Name: in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin
Uploaded: 2019-07-11T13:30:00
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この作業は、許可 NS096030 (MDB) によってサポートされます。また、イメージングコアマネージャーVed Prakashに感謝したいと思います。また、UTダラスのオリンパス・ディスカバリー・センター/イメージング・コア施設の設備とサポートに感謝します。

動物の手順は、ダラス大学ダラス動物ケア使用委員会によって承認され、国立衛生研究所のガイドラインに従っていました。 全ての実験は、C57BL/6を背景に社内で飼育された8-12週齢の雄と雌のマウスを用いて行った。線維芽細胞特異的タンパク質-1プロモーターによって駆動されるクレ-レコンビネーゼを有するトランスジェニックマウスは、商業的に購入された(Jackson, 012641)(FSP1cre)+/お...

<ol>
	<li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system.">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li><li>Poltorak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+LPS+signaling+in+C3H/HeJ+and+C57BL/10ScCr+mice:+mutations+in+Tlr4+gene.">Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene.</a> Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).</li><li>Bhattacharyya, S., Midwood, K. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).</li><li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy.">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).</li><li>Gaigalas, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+Fluorescence+Intensity+Standards.">The Development of Fluorescence Intensity Standards.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).</li><li>Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+of+the+cellular+uptake+and+intracellular+trafficking+of+exosomes+by+live-cell+microscopy.">Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).</li><li>Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon-like+microscopy+with+orders-of-magnitude+lower+illumination+intensity+via+two-step+fluorescence.">Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence.</a> Nature Communications. 6, 8184 (2015).</li><li>Makale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended-working-distance+multiphoton+micromanipulation+microscope+for+deep-penetration+imaging+in+live+mice+and+tissue.">Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).</li></ol>

間違いなく生体内2光子イメージングの最も重要なステップは:1)マルチフォトンのセットアップと実験的なニーズ21、22のための右の遺伝的レポーターマウスと蛍光タグ付きタンパク質を選択します。2)組織23内の細胞集団の正確な表現を持つために正しい焦点面をイメージング;3)不適切に固定された動物24による動...

リポ多糖類(LPS)は、グラム陰性菌1の外膜に見出されるエンドトキシンである。LPSは、トール様受容体4(TLR4)/CD14/MD2受容体複合体2に対して高い結合親和性を有する。TLR4は、広範囲の免疫細胞、間葉系細胞、および感覚ニューロン3、4、5のサブセットの外膜上に一般的に見出されるパターン認識受容体である。免疫細胞に発現するTLR4の活性化は、MyD88依存性および独立した第2メッセンジャーシステムにつながり、核因子カッパベータ(NFκB)細胞の核への転移で終わる。これは、プロトティクス性免疫細胞がインターロイキン(IL)-1β、IL-6、およびTNF-α6などのプロトチピックサイトカインを産生し、放出する原因となる。しかし、他の細胞型がTLR4刺激にどのように反応するかは、それほど明確ではない。線維芽細胞は、癌および嚢胞性線維症などの病態の広い範囲に関与しており、最近、単球化学引き出しおよび炎症を促進する役割を果たすることが示されている7,8,9. 初期のエビデンスは、線維芽細胞(マトリックスメタロプロテイナゼス(MmP)、メタロプロテイラー酵素(TIMP)、および線維芽細胞の組織阻害剤によって放出される因子を示唆しているように、急性および慢性疼痛の発症における線維芽細胞の役割に興味を持っています。成長因子(FGF)は神経因性疼痛10に関与している。
細胞の活性化状態は、即時早期遺伝子の誘導、タンパク質発現の変化、細胞増殖、および形態変化11、12、13を含む様々な因子によって決定することができる。細胞の活性化が病理にどのように寄与するかについての疑問に答えるために存在する多くのテクニックがありますが、それらはすべて限界があります。原型的な免疫組織化学は、蛍光タグ付き抗体を使用して固定組織に目的とするタンパク質を標識するが、これは特異的でなく、多くの場合、実りある結果を得る前に重要なトラブルシューティングを必要とする14。ウェスタンブロッティングは、死後組織におけるタンパク質発現のレベルを比較する際に有用な技術である。しかし、組織学的成分はこの技術に欠けており、研究者は形態15の変化を特定することができない。RNA-Seqを使用すると、多くの場合、洞察に満ちたデータを得るサンプル中のメッセンジャーRNAの存在を定量化できます。しかし、転写と翻訳の間のギャップは、刺激16の後に時間的解決を持つことを困難にする。共焦点イメージングは、組織17の断面に存在するタンパク質の発現および共局在を決定するのに有用である。多くの場合、これは組織試料全体を代表するものではありません。対照的に、マルチフォトン顕微鏡は、ユーザーがサンプルに約1mmの深さに画像を撮ることを可能にし、包括的な3次元表現18を作成する。したがって、これらの実験から収集されたデータは、生体組織の高度にプラスチックと相互接続された微小環境とより直接的に関連しているので、我々は生体内、2光子イメージングの準備に焦点を当てることを選択します。
生体内でタンパク質受容体相互作用を研究する利点は、死後組織抽出19の有害で予測不可能な影響なしに、細胞が刺激にリアルタイムで反応する方法を明確に捕捉できることである。さらに、縦方向の研究は、活性化のために起こりう可能性のある細胞の可塑性およびプライミングを評価するために行われてもよい。 2光子イメージングを用いて、外部刺激を加えた場合の微小環境の完全性を維持します。このプロトコルは、生体内で数時間にわたって蛍光タグ付きLPSの末梢注入後の線維芽細胞中の分子の取り込みおよび線維芽細胞活性化におけるTLR4の役割を同定する方法を提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1520px;" width="1520">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:1131px;">10x PBS, 4 L</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:116px;">BP3994</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precision Glide Needle 30G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue Pad</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1420665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV30-FGR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane, USP 250 mL</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>50989-150-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3665-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MPE-RS TWIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personal Lubricant Jelly (Gel)</td>
			<td>equate</td>
			<td>ZH727 2E F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SGM-4 Stereotaxic Apparatus</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>16030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin

線維芽細胞は、活性化時に形態を変化させる間葉細胞であり、最終的にそれらが位置する組織の微小環境に影響を与える。従来のイメージング技術は、固定組織におけるタンパク質相互作用や形態の同定に役立ちますが、細胞がタンパク質を結合して取り込む速度に関する洞察を与えることができ、一度その形態がどのように変化するかを活性化することはできません。生 体内。本研究では、2つの大きな疑問を提起する:1)トール様受容体-4(TLR4)とリポ多糖(LPS)相互作用による線維芽細胞活性化の時間経過とは2)これらの細胞は一度活性化されるとどのように振る舞うのか?2光子イメージングを用いて、遺伝子レポーターマウスラインの末梢線維芽細胞に発現した覚後受容体TLR4に結合するLPS-FITCの能力を評価する新しい技術を開発した。FSP1cre;生体内のtdTomatoロックストップロックス。このユニークなアプローチにより、研究者は、タンパク質が細胞の挙動をどのように変化させるかを理解する上で、生細胞と相互作用するタンパク質の詳細なタイムラプスビデオや写真を作成することができます。

当初、野生型マウスの後足にLPS-FITCを注入し、足の真皮層に存在するすべての細胞型におけるLPS-FITCの取り込みを可視化した。野生型マウスで後足取り取りLPSの真皮層に無数の細胞を観察した(ビデオ図1,2)。LPS-FITCを注入した動物の足をイメージングする前に、真皮層に細胞の固有の蛍光がないことを明確にしたいと考えていました。これは、注射後に撮影する画像が、蛍光タグ付...

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In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

形態学的変化は、活性化後の免疫応答性線維芽細胞で起こり、細胞募集の変化を促進する。遺伝子組み換え線維芽細胞特異的タンパク質1(FSP1)-creと組み合わせて2光子イメージングを利用する。tdTomatoフロキセドストップフロキシング(TB/TB)マウスラインと緑色蛍光タグ付きリポ多糖-FITCは、真皮線維芽細胞におけるリポ多糖類の非常に特異的な取り込みおよび生体内の形態変化を示すことができる。

皮膚における遺伝的にタグ付けされたレポーター細胞の生体内2色2光子イメージング

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

私たちのプロトコルは、蛍光タグ付き細胞が生きている動物の炎症性末梢刺激にどのように反応するかをリアルタイムで視覚化することを可能にします。2-光子イメージングは、生きた標本の組織に深く可視化することを可能にし、細胞の完全性と微小環境を維持し、生物学的システムの正確な表現を提供する。呼吸は時間の経過とともに足を動かし、ぼやけたり焦点面を失う原因となる。画像を撮る前に、必ずテープでしっかりと足を固定してください。この中で、あなたは興味のある適切な平面を見つけることができる必要があり、その目的が触れることなく足に近く、注射部位の真上にあることを確認してください。手順を開始する前に、マルチフォトンシステムをオンにして、25Xの主観を選択します。立体多光子顕微鏡のステージに立体型装置を設置し、その装置を麻酔用デリバリー機に接続します。マウスの足の接続点として、装置の表面にマットブラックペーパーを置きます。512 x 512 マイクロメートルの固定スキャン領域で共振スキャナを設定します。930 および 1,100 ナノメートルの励起波長にそれぞれ緑と赤色の蛍光タンパク質信号の励起レーザーを調整します。690~1,050ナノメートルの二色光ミラーを使用して、両方の励起レーザーの光路を単一の目的に向け、930ナノメートル調整された励起レーザーをメインスキャナに反映させ、1,100ナノメートルレーザーをメインスキャナに直接通過させます。FITCのレーザーパワーを5%、緑色蛍光タンパク質を20%に設定し、オーバーヘッドライトを消します。in vivoイメージングの場合、マウスを麻酔し、テキストプロトコルで概説します。麻酔マウスのつまみつまみへの応答の欠如を確認し、鼻コーンへのアクセスを持つステレオタックス装置にマウスを置きます。黒いテープを使用して、後ろ足を関心領域に近い領域と遠位の両方の領域に黒い紙にしっかりと貼り付け、足の足底面が妨げられていないことを確認し、目的に向かって向き合います。水に基づいた潤滑剤を足の足底面にたっぷり入れます。潤滑油に対する目的をタッチして、足と目的の間に液体の列を作成します。FITC励起光を使用して足の真皮層に焦点を合わせ、タンデムダイマートマトタグ付き線維芽細胞を視覚化できることを確認します。両方のレーザーで後足の足底面のすぐ下にある細胞の領域を画像化します。1スライスあたり約1マイクロメートルで約5~10 Zの15分間の時間経過を取得し、環境のベースライン表現を確立します。ベースラインイメージングが得られたら、25マイクロリットルガラスのハミルトンシリンジに、PBSの20マイクロリットルあたりFITCコンジュゲートリポ多糖(LPS)の5マイクログラムをロードします。足の位置を乱すことなく、実験後足に足底内注射を行うことで溶液を投与する。その後、両方のレーザーで後足の足底面のすぐ下にある細胞の領域を画像化します。LPS FITCの細胞媒介性板内取り込みについて、約1マイクロメートルで約5~10Zスライスの60~120分のタイムラプスを獲得します。真皮層内の細胞によって固有の蛍光が存在しないので、後足の真皮層内の無数の細胞が野生型マウスでの板腔内注射後に蛍光タグ付きLPSを服用して観察することができる。LPS FITC注射後、受容体4のように通行料を発現する線維芽細胞の線維芽細胞の線維芽細胞は、これらの細胞によって発現されるタンデムダイマートマトタグと共局在化して高レベルの共局在化を行う線維芽細胞特異的タンパク質1個のみである。対照的に、受容体4のような通行料を持つマウスは、注射後にLPSに結合して取り込む。実際、LPS FITC注射後に細胞のシルエットが見えるのは、薬物が細胞の周りの間質液中に分散していることを示しているが、実際には受容体によって結合されていない。このプロトコルで覚えておくべきことは、動きや呼吸によるビデオの歪みがないように足が固定されていることを確認することです。この手順を使用して、傷害後の領域への蛍光タグ付き細胞の募集と、時間の経過に伴う刺激に対する細胞の応答の形態学的変化を追跡することができる。したがって、2-Photonイメージングは、研究者が注射後に生きている動物で何が起こるかを評価するために、遺伝的レポーターマウスと蛍光タグ付けされた化合物を組み合わせることを可能にします。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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