Name: in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin
Uploaded: 2019-07-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המענק NS096030 (MDB). בנוסף, אנו רוצים להודות למנהל ליבת ההדמיה Prakash. אנחנו גם רוצים להודות האולימפוס דיסקברי מרכז/הדמיה ליבה מתקן ב UT דאלאס לאספקת ציוד ותמיכה

הליכים בעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת טקסס של דאלאס טיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש הוועדה היו בהתאם לאומי מכונים הנחיות בריאות.  כל הניסויים בוצעו באמצעות 8-12-שבוע-גברים עכברים ונשים שנולדו ב-הבית על רקע C57BL/6. עכברים טרנסגניים עם recombinase מונע על ידי המקדם חלבון-1 הספציפי לפיברוהפיצו...

<ol>
	<li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system.">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li><li>Poltorak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+LPS+signaling+in+C3H/HeJ+and+C57BL/10ScCr+mice:+mutations+in+Tlr4+gene.">Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene.</a> Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).</li><li>Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-Like+Receptor-4+Signaling+Drives+Persistent+Fibroblast+Activation+and+Prevents+Fibrosis+Resolution+in+Scleroderma.">Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma.</a> Advances in Wound Care. 6 (10), 356-369 (2017).</li><li>Wadachi, R., Hargreaves, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trigeminal+nociceptors+express+TLR-4+and+CD14:+a+mechanism+for+pain+due+to+infection.">Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection.</a> Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).</li><li>Janssens, S., Beyaert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Toll-like+receptors+in+pathogen+recognition.">Role of Toll-like receptors in pathogen recognition.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).</li><li>Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Signalling+Genetics+of+Pain,+Cognitive+Dysfunction+and+Sickness+Symptoms+in+Cancer+Pain+Patients+Treated+with+Transdermal+Fentanyl.">Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl.</a> PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).</li><li>Paish, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+Promote+Inflammation+and+Pain+via+IL-1alpha+Induction+of+the+Monocyte+Chemoattractant+Chemokine+(C-C+Motif)+Ligand+2.">Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2.</a> American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).</li><li>Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+fibroblast+growth+factor+(FGF)+signaling+in+neurological+and+psychiatric+disorders.">Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).</li><li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+chromosome+walking+and+jumping.">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).</li><li>Madiai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fibroblast+growth+factor-2+antibodies+attenuate+mechanical+allodynia+in+a+rat+model+of+neuropathic+pain.">Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).</li><li>Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Fos+and+related+immediate+early+gene+products+as+markers+of+activity+in+neuroendocrine+systems.">c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).</li><li>Ieni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+Cellular+Features+of+Innate+Immune+Reaction+in+Helicobacter+pylori+Gastritis:+A+Brief+Review.">Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+behind+targeting+fibroblast+activation+protein-expressing+carcinoma-associated+fibroblasts+as+a+novel+chemotherapeutic+strategy.">Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>Tsutsumi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGE2+signaling+through+the+EP4+receptor+on+fibroblasts+upregulates+RANKL+and+stimulates+osteolysis.">PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).</li><li>Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+in+vivo+gene+expression:+a+critical+assessment+of+the+methodology+and+associated+technologies.">Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies.</a> Gene Therapy. 11, 85-91 (2004).</li><li>Victora, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germinal+center+dynamics+revealed+by+multiphoton+microscopy+with+a+photoactivatable+fluorescent+reporter.">Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter.</a> Cell. 143 (4), 592-605 (2010).</li><li>Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+random+access+multiphoton+microscopy+for+functional+imaging+of+neuronal+activity.">Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).</li><li>Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+imaging+of+the+gastrointestinal+tract.">Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract.</a> Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).</li><li>Ruthazer, E. S., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+of+neurons+in+living+tissue:+Acquisition+and+analysis+of+time-lapse+morphological+data.">Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data.</a> Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Analysis+of+Dendritic+Cell+Development+and+Homeostasis.">In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis.</a> Science. 324 (5925), 392-397 (2009).</li><li>Barber, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).</li><li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy.">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).</li><li>Gaigalas, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+Fluorescence+Intensity+Standards.">The Development of Fluorescence Intensity Standards.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).</li><li>Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+of+the+cellular+uptake+and+intracellular+trafficking+of+exosomes+by+live-cell+microscopy.">Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).</li><li>Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+multi-lifetime+multi-color+STED+imaging+for+colocalization+analyses.">Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses.</a> Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).</li><li>Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+dorsal+root+ganglion+neurons+induces+hyperexcitability+that+is+maintained+by+increased+responsiveness+to+cAMP+and+cGMP.">Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP.</a> Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).</li><li>Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon-like+microscopy+with+orders-of-magnitude+lower+illumination+intensity+via+two-step+fluorescence.">Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence.</a> Nature Communications. 6, 8184 (2015).</li><li>Makale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended-working-distance+multiphoton+micromanipulation+microscope+for+deep-penetration+imaging+in+live+mice+and+tissue.">Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).</li></ol>

לטעון את הצעדים החשובים ביותר של vivo 2-פוטון הדמיה הם: 1) בחירת העכבר הכתב הגנטי הנכון ו-fluorescently אופן מתויג חלבון עבור ההתקנה multi-פוטון ואת הצרכים הניסיוניים21,22; 2) הדמיה של מטוס המוקד הנכון לייצוג מדויק של אוכלוסיית התאים ברקמה23; 3) מזעור התנועה בשל ?...

ליפופוליסכריד (LPS) הוא אנדוטוקסין שנמצא בקרום החיצוני של חיידקים גראם שליליים1. LPS יש זיקה מחייבת גבוהה עבור קולטן כמו אגרה 4 (TLR4)/CD14/MD2 מורכבת הקולטן2. TLR4 הוא הזיהוי דפוס הקולטן נמצא בדרך כלל על הקרום החיצוני של מגוון רחב של תאים חיסוניים, התאים mesenchymal, וקבוצת משנה של נוירונים סנסטיים3,4,5. ההפעלה של TLR4 ביטא על התאים החיסוניים מוביל למערכות שליחה התלויים בMyD88 ועצמאיים, ומסתיים באמצעות הטרנסלוקציה של הגורם הגרעיני ביתא (NFκB) לגרעין התא. זה גורם תא החיסון prototypic לייצר ולשחרר ציטוקינים פרו דלקתיים כגון Interleukin (IL) -1 β, IL-6 ו-TNF-α6. עם זאת, האופן שבו סוגי תאים אחרים מגיבים לגירוי TLR4 אינו ברור. פיברותקיעות כבר היה מעורב במגוון רחב של פתווגיות כגון סרטן סיסטיק פיברוזיס לאחרונה הוכחו לשחק תפקיד מונוציט כימותרפיה-אטרקציה וקידום דלקת7,8,9.  המעבדה שלנו מעוניינת בתפקיד של בעיות בהתפתחות של כאב חריף וכרוני, כפי שראיות מוקדמות מצביעות על כך שגורמים שפורסמו על ידי פיברוטיטים (Mps מטריקס), רקמות מעכבי של מטאלוסים (TIMPs), ופיברוביסט גורמי גדילה (FGFs)) מעורבים בכאבים נוירופתיים10.
מצבי הפעלה של תאים יכולים להיקבע על ידי מגוון של גורמים הכוללים: אינדוקציה של גנים מוקדמים מיידית, ביטוי חלבון משתנה, הפצת תאים, ושינויים מורפולוגיים11,12,13. ישנן טכניקות רבות הקיימות כדי לענות על שאלות שאולי יש לנו על איך הפעלה של תאים תורמת הפתווגיות, אבל לכולם יש מגבלות שלהם. פרוטוסטיאוסטוכימיה משתמשת בנוגדנים מתויגים פלואורוסקופים כדי לתייג חלבונים של עניין ברקמה קבועה, אשר עשוי להיות בלתי ספציפי ולעתים קרובות דורשים פתרון בעיות משמעותיות לפני מניב תוצאות פוריות14. כתמים מערביים היא טכניקה שימושית בעת השוואת רמות של ביטוי חלבון ברקמה שלאחר המוות; עם זאת, המרכיב היסטולוגית חסר בטכניקה זו וחוקרים אינם יכולים לזהות שינויים במבנה מורפולוגיה15. RNA-Seq מאפשר לנו לכמת את הנוכחות של RNA שליח במדגם אשר במקרים רבים תשואות נתונים תובנה; עם זאת, הפער בין תמלול ותרגום מקשה על הרזולוציה הטמפורלית לאחר גירוי16. הדמיה קונפוקלית שימושית בקביעת הביטוי והלוקליזציה של חלבונים הקיימים בחתך של רקמות17. לעתים קרובות, אין זה נציג של כל דגימת הרקמה. לעומת זאת, מיקרוסקופ multiphoton לאפשר למשתמשים תמונה בערך 1 מ"מ עמוק לתוך מדגם, יצירת ייצוג תלת מימדי מקיף18. לכן, אנחנו בוחרים להתמקד ב-vivo, 2-פוטון הדמיה preps, כאשר הנתונים שנאספו מניסויים אלה הם יותר ישירות לתרגום מאוד פלסטיק והדדית מיקרוסביבה של רקמות החיים.
היתרון של לימוד אינטראקציות של קולטן חלבון ב vivo הוא שאנחנו יכולים ללכוד בבירור כיצד תאים להגיב גירוי, בזמן אמת, בסביבה הטבעית שלהם ללא השפעה מזיקה ובלתי צפויה של הוצאת רקמות שלאחר המוות19. בנוסף, ניתן לבצע מחקרים לאורך כדי להעריך את הפלסטיות התאית והטרמה שעלולות להתרחש עקב הפעלה.  באמצעות הדמיה 2-פוטון, אנו שומרים על השלמות של המיקרו-סביבה בהווה כאשר מוחל גירוי חיצוני. פרוטוקול זה מספק דרך לזהות ספיגת מולקולות באמצעות הזרקה היקפית בעקבות הזרקת היקפי של מתויג LPS במהלך מספר שעות בvivo ואת התפקיד של TLR4 בהפעלת פיברובלסט.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1520px;" width="1520">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:1131px;">10x PBS, 4 L</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:116px;">BP3994</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precision Glide Needle 30G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue Pad</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1420665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV30-FGR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane, USP 250 mL</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>50989-150-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3665-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MPE-RS TWIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personal Lubricant Jelly (Gel)</td>
			<td>equate</td>
			<td>ZH727 2E F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SGM-4 Stereotaxic Apparatus</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>16030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin

פיברופיצוצים הם תאים mesenchymal כי לשנות את המבנה שלהם על ההפעלה, בסופו של דבר השפעה על מיקרואקולוגיה של הרקמה הם ממוקמים. למרות טכניקות הדמיה מסורתיות שימושיות בזיהוי אינטראקציות חלבונים ומורפולוגיה ברקמה קבועה, הם לא מסוגלים לתת תובנה לגבי איך תאים במהירות מסוגלים לאגד וספיגת חלבונים, ולאחר הפעלת כיצד שינויי המבנה שלהם ב vivo. במחקר הנוכחי, אנו שואלים 2 שאלות עיקריות: 1) מה הוא הזמן-קורס של הפעלת פיברובלסט דרך קולטן כמו חיוג 4 (TLR4) ו ליפופוליד (LPS) אינטראקציה 2) איך תאים אלה להתנהג פעם הופעל? באמצעות 2-פוטון הדמיה, פיתחנו טכניקה הרומן כדי להעריך את היכולת של lps-fitc לאגד קולטן קנצוני שלה, TLR4, הביע על פיברופיצוצים היקפיים קו העכבר העיתונאי הגנטי; FSP1cre; . vivo, לקס. גישה ייחודית זו מאפשרת לחוקרים ליצור מעמיק, קטעי וידאו ו/או תמונות של חלבונים אינטראקציה עם תאים חיים המאפשר אחד יש רמה מוגברת של צפיפות הרשת בהבנת איך חלבונים יכולים לשנות התנהגות תאית.

בתחילה, הזרקנו LPS-FITC לתוך האחוריות של עכברים מסוג פראי כדי להמחיש את ספיגת LPS-FITC בכל סוגי התאים הנמצאים בשכבה העורי של כף היד. לאחר שנצפתה מספר עצום של תאים בשכבת העורי של ספיגת כף הרגל האחוריות fluorescently אופן-מתויג LPS בעכבר סוג פראי (וידאו איור 1, 2), ניסינו במיוחד היעד פיברופיצוצים כפי ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin at JoVE.com

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

שינויים מורפולוגיים מתרחשים בתאי החיסון החיסונית התגובה בעקבות ההפעלה ולקדם שינויים בגיוס הסלולר. ניצול 2-פוטון הדמיה בשילוב עם חלבון מהונדס בצורה גנטית לפיברוסט-1 (FSP1)-יצור; tdTomato פלומפולט-stop-floxed (tb/tb) קו העכבר הירוק fluorescently מתויג ליפופוליל-fitc, אנחנו יכולים להדגים ספיגה ספציפית מאוד של ליפופוליד בפיברוהכדורים ושינויים מורפולוגיים ב vivo.

ב Vivo שני צבעים 2-פוטון הדמיה של תאי כתב שתייגת גנטית בעור

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לדמיין כיצד תאים המתויגים באופן פלואורסצנטי מגיבים לגירוי היקפי דלקתי בבעל חיים בזמן אמת. הדמיה 2-Photon מאפשר הדמיה עמוק לתוך הרקמה של דגימה חיה, שמירה על שלמות התאים שלהם microenvironment שלהם ומספק ייצוג מדויק של המערכת הביולוגית. הנשימה מזיזה את הכף לאורך זמן, וגורמת לטשטוש ולאובדן מישור המוקד.הקפד להדביק את הכף בחוזקה עם סרט על משטח יציב לפני הדמיה. בזה אתה חייב להיות מסוגל למצוא מישור מתאים של עניין, לוודא כי המטרה קרובה לכפות הרגליים מבלי לגעת והוא ישירות מעל אתר ההזרקה. לפני תחילת ההליך, הפעל את מערכת ריבוי הפוטון ובחר את הסובייקטיבי 25X.מניחים מנגנון סטריאוטוקסי על הבמה של מיקרוסקופ רב פוטון ולחבר את המנגנון למכונת משלוח הרדמה. מניחים פיסת נייר שחור מט על פני השטח של המנגנון כנקודת חיבור עבור כפה העכבר. הגדר את סורק תהודה עם אזור סריקה קבוע של 512 על 512 מיקרומטר.כוונן את לייזרי העירור לאותות חלבון פלואורסצנטיים 930 ו- 1, 100 ננומטר עבור אותות חלבון פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים בהתאמה. השתמש במראה דיכרוית של 690 עד 1, 050 ננומטר כדי לכוון את נתיב האור של שני לייזרים העירור למטרה אחת המאפשר לייזר העירור מכוון 930 ננומטר להיות משתקף לסורק הראשי לייזר מכוון 1, 100 ננומטר לעבור ישירות לתוך הסורק הראשי. לאחר מכן הגדר את כוח הלייזר של FITC ל-5% ואת החלבון הפלואורסצנטי הירוק ל-20% וכבה את האורות העיליים.להדמיית in vivo, הרדמה של העכבר וחלוקה לרמות בפרוטוקול הטקסט. אשר חוסר תגובה לצביטת בוהן בעכבר הרדמה והנח את העכבר במנגנונים הסטריאוטוקסיים עם גישה לקוביית אף. השתמש בקלטת שחורה כדי להדביק בחוזקה את הכף האחורית לפיסת הנייר השחור על אזורים פרוקסימליים ודיסטליים לאזור העניין, ולוודא שהמשטח הצמחי של הכף אינו מובס ופונים כלפי מעלה לכיוון המטרה.מניחים כמות נדיבה של חומר סיכה על בסיס מים על פני השטח plantar של הכף. לגעת במטרה חומר סיכה כדי ליצור עמודה של נוזל בין הכף לבין המטרה. השתמש באור העירור FITC כדי להתמקד בשכבה העורית של הכף, המאשר כי עגבניות דים טנדם מתויג fibroblasts ניתן לדמיין.תמונה את האזור של תאים הממוקמים ממש מתחת לפני השטח plantar של הכף האחורית עם שני לייזרים. לרכוש מעידת זמן של 15 דקות של כ 5 עד 10 פרוסות Z בערך מיקרומטר אחד לפרוסה כדי ליצור ייצוג בסיסי של הסביבה. כאשר ההדמיה הבסיסית הושגה, לטעון מזרק המילטון זכוכית 25 microliter עם חמישה מיקרוגרם של ליפופוליסכריד אצמוי FITC, או LPS, לכל 20 microliters של PBS.לנהל את הפתרון על ידי הזרקת תוך פלנטר לתוך הכף האחורית הניסיונית מבלי להפריע לתאומת הכף. ואז תמונה אזור של תאים הממוקמים ממש מתחת לפני השטח plantar של הכף האחורית עם שני לייזרים. לרכוש 60 כדי 120 דקות לשגות זמן של כ 5 עד 10 פרוסות Z בערך מיקרומטר אחד לפרוסה כדי לזהות את ספיגת התא בתיווך intraplantar של LPS FITC.מכיוון שאין פלואורסצנטיות אינהרנטית על ידי התאים בתוך השכבה העורית, ניתן לראות מספר עצום של תאים בשכבה העורית של הכף האחורית לוקח LPS מתויג פלואורסצנטי לאחר הזרקת תוך פלנטר בעכבר מסוג פראי. לאחר הזרקת LPS FITC, רק חלבון ספציפי fibroblast אחד חיובי fibroblasts להביע אגרה כמו קולטן ארבע לאגד ולכבוש את החלבון מוזרק עם רמה גבוהה של לוקליזציה שיתוף עם תג עגבניות עמום טנדם לידי ביטוי על ידי תאים אלה. לעומת זאת, עכברים שיש להם אגרה כמו קולטן ארבע דפק מתוך הגוף כולו לאגד ולכבוש LPS לאחר ההזרקה.אכן, צלליות התא גלויים לאחר הזרקת LPS FITC המציין כי התרופה מתפזרת בנוזל interstitial סביב תאים, אבל הוא לא ממש להיות כבול על ידי קולטן. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בפרוטוקול זה הוא להבטיח כי הכף משותקת, כך שאין עיוותים בסרטון עקב תנועה או נשימה. באמצעות הליך זה, ניתן לעקוב אחר גיוס תאים מתויגים באופן פלואורסצנטי לאזור לאחר פציעה והשינויים המורפולוגיים בתגובת התא לגירוי לאורך זמן.אז הדמיה 2-Photon מאפשר לחוקרים לשלב עכברים כתב גנטי ותרכובות מתויגות פלואורסצנטי כדי להעריך מה קורה בבעל חיים חי לאחר זריקה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparametric מיפוי אופטי של הלב Langendorff-perfused הארנב

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

כימות של פונקציה הגלובלית הדיאסטולי על ידי ניתוח המבוסס על דוגמנות Kinematic של Transmitral זרימה באמצעות הפורמליזם מילוי Parametrized הדיאסטולי

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

נוקשה ההטמעה של קבוע, צבעונית, ככלל, דגימות מילימטר-סולם עבור היסטולוגיה ללא סעיף תלת-ממד על-ידי מיקרו-שחושב טומוגרפיה

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...