Name: in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin
Uploaded: 2019-07-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin at JoVE.com

Dette arbeidet støttes av tilskuddet NS096030 (MDB). Vi vil også gjerne takke Imaging Core Manager ved Prakash. Vi vil også gjerne takke Olympus Discovery Center/Imaging Core anlegget på UT Dallas for å tilby utstyr og støtte

Animal prosedyrer ble godkjent av The University of Texas i Dallas institusjonelle Animal Care og bruk komiteen og var i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer.  Alle eksperimenter ble utført ved hjelp av 8-12-ukers-gamle mannlige og kvinnelige mus avlet in-House på en C57BL/6 bakgrunn. Transgene-mus med grobunn-recombinase drevet av den Fibroblast protein-1 arrangøren ble kjøpt kommersielt (Jackson, 012641) (FSP1cre)+/- og krysset med tdTomatoLOX-Stop-LOX mus, også ...

<ol>
	<li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system.">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li><li>Poltorak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+LPS+signaling+in+C3H/HeJ+and+C57BL/10ScCr+mice:+mutations+in+Tlr4+gene.">Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene.</a> Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).</li><li>Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-Like+Receptor-4+Signaling+Drives+Persistent+Fibroblast+Activation+and+Prevents+Fibrosis+Resolution+in+Scleroderma.">Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma.</a> Advances in Wound Care. 6 (10), 356-369 (2017).</li><li>Wadachi, R., Hargreaves, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trigeminal+nociceptors+express+TLR-4+and+CD14:+a+mechanism+for+pain+due+to+infection.">Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection.</a> Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).</li><li>Janssens, S., Beyaert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Toll-like+receptors+in+pathogen+recognition.">Role of Toll-like receptors in pathogen recognition.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).</li><li>Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Signalling+Genetics+of+Pain,+Cognitive+Dysfunction+and+Sickness+Symptoms+in+Cancer+Pain+Patients+Treated+with+Transdermal+Fentanyl.">Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl.</a> PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).</li><li>Paish, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+Promote+Inflammation+and+Pain+via+IL-1alpha+Induction+of+the+Monocyte+Chemoattractant+Chemokine+(C-C+Motif)+Ligand+2.">Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2.</a> American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).</li><li>Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+fibroblast+growth+factor+(FGF)+signaling+in+neurological+and+psychiatric+disorders.">Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).</li><li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+chromosome+walking+and+jumping.">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).</li><li>Madiai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fibroblast+growth+factor-2+antibodies+attenuate+mechanical+allodynia+in+a+rat+model+of+neuropathic+pain.">Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).</li><li>Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Fos+and+related+immediate+early+gene+products+as+markers+of+activity+in+neuroendocrine+systems.">c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).</li><li>Ieni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+Cellular+Features+of+Innate+Immune+Reaction+in+Helicobacter+pylori+Gastritis:+A+Brief+Review.">Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+behind+targeting+fibroblast+activation+protein-expressing+carcinoma-associated+fibroblasts+as+a+novel+chemotherapeutic+strategy.">Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>Tsutsumi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGE2+signaling+through+the+EP4+receptor+on+fibroblasts+upregulates+RANKL+and+stimulates+osteolysis.">PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).</li><li>Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+in+vivo+gene+expression:+a+critical+assessment+of+the+methodology+and+associated+technologies.">Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies.</a> Gene Therapy. 11, 85-91 (2004).</li><li>Victora, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germinal+center+dynamics+revealed+by+multiphoton+microscopy+with+a+photoactivatable+fluorescent+reporter.">Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter.</a> Cell. 143 (4), 592-605 (2010).</li><li>Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+random+access+multiphoton+microscopy+for+functional+imaging+of+neuronal+activity.">Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).</li><li>Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+imaging+of+the+gastrointestinal+tract.">Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract.</a> Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).</li><li>Ruthazer, E. S., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+of+neurons+in+living+tissue:+Acquisition+and+analysis+of+time-lapse+morphological+data.">Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data.</a> Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Analysis+of+Dendritic+Cell+Development+and+Homeostasis.">In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis.</a> Science. 324 (5925), 392-397 (2009).</li><li>Barber, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).</li><li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy.">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).</li><li>Gaigalas, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+Fluorescence+Intensity+Standards.">The Development of Fluorescence Intensity Standards.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).</li><li>Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+of+the+cellular+uptake+and+intracellular+trafficking+of+exosomes+by+live-cell+microscopy.">Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).</li><li>Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+multi-lifetime+multi-color+STED+imaging+for+colocalization+analyses.">Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses.</a> Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).</li><li>Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+dorsal+root+ganglion+neurons+induces+hyperexcitability+that+is+maintained+by+increased+responsiveness+to+cAMP+and+cGMP.">Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP.</a> Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).</li><li>Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon-like+microscopy+with+orders-of-magnitude+lower+illumination+intensity+via+two-step+fluorescence.">Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence.</a> Nature Communications. 6, 8184 (2015).</li><li>Makale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended-working-distance+multiphoton+micromanipulation+microscope+for+deep-penetration+imaging+in+live+mice+and+tissue.">Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).</li></ol>

Uten tvil de viktigste trinnene i in vivo 2-Foton Imaging er: 1) velge riktig genetisk reporter mus og fluorescensmerkete-Tagged protein for multi-Foton oppsett og eksperimentelle behov21,22; 2) Imaging riktig fokalplanet for å ha en nøyaktig representasjon av bestanden av celler i vevet23; 3) minimere bevegelse på grunn av en ukorrekt immobilisert dyr24; og 4) velge når du skal analysere data kvalitativt vs kva...

Lipopolysakkarid (LPS) er en endotoksin funnet i den ytre membran av gram-negative bakterier1. LPS har en høy binding affinitet for toll-lignende reseptor 4 (TLR4)/CD14/MD2 reseptor kompleks2. TLR4 er et mønster anerkjennelse reseptor vanligvis finnes på den ytre membran av et bredt spekter av immunceller, mesenchymal celler, og en undergruppe av sensoriske neurons3,4,5. Aktivering av TLR4 uttrykt på immunceller fører til MyD88-avhengige og uavhengige andre Messenger-systemer, som slutter med kjernefysiske-faktor Kappa beta (NFκB) translokasjon til kjernen i cellen. Dette fører til prototypic immun celle til å produsere og løslate Pro-inflammatorisk cytokiner som interleukin (IL) -1 β, IL-6, og TNF-α6. Men hvordan andre celle-typer reagerer på TLR4 stimulering er ikke så klart. Fibroblaster har vært innblandet i et bredt spekter av sykdommer som kreft og cystisk fibrose og har nylig blitt vist å spille en rolle monocytt kjemoterapi-attraksjon og fremme betennelse7,8,9.  Vår Lab er interessert i rollen som fibroblaster i utviklingen av akutte og kroniske smerter, som tidlige bevis tyder på at faktorer utgitt av fibroblaster (Matrix metalloproteinases (MMPs), vev inhibitor av metalloproteinases (TIMPs), og Fibroblast vekstfaktorer (FGFs)) er involvert i nevropatisk smerte10.
Aktivering tilstander av celler kan bestemmes av en rekke faktorer som inkluderer: induksjon av umiddelbare-tidlige gener, endret protein uttrykk, celle spredning, og morfologiske endringer11,12,13. Det er mange teknikker som finnes for å svare på spørsmål vi kan ha om hvordan aktivering av celler bidrar til patologi, men de har alle sine begrensninger. Prototypiske immunhistokjemi bruker fluorescensmerkete merket antistoffer for å merke proteiner av interesse i fast vev, som kan være løs og ofte krever betydelig feilsøking før gir fruktbare resultater14. Vestlig blotting er en nyttig teknikk for å sammenlikne nivåer av protein uttrykk i etter obduksjon vev; men den histologiske komponenten mangler i denne teknikken, og forskerne er ikke i stand til å identifisere eventuelle endringer i morfologi15. RNA-SEQ tillater oss å kvantifisere tilstedeværelsen av Messenger RNA i en prøve som i mange tilfeller gir innsiktsfulle data; men gapet mellom transkripsjon og oversettelse gjør det vanskelig å ha Temporal resolusjon etter en stimulans16. Konfokalmikroskopi Imaging er nyttig for å bestemme uttrykket og co-lokalisering av proteiner som finnes i et tverrsnitt av vev17. Ofte er dette ikke representativt for helheten av vevsprøven. I kontrast, multiphoton mikroskop tillate brukere å bildet omtrent 1 mm dypt inn i en prøve, og skaper en omfattende tredimensjonal representasjon18. Derfor velger vi å fokusere på in vivo, 2-Foton Imaging forbereder, som data samlet inn fra disse eksperimentene er mer direkte relatable til svært plast og sammenhengende mikromiljøet av levende vev.
En fordel med å studere protein-reseptor interaksjoner in vivo er at vi kan tydelig fange hvordan cellene reagerer på en stimulans, i sanntid, i sitt eget miljø uten skadelig og uforutsigbar påvirkning av etter obduksjon vev utvinning19. I tillegg kan langsgående studier utføres for å vurdere mobilnettet plastisitet og grunning som kan oppstå på grunn av aktivering.  Ved hjelp av 2-Foton Imaging, bevarer vi integriteten til mikromiljøet stede når en ekstern stimulans brukes. Denne protokollen gir en måte å identifisere opptak av molekyler i fibroblaster etter perifer injeksjon av fluorescensmerkete merket LPS i løpet av flere timer i vivo og rollen til TLR4 i Fibroblast aktivering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1520px;" width="1520">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:1131px;">10x PBS, 4 L</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:116px;">BP3994</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precision Glide Needle 30G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue Pad</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1420665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV30-FGR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane, USP 250 mL</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>50989-150-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3665-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MPE-RS TWIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personal Lubricant Jelly (Gel)</td>
			<td>equate</td>
			<td>ZH727 2E F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SGM-4 Stereotaxic Apparatus</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>16030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin

Fibroblaster er mesenchymal celler som endrer sin morfologi ved aktivering, til slutt påvirke mikromiljøet av vevet de befinner seg i. Selv om tradisjonelle Imaging teknikker er nyttige i å identifisere protein interaksjoner og morfologi i fast vev, de er ikke i stand til å gi innsikt om hvor raskt celler er i stand til å binde og opptak proteiner, og en gang aktivert hvordan deres morfologi endringer i Vivo. I denne studien, spør vi to store spørsmål: 1) Hva er tiden-løpet av Fibroblast aktivisering via toll-lignende reseptor-4 (TLR4) og lipopolysakkarid (LPS) samhandling og 2) Hvordan oppfører disse cellene en gang aktivert? Ved hjelp av 2-Foton Imaging, har vi utviklet en ny teknikk for å vurdere evnen til LPS-FITC å binde til sin beslektet reseptor, TLR4, uttrykt på perifere fibroblaster i genetisk reporter muse linje; FSP1cre; tdTomatoLOX-Stop-LOX in vivo. Denne unike tilnærmingen gjør det mulig for forskere å lage inngående, time-lapse videoer og/eller bilder av proteiner i samspill med levende celler som gjør det mulig å ha en økt nivå av kornethet i å forstå hvordan proteiner kan endre cellulære atferd.

Først injisert vi LPS-FITC i bak-labben av vill-type mus for å visualisere opptaket av LPS-FITC i alle celletyper til stede i dermal laget av labben. Etter å ha observert en myriade av celler i dermal laget av bak-labb opptak fluorescensmerkete-merket LPS i en vill type mus (video figur 1, 2), prøvde vi å spesifikt målrette fibroblaster som de er et hovedfokus i forskningen vår. Før Imaging poter av dyr injisert med LPS-FITC vi ønsket å være klart at det ikke er iboende fluorescens av celler i...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin at JoVE.com

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Morfologiske endringer skjer i immunrespons Fibroblast celler etter aktivering og fremme endringer i mobilnettet rekruttering. Bruk av 2-Foton Imaging i forbindelse med en genetisk konstruert Fibroblast-spesifikt protein 1 (FSP1)-grobunn; tdTomato floxed-Stop-floxed (TB/TB) muse linje og grønn fluorescensmerkete merket LIPOPOLYSAKKARID-FITC, kan vi illustrere svært spesifikke opptak av lipopolysakkarid i dermal fibroblaster og morfologiske endringer i vivo.

In vivo to-Color 2-Foton Imaging av genetisk-Tagged reporter celler i huden

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Vår protokoll tillater oss å visualisere hvordan fluorescerende merkede celler reagerer på en inflammatorisk perifer stimulans i et levende dyr i sanntid. 2-Foton-bildebehandling tillater visualisering dypt inn i vevet til en levende prøve, bevare integriteten til cellene og deres mikromiljø og gi en nøyaktig representasjon av det biologiske systemet. Pusten beveger poten over tid, forårsaker uskarphet og tap av fokalplanet.Pass på å feste poten godt med tape til en stabil overflate før avbildning. I dette må du være i stand til å finne passende fly av interesse, sørg for at målet er nær poten uten å berøre og er rett over injeksjonsstedet. Før du starter prosedyren, må du slå på multi-foton-systemet og velge 25X subjektiv.Plasser et stereotoksisk apparat på scenen av multi-fotonmikroskopet og koble apparatet til en anestesileveringsmaskin. Plasser et stykke matt svart papir på overflaten av apparatet som et koblingspunkt for musepoten. Angi resonansskanneren med et fast skanneområde på 512 med 512 mikrometer.Still inn eksitasjonslaserne til henholdsvis 930 og 1100 nanometer eksitasjonsbølgelengder for henholdsvis grønne og røde fluorescerende proteinsignaler. Bruk et dichroic speil på 690 til 1, 050 nanometer for å lede lysbanen til begge eksitasjonslasere til enkeltmål slik at 930 nanometer innstilt eksitasjonslaser skal reflekteres til hovedskanneren og 1, 100 nanometer innstilt laser å passere direkte inn i hovedskanneren. Sett deretter laserkraften til FITC til 5 %, og grønt fluorescerende protein til 20 %, og slå av luftlysene.For in vivo-bildebehandling, bedøve musen og skissert i tekstprotokollen. Bekreft mangel på respons på tåklemme i den bedøvede musen og plasser musen i det stereotoksiske apparatet med tilgang til en nesekjegle. Bruk svart tape til å feste bakpoten godt til det svarte papiret på områder som er både proksimale og distale for interesseområdet, og pass på at potens plantaroverflate er uhindret og vender opp mot målet.Legg en sjenerøs mengde vannbasert smøremiddel på potens plantaroverflate. Trykk på målet til smøremiddelet for å lage en kolonne med væske mellom poten og målet. Bruk FITC-eksitasjonslyset til å fokusere inn i det dermale laget på poten, og bekrefter at tandemdyderen Tomatmerket fibroblaster kan visualiseres.Bilde området av celler som ligger like under plantar overflaten av bakpoten med begge lasere. Få en 15 minutters tidsforløp på omtrent fem til 10 Z-skiver på omtrent ett mikrometer per skive for å etablere en grunnlinjerepresentasjon av miljøet. Når baseline imaging er oppnådd, laste en 25 mikroliter glass Hamilton sprøyte med fem mikrogram FITC konjugert lipopolysakkarid, eller LPS, per 20 mikroliter pbs.Administrer oppløsningen ved intraplantarinjeksjon i den eksperimentelle bakpoten uten å forstyrre poteposisjonen. Deretter bilde et område av celler som ligger like under plantar overflaten av bakpoten med begge lasere. Få en 60 til 120 minutters tidsforløp på omtrent fem til 10 Z-skiver på omtrent ett mikrometer per skive for å identifisere cellemediert intraplantaropptak av LPS FITC.Siden det ikke er noen iboende fluorescens av cellene i det dermale laget, kan en myriade av celler i det dermale laget av bakpoten observeres å ta fluorescerende merkede LPS etter intraplantarinjeksjon i en vill type mus. Etter LPS FITC injeksjon, bare fibroblast spesifikt protein en positiv fibroblasts uttrykker toll som reseptor fire bind og opptak injisert protein med et høyt nivå av co-lokalisering med en tandem dimer Tomato tag uttrykt av disse cellene. I motsetning, mus som har toll som reseptor fire slått ut av hele kroppen ikke binde og opptak LPS etter injeksjon.Faktisk er cellesilhuetter synlige etter LPS FITC-injeksjon som indikerer at stoffet sprer seg i interstitiell væske rundt celler, men er faktisk ikke bundet av en reseptor. Det viktigste å huske i denne protokollen er å sikre at potens immobiliserte slik at det ikke er noen forvrengninger i videoen på grunn av bevegelse eller åndedrett. Ved hjelp av denne prosedyren kan rekrutteringen av fluorescerende merkede celler til et område etter skade og de morfologiske endringene i en celles respons på en stimulans over tid spores.Så 2-Photon imaging tillater forskere å kombinere genetiske reporter mus og fluorescerende merkede forbindelser for å vurdere hva som skjer i et levende dyr etter en injeksjon.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanopartikler for<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

En Full huddefekt modell for å evaluere vaskularisering av biomaterialer<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantifisering av Global diastolisk funksjon av Kinetisk modellering basert analyse av transmitral Flow via Parametrized diastolisk Fylling formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av en Tredimensjonal Full Tykkelse hudekvivalent og Automated såret

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier av lungekreft celler ved hjelp av en Multichannel Dual-elektrisk-felt microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Stive innebygging av fast og farget, hele, Millimeter skala prøver for delen-gratis 3D Histology av mikro-beregnet tomografi

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...