus. Efter LPS FITC injektion, kun fibroblast specifikke protein en positiv fibroblaster udtrykke vejafgift som receptor fire binde og optagelse af injiceret protein med et højt niveau af co-lokalisering med en tandem dimer Tomat tag udtrykt af disse celler. I modsætning hertil, mus, der har vejafgift som receptor fire slået ud af hele kroppen ikke binder og optagelse LPS efter injektion.Faktisk, celle silhuetter er synlige efter LPS FITC injektion angiver, at stoffet er dispergering i den interstitielle væske omkring celler, men er faktisk ikke bundet af en receptor. Det vigtigste at huske i denne protokol er at sikre, at poten er immobiliseret, så der ikke er nogen fordrejninger i videoen på grund af bevægelse eller åndedræt. Ved hjælp af denne procedure kan rekrutteringen af fluorescerende mærkede celler til et område efter skade og de morfologiske ændringer i en celles reaktion på en stimulus over tid spores.Så 2-Foton billeddannelse giver forskerne mulighed for at kombinere genetiske reporter mus og fluorescerende mærkede forbindelser til at vurdere, hvad der sker i et levende dyr efter en injektion.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Virale Nanopartikler for<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

En fuld huddefekten model til evaluering Vaskularisering biomaterialer<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantificering af Global diastolisk funktion ved Kinematisk Modeling-baseret analyse af Transmitral Flow via parametriserede diastolisk Filling Formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generation af en tre-dimensionel fuld tykkelse Skin Equivalent og Automated Anskydning

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier af lungecancerceller ved hjælp af en Multichannel Dual-elektriske-felt Mikrofluid Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Stive indlejring af faste og plettet, hele, Millimeter-skala prøver for sektion-gratis 3D histologi ved mikro-beregnet tomografi

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...