Name: designing automated, high-throughput, continuous cell growth experiments using evolver
Uploaded: 2019-05-19T14:30:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER at JoVE.com

Vi takker B. Stafford for hans assistance i udformningen af systemet, og H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. pipe, og A. Cavale for at få hjælp til opførelsen af systemet. Vi anerkender elektronik design faciliteten (EDF), Engineering Product innovation Center (EPIC) og software & Application Innovation Lab (SAIL) på Hariri Institute for computing på Boston University for deres tjenester. Dette arbejde blev støttet af en NSF CAREER Award (MCB-1350949 til A.S.K.), og DARPA bevilger HR0011-15-C-0091 og HR0011-18-2-0014 (til A.S.K.). A.S.K. også anerkender finansiering fra NIH instruktørens nye innovator Award (1DP2AI131083-01), DARPA unge Fakultet Award (D16AP00142), og NSF ekspeditioner i computing (CCF-1522074).

1. klargøring af medier, hætteglas og inokulum
Bemærk: Denne protokol antager, at brugerne allerede har kalibreret eVOLVER-systemet og bruger den smart ærme konfiguration, der er beskrevet i tidligere arbejde16. Smarte ærmer er let redesignet eller modificeret, men opsætningen detaljer af volumen og kontrolparametre kan variere for alternative konfigurationer.
<ol><li>Dagen før eksperimentet forberedes 2 mL overnight flydende kulturer af S. cerevisiae BY4741 referencestamme og variant stammer i YPD-medier (gær Peptone dextrose) ved 30 °c i en ryste inkubator, der er indstillet til mindst 300 omdrejningstal</li>
	<li>Overfør sterile YPD-medier til rene, autoklaverede flasker, der er forsynet med slanger. Alternativt kan mediet autoklaveres direkte i flasker, der er formonteret med slanger. Bemærk: Flasker er egnet med slanger ved at bore et hul i hætten og kører slanger gennem det med stik for at sikre det på plads. Se tabel over materialer.</li>
	<li>Tilsæt røre stang til hvert hætteglas og skrue på et hætteglas låg udstyret med tilstrømning og effluks Straws. Sørg for, at alle komponenter er rene ved visuel inspektion.</li>
	<li>Anbring hætteglassene i en autoklaverbar rack, dække med folie, og autoklaver på en tyngdekraft eller vakuum cyklus med et 20-minutters steriliserings trin.</li>
</ol>2. opsætning af et eksperiment
<ol><li>I tre store bægerglas tilberedes 500 mL 10% blegemiddel, 200 mL 10% blegemiddel og 300 mL 70% ethanol.</li>
	<li>Brug kontakterne på eVOLVER-enheden til at tænde for 5 V strømforsyningen på eVOLVER, vent i 5 s, og tænd derefter for 12 V strømforsyningen.</li>
	<li>Hvis du kører flere hætteglas fra samme medie flaske, skal du tilslutte flere medie indgangs linjer med rørfordelere. Custom slange splittere kan konstrueres med luer komponenter.</li>
	<li>Nedsænk medie indgangs linjerne i det første blege bæger, og mediet effluks-linjerne i det andet blege bæger. Placer den nedre ende af medie indgangs linjerne i det andet bæger med effluks-linjerne. Placer affalds linjer i affaldscarboy.</li>
	<li>Tilsæt 1-2 L blegemiddel til store tomme affaldscarboy, som vil sterilisere affald genereret under forsøget. Rådfør dig med en sikkerhedskoordinator for at sikre korrekt bortskaffelse af affald.</li>
	<li>Brug touchscreenen på eVOLVER, Naviger til opsætnings sektionen, og Kør alle pumper til 20 s for at fylde væske linjer med 10% blegemiddel. Mens du kører, skal du ved visuel inspektion sikre, at alle linjer er blevet fyldt, og at pumperne fungerer normalt. Tillad blegemiddel til at sidde i linjerne i mindst 30 min til at sterilisere.</li>
	<li>Kør pumper igen ved hjælp af touchscreenappen, indtil linjerne ikke længere er nedsænket, og skub luft gennem linjerne for at få så meget af den blegemiddel ud som muligt.</li>
	<li>Anbring medie indgangs linjer i ethanolbægerglasset og Gentag som ovenfor, og fyld linjerne med ethanol og skyl med luft. Bemærk: Som ethanol dræber hurtigt, er der ingen grund til at vente 30 min for sterilisering.</li>
	<li>Fastgør medie indgangs linjer til medie flaskerne med luer-stikkene, og Kør pumperne, indtil mediet løber helt igennem linjerne, og skyl eventuel resterende ethanol ud.</li>
	<li>Delvist indsætte steriliseret hætteglas i eVOLVER smarte ærmer og hook op linjerne til de rigtige positioner, i henhold til farven kodning på linjerne. Start med at vedhæfte indgangs linjer til den korte tilstrømning halm, og derefter spilde linjer til den lange effluks halm. Forsigtig: Det er vigtigt at kontrollere, om der er løse forbindelser eller forkert distribuerede linjer. Hvis du undlader at gøre dette, vil det medføre overløb og potentielt beskadige Smart-ærmet.</li>
	<li>Kør alle pumper i 10 s intervaller for at fylde hætteglassene med medier. Sikre ved visuel inspektion effluks pumper effektivt at fjerne medier gennem effluks Straws, for at forhindre overløb. Hvis effluks-stråene ikke ser ud til at fungere effektivt, skal du inspicere de fluidiske tilslutninger og den peristaltiske pumpe. Ret eller Udskift delene efter behov.</li>
	<li>Skub hætteglassene ned, indtil de er helt indkapslet af Smart ærmet.</li>
	<li>Indstil de indledende betingelser for eksperimentelle parametre ved hjælp af eVOLVER-touchskærmen på den interaktive opsætningsside. For alle hætteglas skal temperaturen indstilles til 30 °C og omrøres til 10. Dette kan gøres for alle hætteglas på én gang ved at trække en finger hen over touchscreenen for at vælge alle hætteglassene.</li>
</ol>3. konfiguration af eVOLVER software og programmering algoritmiske kultur rutiner
<ol><li>I eVOLVER-dashboardet på en computer skal du gå til siden med eksperiment styring. Vælg basis eksperimentet i eksperiment navigatorpanelet eller et eksisterende eksperiment som udgangspunkt, og klik på klon ny. Bemærk: Det er muligt at bruge eksperimenter fra andre grupper ved at indsætte GitHub link til repo, hvor den eksperimentelle definition er gemt i eksperiment Manager.</li>
	<li>Angiv det Eksperimentnavn og den eVOLVER-enhed, som eksperimentet skal køre på. Sørg for, at de ønskede Kalibreringsindstillinger er valgt ved at ændre disse felter på siden.</li>
	<li>Brug hætteglas vælgeren og parameter definitions ruderne til at angive forsøgsbetingelser. Hvis du for eksempel vil indstille temperaturen for hætteglas 0-4 til 30 °C, skal du vælge hætteglassene i hætteglas vælgeren, indstille parameterdefinitionen til 30 og klikke på Indstil. Gentag dette for OD for at indstille en øvre og nedre tærskel for hvert hætteglas.</li>
	<li>Når eksperimentelle parameterdefinitioner er fuldført, skal du gemme eksperimentet ved at klikke på Gem og klikke på Start for at køre.</li>
</ol>4. initiering af eksperiment og overvågning i realtid
<ol><li>Når eksperimentet er i gang, skal du navigere til datapanelet i realtid i det interaktive Dashboard. For hvert hætteglas skal du kontrollere, at OD-værdierne holdes på nul, og at temperaturerne er på eller skrider frem mod programmerede niveauer ved at gennemse graferne.</li>
	<li>For at forberede inokulum måles OD af natten kulturer, Beregn den ønskede fold fortynding under forudsætning af et hætteglas volumen på 25 mL, og pipette beregnet volumen af inokulum i hætteglassene gennem prøvetagnings porten. For eksempel, for at nå en ønsket start OD på omkring 0,05 i kulturen hætteglas fra natten kulturer, der er på OD 2,0, 625 μL af celler skal tilsættes til hvert hætteglas.</li>
	<li>Kontroller graferne på dashboardet for at se, at OD-graferne er blevet opdateret i overensstemmelse hermed. En stigning til nær den ønskede start OD skal ses i graferne.</li>
	<li>Spor forskellige datatyper (f. eks. OD, temperatur, væksthastighed, generationer og medieforbrug) gennem hele eksperimentet ved at gennemse de tilsvarende grafer i dashboardet. Disse værdier kan underrette brugerens eksperimentelle beslutninger (f. eks. tidsplan tidspunkter) eller endda bruges i funktioner til at udføre Automatiseret feedback.</li>
	<li>Hvis du vil udskifte medie flasker midt i eksperimentet, skal du sætte eksperimentet på pause i panelet eksperiment styring for at forhindre, at der opstår pumpe hændelser. Skru hurtigt medie linjen af den tomme flaske og den til den nye flaske. Undgå at røre enderne af slangen for at forhindre kontaminering. Fortsæt eksperimentet i eksperiment styringen.</li>
</ol>5. prøvetagning gærceller fra eVOLVER hætteglas
<ol><li>Forbered en cycloheximid løsning til at hæmme proteinsyntese og fastsætte gærceller til flow cytometri analyse. I et 15 mL konisk rør tilsættes 12 mL PBS og 12 μL 20 mg/mL cycloheximid og vortex i 5 s.</li>
	<li>Ved hjælp af en multikanalpipette, alikvot 100 μl i hver brønd af en 96-godt rundt bundplade.</li>
	<li>Pak pladen i aluminiumsfolie for at blokere lyset og holde ved 4 °C, indtil det er nødvendigt.</li>
	<li>Du kan prøve at pipettere gennem prøvetagnings porten på hætteglassets låg med forlænget længde 200 μL spidser.</li>
	<li>Der afpipetteres 100 μL fra et hætteglas ind i en brønd i fikserings pladen, og 2-3x blandes ved pipettering op og ned, hvorefter det genvinder i folie og returnerer pladen til 4 °C.</li>
</ol>6. eksperiment nedbryde og rydde op
<ol><li>Forbered 1 L af 10% blegemiddel og 2 500 mL DI vand opløsninger i store bægerglas.</li>
	<li>Stop eksperimentet ved at sende stop-kommandoen i panelet eksperiment styring. Dataene gemmes stadig i den cloudaktiverede database og kan stadig ses senere i datapanelet i realtid i dashboardet eller downloades til offline analyse.</li>
	<li>Fjern hætteglassene fra smarte ærmer, og anbring dem i en autoklaven rack for at undgå overløb i de efterfølgende trin.</li>
	<li>Skru medie indgangs linjerne ud af medie flaskerne, og anbring dem i bægerglasset på 10% blegemiddel. Kør pumper fra eVOLVER-brugergrænsefladen som i opsætning for at sterilisere linjer og hætteglas.</li>
	<li>Frakobl linjer fra hætteglas og nedfletnings linjer i DI-vand. Kør pumper til at skylle alle blegemiddel ud af systemet først med DI vand, derefter med luft.</li>
	<li>Sluk for eVOLVER ved først at slukke 12 V strømforsyningen, venter 5 s, og derefter slukke 5 V strømforsyningen.</li>
	<li>Blød røre stænger og hætter i 10% blegemiddel, derefter skylles med DI vand. Sørg for at skylle tilstrømningen og effluks sugerør af hver hætte ved at køre di vand gennem dem. Krat hætteglas ved hjælp af test tube børste, hvis filmen har dannet på vægge.</li>
	<li>Bortskaf affaldet korrekt, og skyl affalds beholderne grundigt. Forsigtig: Affaldsbeholdere vil indeholde en blanding af 10% blegemiddel, steriliseret cellekultur affald og spormængder af ethanol. Kontakt en sikkerhedskoordinator for korrekt håndtering og bortskaffelse.</li>
</ol>7. kvantificering af fitness ved hjælp af flow cytometri analyse af fractional populationer
<ol><li>Analysér indsamlede prøver fra afsnit 5 ved hjælp af et flow flowcytometer udstyret med den relevante fluorescens kanal og detektorer16.</li>
	<li>Opnå mindst 10.000 hændelser pr. prøve og Gate for intakte celler ved hjælp af frem-og side scatter data.</li>
	<li>Port baseret på den relevante fluorescens kanal (f. eks. GFP) til bestemmelse af hver populations fordeling.</li>
	<li>På en computer skal du gemme data på den ønskede placering fra siden eksperiment styring ved at klikke på knappen "Eksporter".</li>
	<li>Fra eVOLVER-datafilerne skal du bestemme antallet af generationer, der er fuldført af hvert tidspunkt for hvert hætteglas. I eVOLVER-koden beregnes generationer ved først at segmentere OD-data mellem hver fortyndings hændelse, så hvert segment passer med en grundlæggende eksponentiel form <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq1.jpg"> til hvert segment, hvilket giver r, vækstraten16. Antallet af generationer over en periode beregnes derefter ved hjælp af følgende formel: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq2v2.jpg">
</li>
	<li>Der afbildes logforholdet for de mærkede og ikke-mærkede populationer fra strømnings cytometri data vs genererings nummer fra ovenstående beregninger på det tidspunkt, hvor prøverne blev udtaget. Identificer den lineære region og Montér skråningen efterfølgende ligning. Denne hældning er almindeligt defineret som den konkurrencedygtige fitness18,19. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq3v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+Bacterial+Cultures.">The Growth of Bacterial Cultures.</a> Annual Review of Microbiology. , (1949).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria.">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 36 (12), 708-719 (1950).</li><li>Bull, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renaissance+of+continuous+culture+in+the+post-genomics+age.">The renaissance of continuous culture in the post-genomics age.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 37 (10), 993-1021 (2010).</li><li>Gresham, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enduring+utility+of+continuous+culturing+in+experimental+evolution.">The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution.</a> Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).</li><li>Lang, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+genetic+hitchhiking+and+clonal+interference+in+forty+evolving+yeast+populations.">Pervasive genetic hitchhiking and clonal interference in forty evolving yeast populations.</a> Nature. 500 (7464), 571-574 (2013).</li><li>Maddamsetti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation,+Clonal+Interference,+and+Frequency-Dependent+Interactions+in+a+Long-Term+Evolution+Experiment+with+Escherichia+coli.">Adaptation, Clonal Interference, and Frequency-Dependent Interactions in a Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli.</a> Genetics. 200 (2), 619-631 (2015).</li><li>Ishii, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+High-Throughput+Analyses+Monitor+the+Response+of+E.+coli+to+Perturbations.">Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations.</a> Science. 316 (5824), 593-597 (2007).</li><li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+Growth+Rate,+Cell+Cycle,+Stress+Response,+and+Metabolic+Activity+in+Yeast.">Coordination of Growth Rate, Cell Cycle, Stress Response, and Metabolic Activity in Yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li><li>Moser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+performance+under+conditions+relevant+for+industrial+bioreactors.">Genetic circuit performance under conditions relevant for industrial bioreactors.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (11), 555-564 (2012).</li><li>Kao, K. C., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+clonal+interference+during+adaptive+evolution+in+asexual+populations+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1499-1504 (2008).</li><li>Toprak, E., Veres, A., Michel, J. -. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+paths+to+antibiotic+resistance+under+dynamically+sustained+drug+selection.">Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection.</a> Nature Genetics. 44 (1), 101-105 (2011).</li><li>Hope, E. A., Amorosi, C. J., Miller, A. W., Dang, K., Heil, C. S., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Evolution+Reveals+Favored+Adaptive+Routes+to+Cell+Aggregation+in+Yeast.">Experimental Evolution Reveals Favored Adaptive Routes to Cell Aggregation in Yeast.</a> Genetics. 206 (2), 1153-1167 (2017).</li><li>Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Use+of+Multiplexed+Chemostat+Arrays.">Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), 2-7 (2013).</li><li>Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost,+customizable+turbidostat+for+use+in+synthetic+circuit+characterization.">A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (1), 32-38 (2015).</li><li>Toprak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+morbidostat:+an+automated+continuous-culture+device+for+studying+bacterial+drug+resistance+under+dynamically+sustained+drug+inhibition.">Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition.</a> Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).</li><li>Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise,+automated+control+of+conditions+for+high-throughput+growth+of+yeast+and+bacteria+with+eVOLVER.">Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).</li><li>Bondi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+scalability+and+their+impact+on+performance.">Characteristics of scalability and their impact on performance.</a> Proceedings of the Second International Workshop on Software and Performance - WOSP &#8217;00. , 195-203 (2000).</li><li>Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Chemostats+in+Microbial+Systems+Biology.">The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50168 (2013).</li><li>Sanchez, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+paralog+divergence+modulates+genome+evolution+across+yeast+species.">Differential paralog divergence modulates genome evolution across yeast species.</a> PLOS Genetics. 13 (2), e1006585 (2017).</li><li>Gibney, P. A., Lu, C., Caudy, A. A., Hess, D. C., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+metabolic+and+signaling+genes+are+required+for+heat-shock+survival+and+have+little+overlap+with+the+heat-induced+genes.">Yeast metabolic and signaling genes are required for heat-shock survival and have little overlap with the heat-induced genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), E4393-E4402 (2013).</li><li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418 (6896), 387-391 (2002).</li><li>Piper, M. D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+oligonucleotide+microarray+transcriptome+analyses.+An+interlaboratory+comparison+using+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Reproducibility of oligonucleotide microarray transcriptome analyses. An interlaboratory comparison using chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (40), 37001-37008 (2002).</li><li>Badarinarayana, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays.">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature Biotechnology. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li><li>Dai, J., Hyland, E. M., Yuan, D. S., Huang, H., Bader, J. S., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Nucleosome+Function:+A+Highly+Versatile.">Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile.</a> Library of Synthetic Histone H3 and H4. 134 (6), 1066-1078 (2008).</li><li>McGeachy, A. M., Meacham, Z. A., Ingolia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Accessible+Continuous-Culture+Turbidostat+for+Pooled+Analysis+of+Complex+Libraries.">An Accessible Continuous-Culture Turbidostat for Pooled Analysis of Complex Libraries.</a> bioRxiv. , 450536 (2018).</li><li>Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+the+continuous+directed+evolution+of+biomolecules.">A system for the continuous directed evolution of biomolecules.</a> Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).</li><li>Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+and+stringency+modulation+in+phage-assisted+continuous+evolution.">Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 216-222 (2014).</li><li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth.">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7 (May), 12546 (2016).</li><li>Wenger, J. W., Piotrowski, J., Nagarajan, S., Chiotti, K., Sherlock, G., Rosenzweig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hunger+Artists:+Yeast+Adapted+to+Carbon+Limitation+Show+Trade-Offs+under+Carbon+Sufficiency.">Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency.</a> PLoS Genetics. 7 (8), e1002202 (2011).</li><li>Yona, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+duplication+is+a+transient+evolutionary+solution+to+stress.">Chromosomal duplication is a transient evolutionary solution to stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 21010-21015 (2012).</li><li>Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+stable,+reproducible+microbial+communities+from+different+fecal+donors+using+minibioreactor+arrays+(MBRAs).">Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs).</a> Microbiome. 3, 42 (2015).</li><li>Goldford, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+simplicity+in+microbial+community+assembly.">Emergent simplicity in microbial community assembly.</a> Science. 361 (6401), 469-474 (2018).</li><li>Lagier, J. -. C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+the+human+microbiota+and+culturomics.">Culturing the human microbiota and culturomics.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).</li><li>Fukami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+Contingency+in+Community+Assembly:+Integrating+Niches,+Species+Pools,+and+Priority+Effects.">Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).</li><li>Friedman, J., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+systems+biology:+The+dynamics+of+interacting+populations.">Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations.</a> Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).</li><li>Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. M., Schmitz, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+continuous+evolution+of+genes+and+pathways+in+yeast.">In vivo continuous evolution of genes and pathways in yeast.</a> Nature Communications. 7, 13051 (2016).</li><li>Ravikumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+Continuous+Evolution+of+Genes+at+Mutation+Rates+above+Genomic+Error+Thresholds.">Scalable, Continuous Evolution of Genes at Mutation Rates above Genomic Error Thresholds.</a> Cell. 175, (2018).</li></ol>

Forfatterne, Brandon G. Wong og Ahmad S. Khalil, er medstiftere af Fynch Bioscience Inc., som udvikler den eVOLVER platform, der anvendes i denne artikel.

Vækst udvælgelse er et uundværligt redskab i biologi, der stort set anvendes til at generere og karakterisere fænotypiske forskelle mellem cellulære populationer. Mens batch kulturer tillader vækst udvælgelse i en begrænset måde, kontinuerlig kultur teknikker dramatisk udvide graden af kontrol og forudsigelighed af disse eksperimenter, ved at udøve præcis regulering over formen og dynamikken i udvælgelsen til at generere gentagelige, kvantitative resultater22. Der er blevet anvendt kontinuerlig kultur til streng kontrol af udvælgelsen af biblioteker med stor mangfoldighed20,23,24,25og til gennemførelse af sofistikerede tilpasningsordninger i forsøgs-og instrueret Evolution11,12,26,27. Kontinuerlig kultur giver også mulighed for præcis karakterisering af celler på tværs af en række kvantitativt kontrollerede forhold for bedre at forstå komplekse genetiske systemer og optimere konstruerede bioproduktion stammer9,14 , af 28.
Men der er ingen universel protokol for kontinuerlig kultur, da subtile ændringer af de selektive betingelser kan føre til dramatiske ændringer i biologiske resultater4,29,30. Experimenters skal kunne vælge mellem udvælgelses ordninger og tilpasse forsøgsprotokoller og udstyr i overensstemmelse hermed. Ud over at tilbyde et valg mellem kontrolparametre, ville sådanne systemer ideelt set være sofistikeret nok til selvstændigt at forvalte flere parametre samtidig i meget parallelle eksperimenter, der er nødvendige for at dechifrere interagerende input i komplekse biologiske systemer (f. eks. epistasis). eVOLVER adresserer denne udfordring ved at give brugerne mulighed for vilkårligt at programmere feedback-kontrol mellem kulturforhold og Fluidic-funktioner med henblik på at specificere højt specialiserede miljø nicher.
For at overvinde begrænsningerne i den aktuelle opsætning og udvide eller ændre kontrolparametre, kan Smart ærmet nemt redesignet til at tilføje nye sensorer eller aktuatorer. Desuden vil en reduktion af hætteglas volumen reducere medie udgifter, som kan være betydelige i kontinuerlig kultur. Mens den nuværende konstruktion tillader måling og kontrol af temperatur, kultur agitation, lys induktion, turbiditet, og fluidics, andre parametre skal måles eksternt ved prøveudtagning fra hætteglassene. Det nuværende arbejde omfatter at indarbejde evnen til at overvåge enzymatisk aktivitet via luciferase og regulere opløst ilt og pH direkte i eVOLVER kulturer. Derudover, selvom det ikke påvises i dette arbejde, kan eVOLVER interface med nye millifluidic multiplexing enheder16 , der trækker på principperne om storstilet integration (stammer fra elektronik og vedtaget af microfluidics) for at Det er billigt at aktivere mere kompleks Fluidic-håndtering (f. eks. multipleks Fluidic-indgange, hætteglas-til-hætteglas-overførsler). Disse wetware moduler kan designes og fremstilles helt i laboratoriet, hvilket giver brugerne mulighed for at dirigere væsker ved programmeringsmæssigt at aktivere forskellige kombinationer af ventiler i automatiserede Fluidic rutiner. Dette giver brugerne mulighed for at overvinde de stive Fluidic designs, der traditionelt anvendes i kontinuerlig kultur, men også at skalere Fluidic kapaciteter til høj-gennemløb med et mindre antal dyrekontrol elementer (f. eks peristaltiske pumper). Endelig, vi håber at indarbejde en autosampling platform, som vil udnytte disse Milli fluidics og DIY komponenter, overvinde begrænsningen af manuel interaktion under længere og større eksperimenter, hvor prøvetagning kulturer ville være besværligt.
Ud over fysiske ændringer af platformen åbner den webbaserede software nye frihedsgrader ved at give brugerne mulighed for at skrive, redigere og dele brugertilpassede scripts og generere fuldt automatiserede, feedback aktiverede kulturprogrammer (f. eks. turbidostat). Brugere kan programmeringsmæssigt feje på tværs af parameter intervaller i subtile variationer på samme udvælgelses skema eller forbinde kontrol algoritmer i nye kombinationer for at angive et vilkårligt antal sofistikerede udvælgelses skemaer. Desuden kan evnen til nemt at overvåge kulturer i realtid omdanne den måde, hvorpå eksperimenter udføres. Med realtidsovervågning kan brugere 1) kontrollere, om der er overensstemmelse mellem kørsler, en kritisk funktion til bioproduktion og eksperimenter med høj gennemløb, og 2) gribe ind under forsøg, hvis det er nødvendigt, for at foretage fejlfinding af udfordrende stammer, der udviser lav vækst eller biofilm dannelse, eller diagnosticere bruger fejl (f. eks. kontaminering). Endelig, med flere datastrømme, der indsamles og fortolkes i realtid for hver enkelt kultur, genererer eVOLVER en høj tæthed af data, som kan lette maskinel indlæring tilgange til nye downstream analyse.
Ud over demonstrerede anvendelser for fitness karakterisering, bibliotek udvælgelse, og laboratorie udvikling, vi ser en række relaterede områder som moden til implementering i eVOLVER med integreret fluidics. Evolver-eksperimenter med mikrobiome-prøver kunne måle stabiliteten i lokalsamfundet i kontrollerede miljøer31,32, udforske mikrobiota-sammensætning ved hjælp af culturomics-teknikker33eller dynamisk blande arter til interrogat økologiske dynamik i kolonisering eller invasion34,35. Talrige metoder til kontinuerlig styret udvikling af biomolekyler kunne nemt implementeres på enheden samt26,36,37, i høj grad øge tilgængeligheden og gennemløb af disse systemer. Evnen til at optimere vækstbetingelser såsom mediernes sammensætning, temperatur og belastninger i en dynamisk, høj gennemløb natur kan støtte i optimering indsats for industrielle biomanufacturing applikationer9. Vi yderligere forestiller sig vertikalt integrere eVOLVER med andre analyseteknikker såsom mikroskopi og flow cytometri i en lukket loop mode, der giver et fuldt automatiseret system til vækst og analyse af cellulære kulturer på både enkelt celle og population Niveauer. Desuden, med nogle hardware modifikationer til Smart ærme såsom forsegling af skibet og kontrollere gas indhold, eVOLVER potentielt kunne tilpasses til at støtte væksten i en bredere vifte af celletyper, såsom suspension pattedyrceller. Det er også muligt at placere hele rammen i et anaerob kammer for anaerob cellekultur. Når vi ser fremad, stræber vi efter at opbygge vores softwarestruktur i en centraliseret Cloud-infrastruktur og mener, at dette vil gøre det muligt for brugerne nemt at konfigurere, analysere og dele deres data eksternt uden at behøve fysisk at være til stede i laboratoriet. Cloud-infrastrukturen fungerer som data kurator og egner sig også til omfattende metaanalyser på tværs af eksperimenter. Vi forventer, at eVOLVER og disse fremtidige fremskridt i høj grad vil udvide omfanget af mulige vækst udvælgelse eksperimenter ved at fremme automatisering og innovation i kontinuerlig kultur.

Kontinuerlig cellekultur teknikker, først udviklet næsten 70 år siden1,2, nyder en nylig genoplivning3,4. Dette skyldes en sammen løb af faktorer. For det første har udviklingen af en høj dataoverførselsteknik, som har gjort det muligt at oplæse og generere et stort antal genotyper5,6, skabt en samtidig efterspørgsel efter forsøgsteknikker, der letter velkontrolleret cellevækst og fænotypning. Til dette formål er kontinuerlig kultur en kraftfuld eksperimenterende tilgang til at udnytte de opståede genomiske fremskridt. Ved at fremme vækst valg/eksperimenter på cellulære populationer i præcist kontrollerede (og dynamiske) miljøforhold giver kontinuerlig kultur et middel til nøje at kortlægge genotyper til fænotyper7,8, kvantitativt karakterisere manipuleret stammer og organismer9, og spore adaptive genetiske ændringer i laboratoriet Evolution undersøgelser10,11,12.
For det andet har den nylige fremkomsten af tilgængelige prototyping teknikker, såsom additiv fremstilling og open source hardware og softwareelementer, gjort det muligt for en bredere kreds af brugere at designe og opbygge deres egne omkostningseffektive former for kontinuerlige kultur systemer direkte i laboratoriet. Alt dette har ført til en spændende vifte af gør-det-selv (DIY) enheder, der udfører kontinuerlig kultur funktionaliteter, såsom chemostat13, turbidostat14, eller morbidostat15. Desværre, selv om det lykkedes at løse specifikke (niche) problemer, som de blev designet, disse ad hoc-løsninger generelt mangler evnen til at skalere i gennemløb og/eller eksperimentel design kompleksitet.
EVOLVER-systemet blev designet med det formål at skabe en enkelt platform, der kan imødekomme de voksende eksperimentelle behov i kontinuerlig kultur og matche hastigheden og omfanget af emergent genomiske teknikker16 (figur 1a). Evolver's design implementerer fælles principper, der underliggende meget skalerbare teknologier fra andre discipliner17, herunder standardiserede fodspor, modulære komponenter og open-source design. Således, løsninger til nye niche applikationer kan designes uden større ændringer i systemet. EVOLVER, der består af meget modulære og open source-wetware, hardware, elektronik og webbaseret software, er det første automatiserede kontinuerlige kultur system, der kan være omkostningseffektivt og let re-konfigureret til at udføre stort set alle typer vækst eksperiment med høj hastighed. Gennem modulære og programmerbare Smart ærmer, som huset alle de sensorer og aktuatorer er nødvendige for at styre de enkelte kulturer, eVOLVER unikt muliggør skalering af både gennemløb og individuel kontrol af kulturforhold. Som en webbaseret platform udveksler eVOLVER desuden data og oplysninger med fjerncomputere i realtid, hvilket muliggør samtidig overvågning af hundredvis af individuelle kulturer og automatiserede kultur forstyrrelser gennem vilkårligt definerede kontrol Algoritmer.
I tidligere arbejde16, blev evolvers robuste præstation demonstreret i langsigtede eksperimenter over hundredvis af timers drift, og dens evne til at dyrke forskellige organismer, fra E. coli og s. cerevisiae til uomesticerede Mikrober. Der blev udført en række forskellige eksperimenter med vækst udvælgelse, hvor der blev anvendt programmeringsmæssigt definerede multidimensionale udvælgelses gradienter på tværs af en række individuelle kulturforhold, og de resulterende cellulære fitness landskaber blev Kvantificerede. Her er målet at give eVOLVER brugere med en beskrivelse af, hvordan man bruger systemet til at designe og disse typer af eksperimenter. Som et illustrativt eksempel, metoder kvantificerer fitness landskab af S. cerevisiae mutanter på tværs af en to-dimensionelle miljømæssige gradient består af temperatur og osmotisk stress præsenteres. Protokollen guider brugerne gennem konfiguration af eVOLVER Framework for dette eksperiment både programmatisk, i at bruge softwaren til at indstille tilpassede Turbiditet og temperaturkontrol rutiner for hver af 16 parallelle kontinuerlige kulturer, og fysisk, gennem fluidics-layoutet til passende rute medier med forskellige saltkoncentrationer. Denne protokol bør tjene som en generel rubrik for at konfigurere eVOLVER til at udføre en bred vifte af automatiserede kontinuerlig kultur eksperimenter for forskellige undersøgelser og discipliner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Gallon Plastic Hedpack with cap</td>
			<td>Midwest Brewing and Winemaking Supplies</td>
			<td>45-56Y8-E2FR</td>
			<td>For waste collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-D(+)-Glucose</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>00805</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Autosampler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine population fractions via single cell fluoresence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118-07-0</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8&#34; Tube ID, 250&#176;F Maximum Temperature</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>5121K731</td>
			<td>For media input branching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50371500</td>
			<td>For Sterilization of fluidic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom eVOLVER vial lid</td>
			<td>FynchBio</td>
			<td></td>
			<td>Lid has ports for sampling and fluidic input/output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10018301</td>
			<td>For flow cytometry sampling plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For sterilization of fluidic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eVOLVER Unit</td>
			<td>FynchBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-420</td>
			<td>For vial sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-57</td>
			<td>Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB8002000</td>
			<td>Must be fitted with tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8&#34; ID, 1/4&#34; OD</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51135K73</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Mini</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>For running the experiment/collecting data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP243820</td>
			<td>For flow cytometry sampling plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K141</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K144</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K291</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K294</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-4910-04</td>
			<td>Culture vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fsher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring OD600 of overnight cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-4902-08</td>
			<td>Culture vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing automated, high-throughput, continuous cell growth experiments using evolver

Kontinuerlige dyrkningsmetoder gør det muligt at udvikle celler under kvantitativt kontrollerede miljøforhold, og er derfor stort set nyttige til måling af fitness fænotyper og forbedring af vores forståelse af, hvordan genotyper formes ved selektion. Omfattende nylige bestræbelser på at udvikle og anvende niche kontinuerlig kultur enheder har afsløret fordelene ved at gennemføre nye former for cellekultur kontrol. Dette omfatter at definere brugerdefinerede selektions tryk og øge gennemløb for undersøgelser, der spænder fra langsigtet eksperimentel evolution til genomdækkende Biblioteks valg og karakterisering af syntetisk genkredsløb. EVOLVER platformen blev for nylig udviklet til at imødekomme denne stigende efterspørgsel: en kontinuerlig kultur platform med en høj grad af skalerbarhed, fleksibilitet og automatisering. eVOLVER giver en enkelt standardisering platform, der kan (re)-konfigureret og skaleret med minimal indsats for at udføre mange forskellige typer af høj-gennemløb eller multi-dimensionelle vækst udvælgelse eksperimenter. Her er en protokol præsenteret for at give brugerne af eVOLVER Framework en beskrivelse til konfiguration af systemet til at gennemføre en brugerdefineret, storstilet kontinuerlig vækst eksperiment. Specifikt, protokollen guider brugere om, hvordan man programmere systemet til multiplex to selektions tryk-temperatur og osmolaritet-på tværs af mange eVOLVER hætteglas med henblik på at kvantificere fitness landskaber af Saccharomyces cerevisiae mutanter ved fine Opløsning. Vi viser, hvordan enheden kan konfigureres både programmatisk, via sin open source web-baseret software, og fysisk, ved at arrangere Fluidic og hardware layouts. Processen med fysisk opsætning af enheden, programmering af kulturen rutine, overvågning og interagere med eksperimentet i realtid over internettet, prøvetagning hætteglas til efterfølgende offline analyse, og post eksperimentdata analyse er detaljerede. Dette bør tjene som udgangspunkt for forskere på tværs af forskellige discipliner til at anvende eVOLVER i udformningen af deres egne komplekse og højt gennemløb cellevækst eksperimenter til at studere og manipulere biologiske systemer.

Den protokol, der er beskrevet her, blev brugt til at konstruere fitnesskort for genetiske varianter af S. cerevisiae på tværs af en to-dimensionel stress gradient af temperatur og saltindhold. Specifikt for hver variant stamme, vi brugte eVOLVER til at gennemføre parvise konkurrence eksperimenter mod en fluorescently-mærket referencestamme (S. cerevisiae stamme BY4741 med en integreret konstitutiv mNeonGreen reporter) i 16 forskellige kombinationer af disse belastninger (figur 1). For varianter blev to knockout-stammer udvalgt hver for sig at være følsomme over for en af stress tilstands akserne: Δprx1 , som er blevet rapporteret at have fitness defekter ved høje temperaturer20 og δpbs2 med fitness defekter ved høj saltkoncentrationer21. Som kontrol variant blev der anvendt en ikke-mærket Wild-type BY4741-stamme, som forventedes at optræde på samme måde som reference stammen. I alt, disse 3 72-timers konkurrence eksperimenter blev udført samtidig i 48 hætteglas på tværs af tre eVOLVER (16-hætteglas) enheder alle kører fra en enkelt computer.
Det interaktive Dashboard eVOLVER bruges til at navigere i den store mængde data, der genereres under hvert eksperiment (figur 2a). Repræsentative OD-spor på tværs af alle 16 hætteglas med en enkelt eVOLVER-enhed er vist i figur 2b. Hvert spor viser et karakteristisk savtakket mønster fra turbidostat kontrol algoritmen, som brugerfeedback på OD til at udløse fortyndinger og vedligeholde kulturer i et snævert densitets område (0,2-0,3 i dette tilfælde). OD-og temperatur data måles kontinuerligt, streames til den cloudaktiverede database og opdateres i realtid i det interaktive Dashboard eVOLVER. Fra kontinuerligt streamet data kan målinger af højere rækkefølge (f. eks. vækstrate, kumulative generationer) beregnes og afbildes i instrumentbrættet (figur 2c) og endda anvendes som feedback parametre i forskellige udvælgelses ordninger (f. eks. morbidostat).
For at generere fitnesskort måler vi den hastighed, hvormed reference stammen udkonkurrerer variant stammen ved at indarbejde både flow cytometri målinger og eVOLVER vækstdata. Befolknings fraktioner beregnes specifikt som log-ratio af variant stamme over referencestamme ved hjælp af flowcytometri data fra hver tidspunkt prøve. For hver kultur og hvert tidspunkt interpoleres det forløbne antal generationer fra eVOLVER-vækstrate data i hver fortyndings periode. Ved at afbilde log-ratio i forhold til generationer begynder der at opstå kvalitative forskelle mellem betingelserne (figur 3a). For at beregne fitness, er en skråning passer gennem den lineære del af hver plot18,19, giver en kvantitativ fitness værdi (med både tegn og sats), der beskriver, hvordan varianten stamme konkurrerer mod reference stammen ( Figur 3B). I dette eksperiment indikerer negative fitness værdier, at variant stammen er udkonkurreret af reference stammen. Opbygning af varmekort fra alle fitness beregninger tillader visualisering af den todimensionelle fitness landskab, afslører subtile kvantitative forskelle i ydeevnen mellem stammer og betingelser (figur 3c).
Fra fitness-Heatmaps kan vi se, at hver variant stamme udviser fitness defekter, der manifesterer sig på forskellige måder. Δprx1 er primært følsom over for høje temperaturer, men salt stress synes at have en additiv effekt, hvilket øger fitness defekten. Modsat viser Δpbs2 fitness defekter primært som reaktion på høje saltkoncentrationer, med minimal forskel langs temperatur aksen. Disse resultater fremhæver nytten af høj opløsning udvælgelse eksperimenter især for at dechifrere interaktioner af flere miljømæssige stressorer, som kunne have additiv, synergistisk, eller epistatiske effekter.
Endelig er det vigtigt at bemærke, at i nogle tilfælde, især for svære stress betingelser, kan fitness beregninger føre til overdrevne eller skæve resultater. For eksempel ser Δpbs2 ud til at vise en stejl positiv hældning i betingelsen 39 °c/1 M NaCl i forhold til reference stammen (figur 3a). Dette tilskrives dårlig vækst af begge stammer, som afspejles i Wild type data og begrænser nytten af denne særlige metrik i denne tilstand. Et utilstrækkeligt antal generationer resulterer i 1) dårlig adskillelse af tidspunkter, der forstyrrer hældning montering, og 2) følsomhed over for stokastiske virkninger stammer fra lag fase. Selv om vi ikke har valgt at gøre det i denne undersøgelse, kunne de real-time vækstdata indsamlet af eVOLVER i løbet af eksperimentet have været brugt til at informere beslutningen om at udvide eksperimentet og indsamle yderligere tidspunkter for denne betingelse med lidt indsats. I opfølgnings eksperimenter kan udgangs forholdet også gradueres for at forlænge længden af den lineære region, før mætningen finder sted.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3.jpg"> Figur 1: oversigt af eVOLVER Framework og eksperimentelt design. (A) Evolver er en automatiseret, kontinuerlig kultur platform, der giver mulighed for multi parameter styring af kultur forholdene. Platformen består af smarte ærmer, som er udstyret med sensorer og aktuatorer til styring af kulturforhold, en peristaltisk pumpe matrix til strømmende medier og affald ind og ud af kulturerne, en touchskærm til at interagere manuelt med enheden, og en computer bruges til at interagere med den Cloud-infrastruktur, hvor data fra platformen streames. (B) udvikler kan konfigureres på flere måder: fysisk, gennem celle-og medie indgange, og programmatisk ved at justere de algoritmer, der styrer Smart ærme kultur hætteglas moduler. Dette kan bruges til at programmere flerdimensionelle valg/miljømæssige gradienter ved høj opløsning, med output bestående af fysisk indsamlede celler på definerede tidspunkter og real-time streaming af kultur data. (C) konfiguration af Evolver til at gennemføre en vækst fitness eksperiment på tværs af en todimensional udvælgelse gradient, der består af temperatur og osmotisk stress. eVOLVER kultur hætteglas blev seedet med samme proportioner af en reference og variant gær stamme. En turbidostat rutine blev programmeret til at opretholde alle kulturerne i eksponentiel fase i et defineret OD vindue (OD 0,2-0,3). Temperatur-og medie forholdene varierede på tværs af Smart sleeve-matrixen, så der dannes to uafhængige stress gradienter. Base mediet bestod af YPD (2% glucose) + 100 μg/mL carbenicillin + 25 μg/mL chloramphenicol som en forholdsregel mod bakteriel kontaminering. Medie kompositioner varierede ved at tilføje supplerende NaCl til 0 M, 0,6 M, 0,8 M, eller 1,0 M. hætteglassets temperaturer blev programmeret til en af fire værdier: 30 °C, 35 °C, 37 °C eller 39 °C. D) eksempler på rå output for kultur OD og populations fraktioner fra tre testede betingelser. Konkurrencens eksperiment blev opretholdt for 72 h, prøveudtagning ved 24 timer og derefter hver 12 h indtil afslutningen af forsøget. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig2.jpg"> Figur 2: udvikler Dashboard til dataanalyse i realtid. (A) udvikler data behandles og streames i realtid via cloudbaseret software til et interaktivt Dashboard. Gennem dashboardet kan brugerne definere og initiere deres egne kultur rutiner på en tilsluttet eVOLVER, overvåge igangværende eksperimenter på tværs af alle eVOLVER-enheder og variere eksperimentelle tilstande manuelt på et individuelt hætteglas eller sæt af hætteglas, hvis det er nødvendigt. B) OD-spor for hvert hætteglas på tværs af den matrix af betingelser, der er afprøvet for hele forsøgets varighed. Traces kan ses i realtid for at sikre, at eksperimentet kører som ønsket og anvendes efter eksperimentet til yderligere analyse. (C) vækstrater og celle generationer kan beregnes ud fra OD spor på flue til at spore eksperiment fremskridt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig3.jpg"> Figur 3: Opførelse af fitness overflader. (A) cellepopulation fraktioner naturlig log (variant stamme/referencestamme) plottet mod celle generationer. Farve angiver temperaturen af udvælgelsen mens bindestreger skelne saltkoncentrationer. (B) for at kvantificere variationens relative egnethed til reference stammen udledes en fitness metrik af den hastighed, hvormed den cellulære populations fraktion ændrer sig over generationer. Denne metrikværdi beregnes ud fra den lineære region af de cellulære brøk områder ved hjælp af mindst tre point. (C) de relative fitness-Metrics vises i et heatmap for at konstruere en fitness overflade over de miljømæssige stress gradienter. Den øverste højre hjørne betingelse (39 °C/1,0 M NaCl) for den vilde type og Δpbs2 er ikke medtaget i denne analyse, da kulturerne gik gennem utilstrækkelige generationer (Se repræsentative resultater). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER at JoVE.com

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

EVOLVER Framework muliggør kontinuerlig mikrobiel kultur med høj opløsning og dynamisk kontrol over eksperimentelle parametre. Denne protokol demonstrerer, hvordan systemet kan anvendes til at gennemføre et komplekst fitness eksperiment, der vejleder brugerne om programmering af automatiseret kontrol over mange individuelle kulturer, måling, indsamling og interaktion med eksperimentelle data i realtid.

Design automatiseret, høj gennemløb, kontinuerlig cellevækst eksperimenter ved hjælp af eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

eVOLVER giver forskerne eksperimentel frihed, evnen til at definere deres egne kulturvæksteksperimenter med automatiseret feedback på flere parametre og skalere det til den størrelse, de har brug for. eVOLVER er mere fleksibel end andre enheder. Brugerne kan nemt tilpasse software i Python samt hardware, ved at ændre de smarte ærmer, der holder sensorer til hver kultur.Systemet kan ved første øjekast virke kompliceret med flere komponenter og forbindelser. En visuel vejledning giver første gangbrugere større tillid til at køre eksperimenter på egen hånd. Korrekt opsætning er kritisk.Sørg for at forstå, hvad hver komponent gør. Så du kan bekræfte, at de arbejder. Sørg for, at alt er dirigeret korrekt og tilsluttet tæt.Mens designet til aerob dyrkning af bakterier og gær i forskellige forhold, eVOLVER kunne også ændres til anaerob gæring eller for at opretholde pattedyrceller i suspension. Denne video viser, hvordan du konfigurerer, initialiserer og kører et kontinuerligt kultureksperiment med højt overførselshastighed ved hjælp af eVOLVER-platformen. Dagen før eksperimentet, forberede medier, hætteglas, og inoculum i henhold til manuskriptet.I tre store bægerglas, forberede to bægerglas på 10% blegemiddel og et bægerglas på 70% ethanol. Brug af tænderne på eVOLVER-enheden, tænd for fem volt-strømforsyningen på eVOLVER, vent i fem sekunder, og tænd derefter for strømforsyningen på 12 volt. Hvis der køres flere hætteglas fra samme medieflaske, skal du tilslutte flere medieinputlinjer med slangesplittere.Brugerdefinerede slanger splittere kan konstrueres med lavere komponenter. Nedsænk medierne input linjer i den første blegemiddel bæger og medierne eflux linjer i den anden blegemiddel bægerglas. Forbind den nedstrøms ende af medieinputlinjerne til det andet bægerglas med eflux-linjerne.Placer affald linjer i en affald carboy. Tilføj en til to liter blegemiddel i affald carboy at sterilisere affald genereret under forsøget. Brug berøringsskærmen på eVOLVER, navigere til opsætningen sektion og køre alle pumper i 20 sekunder for at fylde væsken linjer med 10% blegemiddel.Lad blegemiddel sidde i linjerne i mindst 30 minutter for at sterilisere. Kør pumperne igen ved hjælp af berøringsskærmen, indtil linjerne ikke længere er nedsænket, skubbe luft gennem linjerne for at få så meget af blegemiddel ud som muligt. Placer medier input linjer i ethanol bægerglas, fylde linjerne med ethanol, skyl dem med luft.Derefter vedhæfte medierne input linjer til medierne flasker med de nederste stik og køre pumperne, indtil medierne fuldt løber gennem linjerne skylle ud eventuelle resterende ethanol. Delvist indsætte steriliserede hætteglas i eVOLVER smarte ærmer og tilslutte input linjer til den korte tilstrømning halm og affald linjer til den lange eflux strawq i henhold til farvekodning. Juster på eVOLVER-berøringsskærmen for at køre alle pumper i trin på 10 sekunder for at fylde hætteglassene med medier.Sørg ved visuel inspektion, er eflux pumper effektivt at fjerne medier gennem eflux sugerør for at forhindre overløb. Skub derefter hætteglassene ned, indtil de er helt indkapslet af det smarte ærme. På den interaktive opsætningsside med eVOLVER-berøringsskærmen skal du trække en finger hen over berøringsskærmen eller trykke på knappen Vælg alt for at vælge alle hætteglassene og indstille de oprindelige temperaturbetingelser ved 30 grader Celsius og røre til 10.Angiv den eVOLVER-enhed, som eksperimentet skal køres på, på en computer. Sørg for, at de ønskede kalibreringsindstillinger er valgt. Åbn eVOLVER-dashboardet, og naviger til siden Eksperimentstyring.Vælg grundeksperimentet i panelet Eksperimentsøgning eller et eksisterende eksperiment som udgangspunkt, og klik på Kloning. Gå til siden Eksperimenteditor. Brug Hætteglasvælger- og parameterdefinitionspanelerne til at justere temperaturen til 30 grader Celsius og angiv en øvre og nedre grænse for OD for hvert hætteglas i henhold til forsøgsdesignet.Gem eksperimentet ved at klikke på Gem. Klik derefter på pilen for at gå tilbage til siden Eksperimentstyring, og klik på knappen Afspil for at køre. Når eksperimentet er i gang, skal du gå til panelet Data i realtid i det interaktive dashboard.For hvert hætteglas skal du kontrollere, at OD-værdierne holder på nul. Gennemse temperaturgraferne for at kontrollere, at temperaturen er på eller skrider frem mod 30 grader Celsius. For at forberede inokulumet måles først OD af natten kulturer og beregne den ønskede fulde fortynding for natten kulturer under forudsætning af et hætteglas volumen på 25 milliliter og en ønsket start OD på omkring 0,05.Gennem prøveudtagningsporten pipettes den beregnede mængde inokulum eller blanding af inocula. Kontroller graferne på dashboardet for at se, at OD er stigende til 0,05. Cellevækst og hætteglas kan overvåges i realtid, da eksperimentet er i gang, så forskeren kan gribe ind, hvis der opstår problemer.eVOLVER er en automatiseret kontinuerlig kulturplatform, der muliggør multiparameter kontrol af kulturforhold. Der blev vist kvalitative forskelle mellem de vilde grupper, temperaturfølsomme og saltfølsomme grupper, da logforholdet blev afbildet mod generationer interpoleret fra eVOLVER-væksthastighedsdata. Farve angiver temperaturen i markeringen, mens streger skelne salt koncentrationer.En hældning passer gennem den lineære del af hvert plot ved hjælp af mindst tre punkter, giver en kvantitativ fitness værdi, der beskriver, hvordan den variant stamme konkurrerer mod referencestammen. Negative egnethedsværdier indikerer, at variantstammen er ud konkurreret af referencestammen. Kontroller altid, at alle pumper kører effektivt, og at væskelinjer er fri for træsko.Et overløb kan ødelægge et eksperiment og potentielt beskadige de smarte ærmer. Prøver udtaget fra eVOLVER kan efterfølgende sekvenseres for at kontrollere for genomiske ændringer som følge af forsøget. Disse oplysninger kan bruges til at udvikle nye stammer eller systemer.For forskere, der bruger lab evolution eller bibliotek udvælgelse, er det nemt at anvende unikke valg pres i hver eVOLVER eksperiment. Feedback kontrol og dynamiske miljøer er nu meget tilgængelige så godt. Den affald carboy vil indeholde små mængder af blegemiddel og ethanol efter et eksperiment.Kontakt din laboratoriesikkerhedskoordinator for korrekt bortskaffelse af affald.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

En robot platform for High-throughput protoplastisolering og Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Forstyrrelser af Cirkulerende miRNA i irritabel tyktarm Opdagede Ved hjælp af en Multiplexed Højkapacitetsforskning Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput robotersvejsede Assisted Isolering af temperaturfølsomme Lethal mutanter i<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Under anvendelse af et fluorescerende PCR-kapillær gelelektroforese Teknik til genotype CRISPR / Cas9-medieret Knockout Mutanter i et format med høj kapacitet

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Høj fedt diæt fodring og High Throughput Triacylglyceride Assay i Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation af indfødte kromatin Immunoprecipitation sekventering biblioteker for Nucleosome tæthed analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isoleret og høj overførselshastighed sekventering bibliotek konstruktion til Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Høj overførselshastighed identifikation af synergistiske Drug kombinationer af overlapning2 metode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enkelt molekyle fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyser i spirende gær vegetativ vækst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...