Name: in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin
Uploaded: 2019-07-11T13:30:00
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Este trabajo es apoyado por la subvención NS096030 (MDB). También nos gustaría dar las gracias al gerente central de imágenes Ved Prakash. También nos gustaría agradecer a las instalaciones de Olympus Discovery Center/Imaging Core en UT Dallas por proporcionar equipo y apoyo

Los procedimientos de animales fueron aprobados por la Universidad de Texas en el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Dallas y fueron de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud.  Todos los experimentos se realizaron utilizando ratones machos y hembras de 8-12 semanas de edad criados internamente sobre un fondo C57BL/6. Los ratones transgénicos con cre-recombinas impulsados por el promotor de proteínas-1 específicos de fibroblastos fueron comprados comercialmente (J...

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Podría decirse que los pasos más importantes de la imagen in vivo de 2 fotones son: 1) Elegir el ratón reportero genético adecuado y proteína etiquetada fluorescentemente para la configuración de varios fotones y las necesidades experimentales21,22; 2) tomar imágenes del plano focal correcto para tener una representación precisa de la población de células en el tejido23; 3) minimizar el movimiento debido a un animal inmovilizado ...

El lipopolisacárido (LPS) es una endotoxina que se encuentra en la membrana externa de las bacterias gramnegativas1. LPS tiene una alta afinidad de unión para el receptor de peaje 4 (TLR4)/CD14/MD2 complejo receptor2. TLR4 es un receptor de reconocimiento de patrones comúnmente encontrado en la membrana externa de una amplia gama de células inmunitarias, células mesenquimales, y un subconjunto de neuronas sensoriales3,4,5. La activación de TLR4 expresada en las células inmunitarias conduce a sistemas de segundo mensajero independientes y dependientes de MyD88, terminando con la translocación de kappa beta (NF-B) de factor nuclear al núcleo de la célula. Esto hace que la célula inmune prototípica produzca y libere citoquinas proinflamatorias como Interleucina (IL)-1o, IL-6, y TNF-6 . Sin embargo, la forma en que otros tipos de células responden a la estimulación TLR4 no es tan clara. Los fibroblastos se han implicado en una amplia gama de patologías como cánceres y fibrosis quística y recientemente se ha demostrado que desempeñan un papel monocitos quimioatracción y promover la inflamación7,8,9.  Nuestro laboratorio está interesado en el papel de los fibroblastos en el desarrollo del dolor agudo y crónico, como la evidencia temprana sugiere que los factores liberados por los fibroblastos (metaloproteinasas de matriz (MMP), inhibidor del tejido de las metaloproteinasas (TimOP), y fibroblastos factores de crecimiento (FMG)) están involucrados en el dolor neuropático10.
Los estados de activación de las células pueden determinarse por una variedad de factores que incluyen: inducción de genes inmediatos-tempranos, expresión de proteínas alterada, proliferación celular y cambios morfológicos11,12,13. Hay muchas técnicas que existen para responder preguntas que podemos tener sobre cómo la activación de las células contribuye a las patologías, pero todas tienen sus limitaciones. La inmunohistoquímica prototípica utiliza anticuerpos etiquetados fluorescentemente para etiquetar proteínas de interés en el tejido fijo, que pueden ser inespecíficos y a menudo requieren una solución de problemas significativa antes de producir resultados fructíferos14. La hinchazón occidental es una técnica útil cuando se comparan los niveles de expresión de proteínas en el tejido post mortem; sin embargo, el componente histológico carece de esta técnica y los investigadores son incapaces de identificar cualquier cambio en la morfología15. RNA-Seq nos permite cuantificar la presencia de ARN mensajero en una muestra que en muchos casos produce datos perspicaces; sin embargo, la brecha entre la transcripción y la traducción hace que sea difícil tener resolución temporal después de un estímulo16. La imagen confocal es útil para determinar la expresión y la colocalización de las proteínas que existen en una sección transversal de los tejidos17. A menudo, esto no es representativo de la totalidad de la muestra de tejido. Por el contrario, los microscopios multifotón permiten a los usuarios crear imágenes de aproximadamente 1 mm de profundidad en una muestra, creando una representación tridimensional completa18. Por lo tanto, elegimos centrarnos en las preparaciones de imágenes in vivo, 2 fotónes, ya que los datos recopilados de estos experimentos son más directamente relacionados con el microambiente altamente plástico e interconectado del tejido vivo.
Una ventaja de estudiar las interacciones proteína-receptor in vivo es que podemos capturar claramente cómo las células responden a un estímulo, en tiempo real, en su entorno nativo sin la influencia dañina e impredecible de la extracción de tejido post mortem19. Además, se pueden realizar estudios longitudinales para evaluar la plasticidad celular y el cebado que puede ocurrir debido a la activación.  Mediante el uso de imágenes de 2 fotones, preservamos la integridad del microambiente presente cuando se aplica un estímulo externo. Este protocolo proporciona una manera de identificar la absorción de moléculas en fibroblastos después de la inyección periférica de LPS etiquetado fluorescentemente en el transcurso de varias horas in vivo y el papel de TLR4 en la activación de fibroblastos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1520px;" width="1520">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:1131px;">10x PBS, 4 L</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:116px;">BP3994</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precision Glide Needle 30G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue Pad</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1420665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV30-FGR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane, USP 250 mL</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>50989-150-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3665-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MPE-RS TWIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personal Lubricant Jelly (Gel)</td>
			<td>equate</td>
			<td>ZH727 2E F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SGM-4 Stereotaxic Apparatus</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>16030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin

Los fibroblastos son células mesenquimales que cambian su morfología al activarse, influyendo en última instancia en el microambiente del tejido en el que se encuentran. Aunque las técnicas tradicionales de diagnóstico por imágenes son útiles para identificar las interacciones proteicas y la morfología en el tejido fijo, no son capaces de dar una idea de la rapidez con la que las células son capaces de unir y tomar proteínas, y una vez que se activó cómo cambia su morfología en vivo. En el presente estudio, hacemos 2 preguntas principales: 1) ¿cuál es el curso de tiempo de activación de fibroblastos a través de la interacción de receptor-4 (TLR4) y lipopolisacárido (LPS) y 2) ¿cómo se comportan estas células una vez activadas? Utilizando imágenes de 2 fotones, hemos desarrollado una técnica novedosa para evaluar la capacidad de LPS-FITC para unirse a su receptor cognado, TLR4, expresado en fibroblastos periféricos en la línea de ratón reportero genético; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox in vivo. Este enfoque único permite a los investigadores crear videos en profundidad y lapso de tiempo y/o imágenes de proteínas que interactúan con células vivas que permiten tener un mayor nivel de granularidad para entender cómo las proteínas pueden alterar el comportamiento celular.

Inicialmente, inyectamos LPS-FITC en la pata trasera de ratones de tipo salvaje con el fin de visualizar la aceptación de LPS-FITC en todos los tipos de células presentes en la capa dérmica de la pata. Después de haber observado una miríada de células en la capa dérmica de la absorción de la pata trasera con etiqueta fluorescente LPS en un ratón de tipo salvaje (Video Figura 1, 2), tratamos de apuntar específicamente a los fibroblastos, ya que son un foco principal en nuestra investigación. An...

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In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Los cambios morfológicos ocurren en las células de fibroblastos inmune sensibles después de la activación y promueven alteraciones en el reclutamiento celular. Utilización de imágenes de 2 fotones junto con una proteína específica de fibroblastos de ingeniería genética 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) línea de ratón y verde fluorescently etiquetado lipopolysaccharide-FITC, podemos ilustrar la absorción altamente específica de lipopolisacárido en fibroblastos dérmicos y cambios morfológicos in vivo.

In Vivo 2-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Nuestro protocolo nos permite visualizar cómo las células etiquetadas fluorescentemente responden a un estímulo periférico inflamatorio en un animal vivo en tiempo real. Las imágenes de 2 fotones permiten la visualización profunda en el tejido de una muestra viva, preservando la integridad de sus células y su microambiente y proporcionando una representación precisa del sistema biológico. Respirar mueve la pata con el tiempo, causando borrosidad y una pérdida del plano focal.Asegúrese de colocar la pata firmemente con cinta adhesiva en una superficie estable antes de tomar imágenes. En esto usted debe ser capaz de encontrar el plano de interés adecuado, asegúrese de que el objetivo está cerca de la pata sin tocar y está directamente por encima del sitio de inyección. Antes de comenzar el procedimiento, encienda el sistema multi-fotones y seleccione el subjetivo 25X.Coloque un aparato estereotaxico en el escenario del microscopio multitónico y conecte el aparato a una máquina de administración de anestesia. Coloque un pedazo de papel negro mate sobre la superficie del aparato como punto de conexión para la pata del ratón. Ajuste el escáner de resonancia con un área de escaneo fija de 512 por 512 micrómetros.Ajuste los láseres de excitación a las longitudes de onda de excitación de 930 y 1, 100 nanómetros para señales de proteína fluorescente verde y roja respectivamente. Utilice un espejo dicroico de 690 a 1.050 nanómetros para dirigir la trayectoria de luz de ambos láseres de excitación al objetivo único, lo que permite que el láser de excitación sintonizado de 930 nanómetros se refleje en el escáner principal y el láser de 100 nanómetros sintonizado pase directamente al escáner principal. A continuación, ajuste la potencia láser de FITC al 5% y la proteína fluorescente verde al 20% y apague las luces aéreas.Para imágenes in vivo, anestesar el ratón y esbozar en el protocolo de texto. Confirme la falta de respuesta al pellizco en el ratón anestesiado y coloque el ratón en el aparato estereotaxio con acceso a un cono nasal. Utilice cinta negra para fijar firmemente la pata trasera a la pieza de papel negro en áreas tanto proximales como distales en el área de interés, asegurándose de que la superficie plantar de la pata esté sin obstrucciones y mirando hacia arriba hacia el objetivo.Coloque una cantidad generosa de lubricante a base de agua sobre la superficie plantar de la pata. Toque el objetivo al lubricante para crear una columna de líquido entre la pata y el objetivo. Utilice la luz de excitación FITC para enfocarse en la capa dérmica de la pata, confirmando que se pueden visualizar los fibroblastos etiquetados con dimer tándem Tomate.Imagen del área de celdas situada justo debajo de la superficie plantar de la pata trasera con ambos láseres. Adquiera un lapso de tiempo de 15 minutos de aproximadamente cinco a 10 rodajas Z a aproximadamente un micrómetro por rebanada para establecer una representación de línea de base del entorno. Cuando se haya obtenido la imagen basal, cargue una jeringa Hamilton de vidrio de 25 microlitros con cinco microgramos de lipopolisacárido conjugado FITC, o LPS, por cada 20 microlitros de PBS.Administrar la solución mediante inyección intraplantar en la pata trasera experimental sin alterar la posición de la pata. A continuación, imagine un área de celdas situada justo debajo de la superficie plantar de la pata trasera con ambos láseres. Adquiera un lapso de tiempo de 60 a 120 minutos de aproximadamente cinco a 10 rodajas Z a aproximadamente un micrómetro por rebanada para identificar la captación intraplantar mediada por célula de LPS FITC.Como no hay fluorescencia inherente por las células dentro de la capa dérmica, una miríada de células en la capa dérmica de la pata trasera se puede observar tomando LPS etiquetada fluorescentemente después de la inyección intraplantar en un ratón de tipo comodín. Después de la inyección de LPS FITC, sólo fibroblastos de proteína específica de fibroblastos un fibroblastos positivos que expresan peaje como receptor cuatro se unen y captan la proteína inyectada con un alto nivel de co-localización con una etiqueta de tomate dimer en tándem expresada por estas células. Por el contrario, los ratones que tienen peaje como receptor cuatro noqueados fuera de todo el cuerpo no se unen y captan LPS después de la inyección.De hecho, las siluetas celulares son visibles después de la inyección de LPS FITC que indica que el fármaco se está dispersando en el líquido intersticial alrededor de las células, pero en realidad no está siendo unido por un receptor. Lo más importante a recordar en este protocolo es asegurarse de que la pata está inmovilizada para que no haya distorsiones en el video debido al movimiento o la respiración. Mediante este procedimiento, se puede realizar un seguimiento del reclutamiento de células etiquetadas fluorescentemente en un área después de una lesión y los cambios morfológicos en la respuesta de una célula a un estímulo a lo largo del tiempo.Así que las imágenes de 2-Photon permiten a los investigadores combinar ratones reporteros genéticos y compuestos con etiquetas fluorescentes para evaluar lo que sucede en un animal vivo después de una inyección.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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