Name: in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin
Uploaded: 2019-07-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin at JoVE.com

Diese Arbeit wird durch den Zuschuss NS096030 (MDB) unterstützt. Wir möchten uns auch beim Imaging-Core-Manager Ved Prakash bedanken. Wir danken auch olympus Discovery Center/Imaging Core Facility an der UT Dallas für die Bereitstellung von Ausrüstung und Support

Tierverfahren wurden von der University of Texas am Dallas Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und entsprachen den Richtlinien der National Institutes of Health.  Alle Experimente wurden mit 8-12 Wochen alten männlichen und weiblichen Mäusen durchgeführt, die im eigenen Haus auf einem C57BL/6-Hintergrund gezüchtet wurden. Transgene Mäuse mit Kre-Rekombiinase, angetrieben durch den fibroblastenspezifischen Protein-1-Promoter, wurden kommerziell gekauft (Jackson, 012641) (FSP1cre)+/-</...

<ol>
	<li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system.">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li><li>Poltorak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+LPS+signaling+in+C3H/HeJ+and+C57BL/10ScCr+mice:+mutations+in+Tlr4+gene.">Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene.</a> Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).</li><li>Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-Like+Receptor-4+Signaling+Drives+Persistent+Fibroblast+Activation+and+Prevents+Fibrosis+Resolution+in+Scleroderma.">Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma.</a> Advances in Wound Care. 6 (10), 356-369 (2017).</li><li>Wadachi, R., Hargreaves, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trigeminal+nociceptors+express+TLR-4+and+CD14:+a+mechanism+for+pain+due+to+infection.">Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection.</a> Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).</li><li>Janssens, S., Beyaert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Toll-like+receptors+in+pathogen+recognition.">Role of Toll-like receptors in pathogen recognition.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).</li><li>Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Signalling+Genetics+of+Pain,+Cognitive+Dysfunction+and+Sickness+Symptoms+in+Cancer+Pain+Patients+Treated+with+Transdermal+Fentanyl.">Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl.</a> PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).</li><li>Paish, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+Promote+Inflammation+and+Pain+via+IL-1alpha+Induction+of+the+Monocyte+Chemoattractant+Chemokine+(C-C+Motif)+Ligand+2.">Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2.</a> American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).</li><li>Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+fibroblast+growth+factor+(FGF)+signaling+in+neurological+and+psychiatric+disorders.">Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).</li><li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+chromosome+walking+and+jumping.">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).</li><li>Madiai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fibroblast+growth+factor-2+antibodies+attenuate+mechanical+allodynia+in+a+rat+model+of+neuropathic+pain.">Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).</li><li>Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Fos+and+related+immediate+early+gene+products+as+markers+of+activity+in+neuroendocrine+systems.">c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).</li><li>Ieni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+Cellular+Features+of+Innate+Immune+Reaction+in+Helicobacter+pylori+Gastritis:+A+Brief+Review.">Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+behind+targeting+fibroblast+activation+protein-expressing+carcinoma-associated+fibroblasts+as+a+novel+chemotherapeutic+strategy.">Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>Tsutsumi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGE2+signaling+through+the+EP4+receptor+on+fibroblasts+upregulates+RANKL+and+stimulates+osteolysis.">PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).</li><li>Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+in+vivo+gene+expression:+a+critical+assessment+of+the+methodology+and+associated+technologies.">Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies.</a> Gene Therapy. 11, 85-91 (2004).</li><li>Victora, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germinal+center+dynamics+revealed+by+multiphoton+microscopy+with+a+photoactivatable+fluorescent+reporter.">Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter.</a> Cell. 143 (4), 592-605 (2010).</li><li>Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+random+access+multiphoton+microscopy+for+functional+imaging+of+neuronal+activity.">Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).</li><li>Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+imaging+of+the+gastrointestinal+tract.">Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract.</a> Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).</li><li>Ruthazer, E. S., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+of+neurons+in+living+tissue:+Acquisition+and+analysis+of+time-lapse+morphological+data.">Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data.</a> Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Analysis+of+Dendritic+Cell+Development+and+Homeostasis.">In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis.</a> Science. 324 (5925), 392-397 (2009).</li><li>Barber, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).</li><li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy.">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).</li><li>Gaigalas, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+Fluorescence+Intensity+Standards.">The Development of Fluorescence Intensity Standards.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).</li><li>Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+of+the+cellular+uptake+and+intracellular+trafficking+of+exosomes+by+live-cell+microscopy.">Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).</li><li>Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+multi-lifetime+multi-color+STED+imaging+for+colocalization+analyses.">Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses.</a> Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).</li><li>Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+dorsal+root+ganglion+neurons+induces+hyperexcitability+that+is+maintained+by+increased+responsiveness+to+cAMP+and+cGMP.">Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP.</a> Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).</li><li>Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon-like+microscopy+with+orders-of-magnitude+lower+illumination+intensity+via+two-step+fluorescence.">Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence.</a> Nature Communications. 6, 8184 (2015).</li><li>Makale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended-working-distance+multiphoton+micromanipulation+microscope+for+deep-penetration+imaging+in+live+mice+and+tissue.">Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).</li></ol>

Die wohl wichtigsten Schritte der in vivo 2-Photonen-Bildgebung sind: 1) Die Wahl der richtigen genetischen Reportermaus und fluoreszierend getaggtes Protein für den Multi-Photon-Setup und experimentelle Bedürfnisse21,22; 2) Abbildung der richtigen Fokalebene, um eine genaue Darstellung der Population der Zellen im Gewebe23zu haben; 3) Minimierung der Bewegung durch ein unsachgemäß immobilisiertes Tier24; und 4)...

Lipopolysaccharid (LPS) ist ein Endotoxin, das in der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien gefunden wird1. LPS hat eine hohe Bindungsaffinität für den gebührenähnlichen Rezeptor 4 (TLR4)/CD14/MD2-Rezeptorkomplex2. TLR4 ist ein Mustererkennungsrezeptor, der häufig auf der äußeren Membran einer vielzahl von Immunzellen, mesenchymalen Zellen und einer Teilmenge sensorischer Neuronen3,4,5gefunden wird. Die Aktivierung von TLR4, ausgedrückt auf Immunzellen, führt zu MyD88-abhängigen und unabhängigen zweiten Botensystemen, die mit der Translokation des Kernfaktors kappa beta (NF-B) in den Zellkern enden. Dies bewirkt, dass die prototypische Immunzelle pro-inflammatorische Zytokine wie Interleukin (IL)-1, IL-6 und TNF-6 produziert und freisetzt. Wie andere Zelltypen auf die TLR4-Stimulation reagieren, ist jedoch nicht so klar. Fibroblasten wurden in eine Breite von Pathologien wie Krebs und Mukoviszidose verwickelt und haben vor kurzem gezeigt, dass eine Rolle Monozyten-Chemo-Attraktion und Förderung der Entzündung7,8,9.  Unser Labor interessiert sich für die Rolle von Fibroblasten bei der Entwicklung akuter und chronischer Schmerzen, da erste Hinweise darauf hindeuten, dass Faktoren, die durch Fibroblasten freigesetzt werden (Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), Gewebeinhibitor von Metalloproteinasen (TIMPs) und Fibroblasten, Wachstumsfaktoren (FGFs)) sind an neuropathische Schmerzen beteiligt10.
Aktivierungszustände von Zellen können durch eine Vielzahl von Faktoren bestimmt werden, die folgendes umfassen: Induktion von sofort-frühen Genen, veränderte Proteinexpression, Zellproliferation und morphologische Veränderungen11,12,13. Es gibt viele Techniken, die existieren, um Fragen zu beantworten, die wir haben können, wie die Aktivierung von Zellen zu Pathologien beiträgt, aber sie alle haben ihre Grenzen. Die prototypische Immunhistochemie verwendet fluoreszierend markierte Antikörper, um Proteine von Interesse in festem Gewebe zu kennzeichnen, die unspezifisch sein können und oft eine signifikante Fehlerbehebung erfordern, bevor sie fruchtbare Ergebnisse liefert14. Western Blotting ist eine nützliche Technik beim Vergleich der Proteinexpression im post-mortem Gewebe; jedoch fehlt die histologische Komponente in dieser Technik und Forscher sind nicht in der Lage, Veränderungen in der Morphologie zu identifizieren15. RNA-Seq ermöglicht es uns, das Vorhandensein von Messenger-RNA in einer Probe zu quantifizieren, die in vielen Fällen aufschlussreiche Daten liefert; die Lücke zwischen Transkription und Übersetzung macht es jedoch schwierig, eine zeitliche Auflösung nach einem Stimulus16zu haben. Konfokale Bildgebung ist nützlich bei der Bestimmung der Expression und Kolokalisierung von Proteinen, die in einem Querschnitt von Geweben existieren17. Oft ist dies nicht repräsentativ für die Gesamtheit der Gewebeprobe. Im Gegensatz dazu ermöglichen Multiphotonenmikroskope dem Anwender, etwa 1 mm tief in eine Probe einzutauchen, wodurch eine umfassende dreidimensionale Darstellung18entsteht. Daher konzentrieren wir uns auf in vivo, 2-Photon Imaging Preps, da die aus diesen Experimenten gesammelten Daten direkter mit der hochplastischen und vernetzten Mikroumgebung von lebendem Gewebe in Verbindung stehen.
Ein Vorteil der Untersuchung von Protein-Rezeptor-Wechselwirkungen in vivo ist, dass wir klar erfassen können, wie Zellen in Echtzeit auf einen Stimulus in ihrer heimischen Umgebung reagieren, ohne den schädlichen und unvorhersehbaren Einfluss der postmortalen Gewebeextraktion19. Darüber hinaus können Längsschnittstudien durchgeführt werden, um die zelluläre Plastizität und Grundierung zu bewerten, die aufgrund der Aktivierung auftreten können.  Mit 2-Photon-Bildgebung bewahren wir die Integrität der Mikroumgebung, die bei der Anwendung eines externen Stimulus vorhanden ist. Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, die Aufnahme von Molekülen in Fibroblasten nach der peripheren Injektion von fluoreszierend markiertem LPS im Laufe von mehreren Stunden in vivo und die Rolle von TLR4 bei der Fibroblastenaktivierung zu identifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1520px;" width="1520">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:1131px;">10x PBS, 4 L</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:116px;">BP3994</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precision Glide Needle 30G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue Pad</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1420665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV30-FGR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane, USP 250 mL</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>50989-150-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3665-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MPE-RS TWIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personal Lubricant Jelly (Gel)</td>
			<td>equate</td>
			<td>ZH727 2E F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SGM-4 Stereotaxic Apparatus</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>16030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin

Fibroblasten sind mesenchymale Zellen, die ihre Morphologie nach Aktivierung verändern und letztlich die Mikroumgebung des Gewebes beeinflussen, in dem sie sich befinden. Obwohl herkömmliche bildgebende Verfahren nützlich sind, um Proteininteraktionen und Morphologie in festem Gewebe zu identifizieren, sind sie nicht in der Lage, Einen Einblick zu geben, wie schnell Zellen in der Lage sind, Proteine zu binden und aufzunehmen, und sobald sie aktiviert sind, wie sich ihre Morphologie in Vivo. In der vorliegenden Studie stellen wir 2 hauptgestellte Fragen: 1) Wie ist der Zeitverlauf der Fibroblastenaktivierung über mautähnliche Rezeptor-4 (TLR4) und Lipopolysaccharid (LPS) Interaktion und 2) wie verhalten sich diese Zellen, sobald sie aktiviert wurden? Mit 2-Photon-Bildgebung haben wir eine neuartige Technik entwickelt, um die Fähigkeit von LPS-FITC zu bewerten, sich an seinen Kognanrezeptor TLR4 zu binden, der auf peripheren Fibroblasten in der genetischen Reporter-Mauslinie ausgedrückt wird; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox in vivo. Dieser einzigartige Ansatz ermöglicht es Forschern, tiefgehende, zeitraffende Videos und/oder Bilder von Proteinen zu erstellen, die mit lebenden Zellen interagieren, was es einem ermöglicht, eine erhöhte Granularität zu haben, um zu verstehen, wie Proteine das zelluläre Verhalten verändern können.

Zunächst injizierten wir LPS-FITC in die Hinterpfote von Wild-Typ-Mäusen, um die Aufnahme von LPS-FITC in allen Zelltypen zu visualisieren, die in der dermalen Schicht der Pfote vorhanden sind. Nachdem wir eine Vielzahl von Zellen in der dermalen Schicht der Hinterpfotenaufnahme fluoreszierend LPS in einer Wild-Typ-Maus beobachtet hatten (Videoabbildung 1, 2), versuchten wir, speziell Auf Fibroblasten zu zielen, da sie ein Primärfokus in unserer Forschung sind. Bevor wir die Pfoten von Tieren, die mit...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin at JoVE.com

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Morphologische Veränderungen treten in immunreagierenden Fibroblastenzellen nach aktivierung auf und fördern Veränderungen bei der Zellrekrutierung. Verwendung von 2-Photonen-Bildgebung in Verbindung mit einem gentechnisch veränderten Fibroblasten-spezifischen Protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) Mauslinie und grün fluoreszierend markiert Lipopolysaccharid-FITC, können wir hochspezifische Aufnahme von Lipopolysaccharid in dermalen Fibroblasten und morphologischen Veränderungen in vivo veranschaulichen.

In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Unser Protokoll ermöglicht es uns, zu visualisieren, wie fluoreszierend markierte Zellen auf einen entzündlichen peripheren Reiz bei einem lebenden Tier in Echtzeit reagieren. Die 2-Photonen-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung tief in das Gewebe einer lebenden Probe, bewahrt die Integrität ihrer Zellen und ihrer Mikroumgebung und liefert eine genaue Darstellung des biologischen Systems. Atmen bewegt die Pfote im Laufe der Zeit, was zu Unschärfe und einem Verlust der Brennebene führt.Achten Sie darauf, die Pfote fest mit Klebeband auf einer stabilen Oberfläche vor der Bildgebung zu befestigen. Dabei müssen Sie in der Lage sein, eine geeignete Ebene von Interesse zu finden, stellen Sie sicher, dass objektiv in der Nähe der Pfote ohne Berührung und ist direkt über Injektionsstelle. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, schalten Sie das Multi-Photon-System ein und wählen Sie das 25X subjektive.Legen Sie ein stereotaxic-Gerät auf die Bühne des Multiphotonenmikroskops und schließen Sie das Gerät an eine Anästhesie-Zulagemaschine an. Legen Sie ein Stück mattes schwarzes Papier auf die Oberfläche des Geräts als Verbindungspunkt für die Mauspfote. Stellen Sie den Resonanzscanner mit einer festen Scanfläche von 512 mal 512 Mikrometern ein.Stellen Sie die Anregungslaser auf die Anregungswellenlängen 930 bzw. 1, 100 Nanometer für grüne bzw. rote fluoreszierende Proteinsignale ein. Verwenden Sie einen dichroitischen Spiegel von 690 bis 1 050 Nanometern, um den Lichtweg beider Anregungslaser auf das einzelne Ziel zu lenken, sodass der 930 Nanometer große anregte Anregungslaser auf den Hauptscanner und den 1, 100 Nanometer abgestimmten Laser direkt in den Hauptscanner reflektiert werden kann. Stellen Sie dann die Laserleistung von FITC auf 5% und grünes fluoreszierendes Protein auf 20% und schalten Sie die Oberlichter aus.Für die In-vivo-Bildgebung die Maus anästhesieren und im Textprotokoll umrissen. Bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in der anästhesierten Maus und legen Sie die Maus in das stereotaxic Gerät mit Zugang zu einem Nasenkegel. Verwenden Sie schwarzes Klebeband, um die Hinterpfote fest auf dem Stück schwarzem Papier auf Bereichen sowohl proximal als auch distal auf den Bereich des Interesses zu befestigen, um sicherzustellen, dass die Plantaroberfläche der Pfote ist ungehindert und nach oben zum Ziel.Legen Sie eine großzügige Menge an Gleitmittel auf Wasserbasis auf die Plantaroberfläche der Pfote. Berühren Sie das Ziel auf das Schmiermittel, um eine Flüssigkeitssäule zwischen der Pfote und dem Objektiv zu erstellen. Verwenden Sie das FITC-Erregungslicht, um sich in die dermale Schicht der Pfote zu fokussieren, was bestätigt, dass die Tandem-Dimer-Tomaten-Getagt-Fibroblasten visualisiert werden können.Stellen Sie sich den Zellbereich direkt unter der Plantaroberfläche der Hinterpfote mit beiden Lasern vor. Erfassen Sie einen Zeitraffer von etwa fünf bis zehn Z-Scheiben bei etwa einem Mikrometer pro Scheibe, um eine Grunddarstellung der Umgebung zu erstellen. Wenn die Basisbildgebung erhalten ist, laden Sie eine 25 Mikroliter Glas Hamilton Spritze mit fünf Mikrogramm FITC konjugiertes Lipopolysaccharid, oder LPS, pro 20 Mikroliter PBS.Die Lösung durch intraplantare Injektion in die experimentelle Hinterpfote verabreichen, ohne die Pfotenposition zu stören. Dann stellen Sie einen Zellbereich direkt unter der Plantaroberfläche der Hinterpfote mit beiden Lasern ab. Erwerben Sie einen Zeitraffer von 60 bis 120 Minuten von etwa fünf bis zehn Z-Scheiben bei etwa einem Mikrometer pro Scheibe, um die zellvermittelte intraplantare Aufnahme von LPS FITC zu identifizieren.Da es keine inhärente Fluoreszenz durch die Zellen innerhalb der dermalen Schicht gibt, kann eine Vielzahl von Zellen in der dermalen Schicht der Hinterpfote beobachtet werden, indem fluoreszierend LPS nach intraplantarer Injektion in einer Wild-Typ-Maus einnimmt. Nach der LPS-FITC-Injektion bindet nur Fibroblasten-spezifisches Protein ein positives Protein wie Rezeptor vier bindet und nimmt das injizierte Protein mit einem hohen Maß an Kolokalisierung mit einem Tandem-Dimer-Tomaten-Tag auf, das von diesen Zellen ausgedrückt wird. Im Gegensatz dazu binden und nehmen Mäuse, die wie Rezeptor vier aus dem ganzen Körper geschlagen haben, LPS nach der Injektion nicht an und nehmen es auf.Tatsächlich sind Zellsilhouetten nach der LPS-FITC-Injektion sichtbar, was darauf hinweist, dass sich das Medikament in der interstitiellen Flüssigkeit um Zellen dispergiert, aber nicht tatsächlich durch einen Rezeptor gebunden ist. Das Wichtigste, was in diesem Protokoll zu erinnern ist, sicherzustellen, dass die Pfote immobilisiert, so dass es keine Verzerrungen im Video aufgrund von Bewegung oder Atmung. Mit diesem Verfahren können die Rekrutierung von fluoreszierend markierten Zellen in einen Bereich nach der Verletzung und die morphologischen Veränderungen in der Reaktion einer Zelle auf einen Stimulus im Laufe der Zeit nachverfolgt werden.So ermöglicht 2-Photon Bildgebung Forschergenetische Reporter Mäuse und fluoreszierend getaggte Verbindungen zu kombinieren, um zu beurteilen, was in einem lebenden Tier nach einer Injektion passiert.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electro Studium der Lungenkrebszellen unter Verwendung eines Mehrkanal-Zwei elektrischen Feldes Mikrofluidik-Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Starre Einbettung von fixiert und gefärbt, im großen und ganzen Millimeter-Skala Exemplare für Abschnitt-free 3D Histologie durch Mikro-Computertomographie

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...