Name: in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin
Uploaded: 2019-07-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin at JoVE.com

Detta arbete stöds av Grant NS096030 (MDB). Vi skulle också vilja tacka Imaging Core Manager ved Prakash. Vi skulle också vilja tacka Olympus Discovery Center/Imaging Core facility på UT Dallas för att tillhandahålla utrustning och support

Djurförsök godkändes av University of Texas vid Dallas institutionella djuromsorg och användning kommitté och var i enlighet med National Institutes of Health riktlinjer.  Alla experiment utfördes med 8-12-veckors gamla manliga och kvinnliga möss bred in-House på en C57BL/6 bakgrund. Transgena möss med CRE-driver drivs av fibroblast-specifika protein-1 promotorn köptes kommersiellt (Jackson, 012641) (FSP1cre)+/- och korsas med tdtomatoLOX-Stop-LOX möss, även köpt kommersiellt ...

<ol>
	<li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system.">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li><li>Poltorak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+LPS+signaling+in+C3H/HeJ+and+C57BL/10ScCr+mice:+mutations+in+Tlr4+gene.">Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene.</a> Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).</li><li>Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-Like+Receptor-4+Signaling+Drives+Persistent+Fibroblast+Activation+and+Prevents+Fibrosis+Resolution+in+Scleroderma.">Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma.</a> Advances in Wound Care. 6 (10), 356-369 (2017).</li><li>Wadachi, R., Hargreaves, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trigeminal+nociceptors+express+TLR-4+and+CD14:+a+mechanism+for+pain+due+to+infection.">Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection.</a> Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).</li><li>Janssens, S., Beyaert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Toll-like+receptors+in+pathogen+recognition.">Role of Toll-like receptors in pathogen recognition.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).</li><li>Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Signalling+Genetics+of+Pain,+Cognitive+Dysfunction+and+Sickness+Symptoms+in+Cancer+Pain+Patients+Treated+with+Transdermal+Fentanyl.">Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl.</a> PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).</li><li>Paish, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+Promote+Inflammation+and+Pain+via+IL-1alpha+Induction+of+the+Monocyte+Chemoattractant+Chemokine+(C-C+Motif)+Ligand+2.">Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2.</a> American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).</li><li>Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+fibroblast+growth+factor+(FGF)+signaling+in+neurological+and+psychiatric+disorders.">Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).</li><li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+chromosome+walking+and+jumping.">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).</li><li>Madiai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fibroblast+growth+factor-2+antibodies+attenuate+mechanical+allodynia+in+a+rat+model+of+neuropathic+pain.">Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).</li><li>Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Fos+and+related+immediate+early+gene+products+as+markers+of+activity+in+neuroendocrine+systems.">c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).</li><li>Ieni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+Cellular+Features+of+Innate+Immune+Reaction+in+Helicobacter+pylori+Gastritis:+A+Brief+Review.">Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+behind+targeting+fibroblast+activation+protein-expressing+carcinoma-associated+fibroblasts+as+a+novel+chemotherapeutic+strategy.">Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).</li><li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice.">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medicine &amp; Science. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>Tsutsumi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGE2+signaling+through+the+EP4+receptor+on+fibroblasts+upregulates+RANKL+and+stimulates+osteolysis.">PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).</li><li>Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+in+vivo+gene+expression:+a+critical+assessment+of+the+methodology+and+associated+technologies.">Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies.</a> Gene Therapy. 11, 85-91 (2004).</li><li>Victora, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germinal+center+dynamics+revealed+by+multiphoton+microscopy+with+a+photoactivatable+fluorescent+reporter.">Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter.</a> Cell. 143 (4), 592-605 (2010).</li><li>Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+random+access+multiphoton+microscopy+for+functional+imaging+of+neuronal+activity.">Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).</li><li>Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+imaging+of+the+gastrointestinal+tract.">Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract.</a> Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).</li><li>Ruthazer, E. S., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+of+neurons+in+living+tissue:+Acquisition+and+analysis+of+time-lapse+morphological+data.">Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data.</a> Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).</li><li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Analysis+of+Dendritic+Cell+Development+and+Homeostasis.">In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis.</a> Science. 324 (5925), 392-397 (2009).</li><li>Barber, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).</li><li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy.">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).</li><li>Gaigalas, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+Fluorescence+Intensity+Standards.">The Development of Fluorescence Intensity Standards.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).</li><li>Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+of+the+cellular+uptake+and+intracellular+trafficking+of+exosomes+by+live-cell+microscopy.">Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).</li><li>Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+multi-lifetime+multi-color+STED+imaging+for+colocalization+analyses.">Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses.</a> Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).</li><li>Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+dorsal+root+ganglion+neurons+induces+hyperexcitability+that+is+maintained+by+increased+responsiveness+to+cAMP+and+cGMP.">Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP.</a> Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).</li><li>Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon-like+microscopy+with+orders-of-magnitude+lower+illumination+intensity+via+two-step+fluorescence.">Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence.</a> Nature Communications. 6, 8184 (2015).</li><li>Makale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended-working-distance+multiphoton+micromanipulation+microscope+for+deep-penetration+imaging+in+live+mice+and+tissue.">Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).</li></ol>

Förmodligen de viktigaste stegen i in vivo 2-Photon Imaging är: 1) att välja rätt genetisk reporter mus och fluorescently-märkta protein för multi-Photon setup och experimentella behov21,22; 2) avbildning av rätt fokalplan för att få en korrekt representation av populationen av celler i vävnaden23; 3) minimera rörelse på grund av ett felaktigt immobiliserat djur24; och 4) välja när data ska analyseras ...

Lipopolysackarid (LPS) är ett endotoxin som finns i det yttre membranet av gramnegativa bakterier1. LPS har en hög bindningsaffinitet för den avgiftsbelagda receptor 4 (TLR4)/CD14/MD2 receptor Complex2. TLR4 är ett mönsterigenkänning receptor vanligt förekommande på det yttre membranet i ett brett spektrum av immunceller, mesenkymala celler, och en delmängd av sensoriska nervceller3,4,5. Aktivering av TLR4 uttrycks på immunceller leder till MyD88-beroende och oberoende andra Messenger-system, slutar med nukleär faktor kappa beta (nfκb) flyttning till kärnan av cellen. Detta orsakar vänlighet immunceller att producera och släppa pro-inflammatoriska cytokiner såsom interleukin (Il) -1 β, IL-6, och TNF-α6. Hur andra celltyper reagerar på TLR4 stimulering är dock inte lika tydlig. Fibroblaster har varit inblandade i ett brett spektrum av patologier såsom cancer och cystisk fibros och har nyligen visat sig spela en roll monocyt chemo-attraktion och främja inflammation7,8,9.  Vårt labb är intresserad av rollen av fibroblaster i utvecklingen av akut och kronisk smärta, som tidiga belägg tyder på att faktorer som frigörs genom fibroblaster (Matrix metalloproteinaser (MMPs), vävnads hämmare av metalloproteinaser (TIMPs), och fibroblast tillväxtfaktorer (FGFs)) är involverade i neuropatisk smärta10.
Aktiveringstillstånd av celler kan bestämmas av en mängd faktorer som inkluderar: induktion av omedelbara tidiga gener, förändrat proteinuttryck, cellproliferation, och morfologiska förändringar11,12,13. Det finns många tekniker som finns för att besvara frågor vi kan ha om hur aktivering av celler bidrar till patologier, men de har alla sina begränsningar. Prototypiska immunohistokemi använder fluorescerande märkta antikroppar för att märka proteiner av intresse för fast vävnad, som kan vara ospecifik och ofta kräver betydande felsökning innan ger fruktbara resultat14. Western blotting är en användbar teknik när man jämför nivåer av proteinuttryck i post-mortem vävnad; den histologiska komponenten saknas dock i denna teknik och forskarna kan inte identifiera några förändringar i morfologin15. RNA-SEQ tillåter oss att kvantifiera närvaron av Messenger-RNA i ett prov som i många fall ger insiktsfulla data; men klyftan mellan transkription och översättning gör det svårt att ha temporala upplösning efter en stimulans16. Konfokal avbildning är användbart vid bestämning av uttryck och samlokalisering av proteiner som finns i ett tvärsnitt av vävnader17. Ofta är detta inte representativt för hela vävnadsprovet. Multifotonmikroskop gör det däremot möjligt för användare att avbilda ungefär 1 mm djupt in i ett prov, vilket skapar en omfattande tredimensionell representation18. Därför väljer vi att fokusera på in vivo, 2-Photon Imaging Preps, som data som samlats in från dessa experiment är mer direkt relatable till mycket plast och sammankopplade mikromiljö av levande vävnad.
En fördel med att studera protein receptor interaktioner in vivo är att vi tydligt kan fånga hur celler reagerar på en stimulans, realtid, i sin egen miljö utan den skadliga och oförutsägbara påverkan av post-mortem vävnad utvinning19. Dessutom kan longitudinella studier utföras för att bedöma cellulär plasticitet och priming som kan uppstå på grund av aktivering.  Med hjälp av 2-Photon Imaging, bevarar vi integriteten i den mikromiljö som finns när en extern stimulans tillämpas. Detta protokoll ger ett sätt att identifiera upptaget av molekyler i fibroblaster efter perifer injektion av Fluorescent märkta LP-skivor under loppet av flera timmar in vivo och rollen av TLR4 i fibroblast aktivering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1520px;" width="1520">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:1131px;">10x PBS, 4 L</td>
			<td style="width:185px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:116px;">BP3994</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Precision Glide Needle 30G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blue Pad</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1420665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV30-FGR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane, USP 250 mL</td>
			<td>Vedco</td>
			<td>50989-150-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3665-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MPE-RS TWIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XWMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Personal Lubricant Jelly (Gel)</td>
			<td>equate</td>
			<td>ZH727 2E F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SGM-4 Stereotaxic Apparatus</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>16030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-color 2-photon imaging of genetically-tagged reporter cells in the skin

Fibroblaster är mesenkymala celler som ändrar sin morfologi vid aktivering, i slutändan påverkar mikromiljön i vävnaden de är placerade i. Även om traditionella avbildningstekniker är användbara för att identifiera proteininteraktioner och morfologi i fast vävnad, de kan inte ge insikt om hur snabbt celler kan binda och upptag proteiner, och en gång aktiverat hur deras morfologi förändringar i Vivo. I den nuvarande studien, frågar vi 2 stora frågor: 1) Vad är tiden-loppet av fibroblast aktivering via Toll-liknande receptor-4 (TLR4) och lipopolysackarid (LPS) interaktion och 2) hur dessa celler beter sig när aktiverad? Med hjälp av 2-Photon Imaging, har vi utvecklat en ny teknik för att bedöma förmågan hos LPS-FITC att binda till sin besläktat receptor, TLR4, uttryckt på perifera fibroblaster i den genetiska reporter mus linjen; FSP1cre; tdTomatoLOX-stopp-LOX in vivo. Detta unika tillvägagångssätt gör det möjligt för forskare att skapa djupgående, tidsfördröjd video och/eller bilder av proteiner som interagerar med levande celler som gör att man kan ha en ökad nivå av granularitet i förståelsen av hur proteiner förändrar cellernas beteende.

Inledningsvis injicerade vi LPS-FITC i Hind-Paw av Wild-typ möss för att visualisera upptaget av LPS-FITC i alla celltyper som finns i dermal skiktet av tass. Efter att ha observerat en myriad av celler i dermal skikt av hind Paw upptag Fluorescent-märkta LP-skivor i en vild typ mus (video bild 1, 2), försökte vi att specifikt rikta fibroblaster eftersom de är ett primärt fokus i vår forskning. Före avbildning av tassar av djur injiceras med LPS-FITC vi ville vara tydlig att det inte finns någo...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin at JoVE.com

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Morfologiska förändringar sker i immun responsiva fibroblastceller efter aktivering och främja förändringar i cellulära rekrytering. Använda 2-Photon Imaging i samband med en genetiskt modifierade fibroblast-specifika protein 1 (FSP1)-CRE; tdTomato floxed-Stop-floxed (TB/TB) mus linje och grön Fluorescent taggade lipopolysackarid-FITC, vi kan illustrera mycket specifik upptag av lipopolysackarid i dermal fibroblaster och morfologiska förändringar in vivo.

In vivo tvåfärgad 2-Photon Imaging av genetiskt märkta reporter celler i huden

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Vårt protokoll tillåter oss att visualisera hur fluorescerande taggade celler svarar på en inflammatorisk perifer stimulans i ett levande djur i realtid. 2-Photon imaging tillåter visualisering djupt in i vävnaden hos ett levande exemplar, bevara integriteten hos sina celler och deras mikromiljö och ger en korrekt representation av det biologiska systemet. Andningen rör tassen över tiden, vilket orsakar suddighet och en förlust av fokalplanet.Var noga med att fästa tassen ordentligt med tejp på en stabil yta före avbildning. I detta måste du kunna hitta lämpligt plan av intresse, se till att objektiva är nära tassen utan att röra och är direkt ovanför injektionsstället. Innan du börjar med proceduren slår du på multi-fotonsystemet och väljer 25X-subjektivt.Placera en stereotaxisk apparat på scenen i multifotonmikroskopet och anslut apparaten till en anestesileveransmaskin. Placera en bit matt svart papper på ytan av apparaten som en kopplingspunkt för musen tass. Ställ in resonansskannern med en fast skanningsarea på 512 med 512 mikrometer.Stämma excitationslasrarna till 930 respektive 1, 100 nanometerexcitationsvåglängderna för gröna respektive röda fluorescerande proteinsignaler. Använd en dichroic spegel av 690 till 1, 050 nanometer för att rikta ljusvägen för både excitation lasrar till det enda målet gör det möjligt för 930 nanometern trimmad excitation laser som skall reflekteras till huvudskannern och 1, 100 nanometer inställda laser att passera direkt in i huvudskannern. Ställ sedan in laserkraften för FITC på 5 %och grönt fluorescerande protein på 20 % och släcka taklamporna.För in vivo-avbildning, bedöva musen och skisseras i textprotokollet. Bekräfta en brist på svar på tå nypa i den sövda musen och placera musen i stereotaxic apparaten med tillgång till en näsa kon. Använd svart tejp för att stadigt fästa baktassen på det svarta pappret på områden både proximala och distala för området av intresse, se till att plantarytan på tassen är fri och vänd uppåt mot målet.Placera en generös mängd vattenbaserat smörjmedel på tafsens plantaryta. Rör målet till smörjmedlet för att skapa en kolonn av vätska mellan tassen och målsättningen. Använd FITC excitation ljus för att fokusera in i det dermal lagret av tassen, bekräftar att tandem dimer Tomat taggade fibroblaster kan visualiseras.Bild området av celler som ligger strax under plantar ytan av baktassen med båda lasrarna. Förvärva en 15 minuters tidsförskjutning på cirka fem till 10 Z-skivor vid ungefär en mikrometer per skiva för att etablera en baslinje representation av miljön. När avbildningen vid baslinjen har erhållits, ladda en 25 microliter glas Hamilton spruta med fem mikrogram FITC konjugerad lipopolysackarid, eller LPS, per 20 mikroliter pbs.Administrera lösningen genom intraplantarinjektion i den experimentella baktassen utan att störa paw-positionen. Sedan bild ett område av celler som ligger strax under plantar ytan av baktassen med båda lasrarna. Förvärva en 60 till 120 minuters tid förfaller cirka fem till 10 Z-skivor vid ungefär en mikrometer per skiva för att identifiera cellen medierad intraplantar upptagning av LPS FITC.Eftersom det inte finns någon inneboende fluorescens av cellerna i det dermal lagret, en myriad av celler i det dermal lagret av hind tass kan observeras tar fluorescently taggade LPS efter intraplantar injektion i en vild typ mus. Efter LPS FITC injektion, endast fibroblast specifikt protein en positiv fibroblaster uttrycker vägtull som receptor fyra binda och upptag det injicerade proteinet med en hög nivå av samlokalisering med en tandem dimer Tomato tagg uttryckt av dessa celler. Däremot möss som har vägtull som receptor fyra slås ut ur hela kroppen inte binder och upptag LPS efter injektion.Faktum är att cellsilhuetter är synliga efter LPS FITC injektion som visar att läkemedlet sprider sig i interstitiell vätska runt celler, men är faktiskt inte bunden av en receptor. Det viktigaste att komma ihåg i detta protokoll är att se till att tassens immobiliserade så att det inte finns några snedvridningar i videon på grund av rörelse eller andning. Med hjälp av detta förfarande, rekrytering av fluorescently taggade celler till ett område efter skada och de morfologiska förändringar i en cells svar på en stimulans över tiden kan spåras.Så 2-Photon imaging tillåter forskare att kombinera genetiska reporter möss och fluorescerande taggade föreningar för att bedöma vad som händer i ett levande djur efter en injektion.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tredimensionell optisk upplösning photoacoustic Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparameter Optisk Kartläggning av Langendorff-perfusion Kanin hjärta

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Optisk Kartläggning av aktionspotentialer och transienter Kalcium i musen hjärta

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Virala Nanopartiklar för<em&gt; In vivo</em&gt; Tumöravbildning

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

En Full Skin Defect modell för att utvärdera Vaskularisering av biomaterial<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantifiering av Global diastoliska funktionen av kinematisk modellering baserad Analys av Transmitral Flow via Parametrized diastoliska Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av ett tredimensionellt Full Tjocklek hudekvivalent och automatiserade sårar

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier av lungcancerceller med användning av en Multichannel dubbla elektriskt fält mikroflödes Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Styv inbäddning av fixeras och färgas, hela Millimeter-skala prover för avsnitt-gratis 3D histologi av mikro-datortomografi

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...