Name: designing automated, high-throughput, continuous cell growth experiments using evolver
Uploaded: 2019-05-19T14:30:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER at JoVE.com

Nous remercions B. Stafford pour son aide à la conception du système, et H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. pipe, et A. cavale pour l’aide à la construction du système. Nous reconnaissons l’Electronics Design Facility (EDF), le Engineering product innovation Center (EPIC) et le Software & application Innovation Lab (SAIL) de l’Institut Hariri pour l’informatique de l’Université de Boston pour leurs services. Ce travail a été appuyé par un prix de carrière NSF (MCB-1350949 à A.S.K.), et DARPA accorde HR0011-15-C-0091 et HR0011-18-2-0014 (à A.S.K.). A.S.K. reconnaît également le financement du nouveau prix innovateur du directeur du NIH (1DP2AI131083-01), du prix DARPA Young Faculty (D16AP00142) et des expéditions NSF en informatique (CCF-1522074).

1. préparation des supports, flacons et inoculum
Remarque: Ce protocole suppose que les utilisateurs ont déjà calibré le système eVOLVER et utilisent la configuration Smart Sleeve décrite dans le travail antérieur16. Les manchons intelligents sont facilement redessinés ou modifiés, mais les détails de configuration des paramètres de volume et de contrôle peuvent différer pour des configurations alternatives.
<ol><li>La veille de l’expérience, préparer 2 mL de cultures liquides de nuit de S. cerevisiae BY4741 souche de référence et souches variant dans les milieux YPD (levure peptone dextrose) à 30 ° c dans un incubateur à agitation fixé à au moins 300 tr/min</li>
	<li>Transférez les fluides YPD stériles dans des flacons propres et autoclavés munis de tubulures. Alternativement, les supports peuvent être autoclavés directement dans des bouteilles pré-équipées de tubes. Remarque: Les bouteilles sont en forme avec le tube en perçant un trou dans le bouchon et en exécutant le tube à travers elle avec des connecteurs pour le fixer en place. Voir le tableau des matériaux.</li>
	<li>Ajouter la barre d’agitation à chaque flacon et visser un couvercle de flacon muni de pailles d’afflux et d’efflux. Assurez-vous que tous les composants sont propres par inspection visuelle.</li>
	<li>Placer les flacons dans un rack autoclavable, recouvrir d’une feuille d’aluminium et l’autoclave sur un cycle de gravité ou de vide avec une étape de stérilisation de 20 minutes.</li>
</ol>2. Configuration d’une expérience
<ol><li>Dans trois grands béchers, préparer 500 mL d’eau de Javel à 10%, 200 mL d’eau de Javel à 10% et 300 mL d’éthanol à 70%.</li>
	<li>En utilisant les commutateurs de l’appareil eVOLVER, allumez l’alimentation 5 V de l’eVOLVER, attendez 5 s, puis allumez l’alimentation 12 V.</li>
	<li>Si vous exécutez plusieurs flacons à partir de la même bouteille de support, connectez plusieurs lignes d’entrée multimédia avec des séparateurs de tubulure. Les répartiteurs de tuyauterie personnalisés peuvent être construits avec des composants Luer.</li>
	<li>Submerge les lignes d’entrée de médias dans le premier bécher de javellisant, et les lignes d’efflux de médias dans le deuxième bécher de javellisant. Placez l’extrémité aval des lignes d’entrée du support dans le deuxième bécher avec les lignes d’efflux. Placer les lignes de déchets dans les déchets de Carboy.</li>
	<li>Ajouter 1-2 L d’eau de Javel dans de grands déchets vides, qui stériliseront les déchets générés pendant l’expérimentation. Consulter un coordonnateur de la sécurité pour assurer l’élimination correcte des déchets.</li>
	<li>À l’aide de l’écran tactile de l’eVOLVER, naviguez jusqu’à la section de configuration, et exécutez toutes les pompes pendant 20 s pour remplir les lignes de fluide avec 10% d’eau de Javel. Pendant l’exécution, assurez-vous par une inspection visuelle que toutes les lignes ont été remplies et que les pompes fonctionnent normalement. Laisser l’eau de Javel s’asseoir dans les lignes pendant au moins 30 min pour stériliser.</li>
	<li>Exécutez de nouveau les pompes à l’aide de l’application tactile jusqu’à ce que les lignes ne soient plus immergées, poussant l’air à travers les lignes pour obtenir autant de l’eau de Javel que possible.</li>
	<li>Placer les lignes d’entrée du support dans le bécher à l’éthanol et répéter comme ci-dessus, en remplissant les lignes avec de l’éthanol et le rinçage avec de l’air. Remarque: Comme l’éthanol tue rapidement, il n’est pas nécessaire d’attendre 30 min pour la stérilisation.</li>
	<li>Attachez les lignes d’entrée du support aux bouteilles de support avec les connecteurs Luer et exécutez les pompes jusqu’à ce que le support traverse complètement les lignes, en rinçant tout l’éthanol résiduel.</li>
	<li>Insérez partiellement des flacons stérilisés dans les manchons intelligents eVOLVER et accrochez les lignes aux positions appropriées, selon le codage des couleurs sur les lignes. Commencez par attacher les lignes d’entrée à la paille de l’afflux court, puis les lignes de déchets à la longue paille efflux. Attention: Il est essentiel de vérifier les connexions desserrées ou les lignes mal acheminées. Le fait de ne pas le faire entraînera des débordements et pourrait endommager la Smart Sleeve.</li>
	<li>Exécuter toutes les pompes en incréments de 10 s pour remplir les flacons avec un support. Assurez-vous par les pompes d’efflux d’inspection visuelle sont efficacement enlevant le support par les pailles d’efflux, pour empêcher des débordements. Si les pailles efflux ne semblent pas fonctionner efficacement, inspectez les raccords de la ligne fluidique et la pompe péristaltique. Corrigez ou remplacez les pièces si nécessaire.</li>
	<li>Poussez les flacons vers le bas jusqu’à ce qu’ils soient entièrement encastrés par le Smart Sleeve.</li>
	<li>Définissez les conditions initiales des paramètres expérimentaux à l’aide de l’écran tactile eVOLVER sur la page de configuration interactive. Pour tous les flacons, réglez la température à 30 ° c et le remuez à 10. Cela peut être fait pour tous les flacons à la fois en faisant glisser un doigt sur l’écran tactile pour sélectionner tous les flacons.</li>
</ol>3. Configuration du logiciel eVOLVER et programmation des routines de culture algorithmique
<ol><li>Dans le tableau de bord eVOLVER sur un ordinateur, accédez à la page du gestionnaire d’expériences. Sélectionnez l’expérience de base dans le panneau de navigation de l’expérience ou une expérience existante comme point de départ et cliquez sur Cloner nouveau. Remarque: Il est possible d’utiliser des expériences d’autres groupes en collant le lien GitHub vers le référentiel où la définition expérimentale est enregistrée dans le gestionnaire d’expérience.</li>
	<li>Spécifiez le nom de l’expérience et le périphérique eVOLVER sur lequel l’expérience sera exécutée. Assurez-vous que les paramètres d’étalonnage souhaités ont été sélectionnés en modifiant ces champs sur la page.</li>
	<li>Utilisez le sélecteur de flacon et les volets de définition de paramètres pour définir des conditions expérimentales. Par exemple, pour régler la température des flacons 0-4 à 30 ° c, sélectionnez les flacons dans le sélecteur de flacon, réglez la définition de paramètre sur 30, puis cliquez sur définir. Répétez ceci pour OD pour définir un seuil supérieur et inférieur pour chaque flacon.</li>
	<li>Une fois les définitions de paramètres expérimentales terminées, enregistrez l’expérience en cliquant sur Enregistrer et cliquez sur Démarrer pour exécuter.</li>
</ol>4. initier l’expérimentation et la surveillance en temps réel
<ol><li>Une fois l’expérience en cours, naviguez jusqu’au panneau de données en temps réel dans le tableau de bord interactif. Pour chaque flacon, vérifiez que les valeurs OD sont en attente à zéro, et que les températures sont à ou progressent vers les niveaux programmés en parcourant les graphiques.</li>
	<li>Pour préparer l’inoculum, mesurer la OD des cultures de nuit, calculer la dilution de pli souhaitée en supposant un volume de flacon de 25 mL, et prélever le volume calculé d’inoculum dans les flacons à travers le port d’échantillonnage. Par exemple, pour atteindre un OD de départ désiré d’environ 0,05 dans le flacon de culture des cultures de nuit qui sont à OD 2,0, 625 μL de cellules doivent être ajoutés à chaque flacon.</li>
	<li>Vérifiez les graphiques sur le tableau de bord pour voir que les graphes OD ont été mis à jour en conséquence. Une augmentation à proximité de la OD de départ souhaitée doit être observée dans les graphiques.</li>
	<li>Suivez les différents types de données (tels que l’OD, la température, le taux de croissance, les générations et la consommation des médias) tout au long de l’expérience en parcourant les graphiques correspondants dans le tableau de bord. Ces valeurs peuvent éclairer les décisions expérimentales de l’utilisateur (par exemple, les délais de planification) ou même utilisées dans les fonctions pour effectuer des retours automatisés.</li>
	<li>Pour remplacer les bouteilles multimédias Mid Experiment, interrompez l’expérience dans le panneau du gestionnaire d’expériences pour éviter que les événements de pompe ne se produisent. Dévissez rapidement la ligne de support de la bouteille vide et connectez-la à la nouvelle bouteille. Évitez de toucher les extrémités du tube pour éviter toute contamination. Reprenez l’expérience dans le gestionnaire de l’expérience.</li>
</ol>5. échantillonnage des cellules de levure des flacons eVOLVER
<ol><li>Préparez une solution de cycloheximide pour inhiber la synthèse protéique et fixer les cellules de levure pour l’analyse de cytométrie en flux. Dans un tube conique de 15 mL, ajouter 12 mL de PBS et 12 μL de 20 mg/mL de cycloheximide et le Vortex pendant 5 s.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette multicanaux, aliquote 100 μL dans chaque puits d’une plaque de fond ronde de 96 puits.</li>
	<li>Envelopper la plaque dans une feuille d’aluminium pour bloquer la lumière et garder à 4 ° c jusqu’à ce que nécessaire.</li>
	<li>Pour échantillonner, Pipetter à travers le port d’échantillonnage sur le couvercle du flacon en utilisant des pointes 200 μL de longueur prolongée.</li>
	<li>Pipetter 100 μL d’un flacon dans un puits de la plaque de fixation, en mélangeant 2-3x en le faisant monter et descendre, puis récupérer dans une feuille et retourner la plaque à 4 ° c.</li>
</ol>6. essayez de décomposer et de nettoyer
<ol><li>Préparer 1 L de 10% de javellisant et 2 500 mL de solution d’eau DI dans les grands béchers.</li>
	<li>Arrêtez l’expérience en envoyant la commande d’arrêt dans le panneau du gestionnaire d’expérience. Les données sont toujours stockées dans la base de données Cloud et peuvent encore être consultées ultérieurement dans le panneau de données en temps réel du tableau de bord ou téléchargées pour une analyse hors ligne.</li>
	<li>Enlevez les flacons des manchons intelligents et placez-les dans un rack autoclave pour éviter les débordements dans les étapes suivantes.</li>
	<li>Dévissez les lignes d’entrée des supports des bouteilles de support et placez-les dans le bécher de l’eau de Javel à 10%. Exécutez les pompes de l’interface utilisateur eVOLVER comme dans la configuration pour stériliser les lignes et les flacons.</li>
	<li>Débranchez les lignes des flacons et submerger les lignes dans l’eau DI. Exécuter les pompes pour rincer tout le javellisant du système d’abord avec de l’eau DI, puis avec de l’air.</li>
	<li>Eteignez eVOLVER en éteignant d’abord l’alimentation 12 V, en attendant 5 s, puis en éteignant l’alimentation 5 V.</li>
	<li>Trempez les barres et les capuchons dans 10% d’eau de Javel, puis rincez avec de la DI. Assurez-vous de rincer l’afflux et les pailles efflux de chaque bouchon en exécutant de l’eau DI à travers eux. Frotter les flacons à l’aide d’un pinceau à tube d’essai si le film s’est formé sur les murs.</li>
	<li>Éliminez les déchets de manière appropriée et Rincez soigneusement les récipients à déchets. Attention: Les contenants de déchets contiendront un mélange de 10% d’eau de Javel, de déchets de culture cellulaire stérilisés et de traces d’éthanol. Consultez un coordinateur de sécurité pour une manipulation et une élimination adéquates.</li>
</ol>7. quantification de la condition physique en utilisant l’analyse de cytométrie en flux des populations fractionnées
<ol><li>Analyser les échantillons collectés à partir de la section 5 à l’aide d’un cytomètre à flux équipé du canal de fluorescence approprié et des détecteurs16.</li>
	<li>Acquérir au moins 10 000 événements par échantillon, et barrière pour les cellules intactes à l’aide des données de dispersion de l’avant et du côté.</li>
	<li>Porte basée sur le canal de fluorescence approprié (p. ex. GFP) pour déterminer la répartition fractionnaire de chaque population.</li>
	<li>Sur un ordinateur, enregistrez les données à l’emplacement souhaité à partir de la page Gestionnaire d’expériences en cliquant sur le bouton "Exporter".</li>
	<li>À partir des fichiers de données eVOLVER, déterminez le nombre de générations terminées par chaque point de temps pour chaque flacon. Dans le code eVOLVER, les générations sont calculées en segmentant d’abord les données OD entre chaque événement de dilution, puis chaque segment est ajusté avec une exponentielle <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq1.jpg"> de base de la forme à chaque segment, donnant r, le taux de croissance16. Le nombre de générations sur une période de temps est ensuite calculé à l’aide de la formule suivante: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq2v2.jpg">
</li>
	<li>Tracer le rapport de log des populations étiquetées et non étiquetées à partir des données de cytométrie de flux versus le numéro de génération des calculs ci-dessus au moment où des échantillons ont été prélevés. Identifiez la région linéaire et adapta la pente selon l’équation suivante. Cette pente est communément définie comme la compétition de remise en forme18,19. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq3v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+simplicity+in+microbial+community+assembly.">Emergent simplicity in microbial community assembly.</a> Science. 361 (6401), 469-474 (2018).</li><li>Lagier, J. -. C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+the+human+microbiota+and+culturomics.">Culturing the human microbiota and culturomics.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).</li><li>Fukami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+Contingency+in+Community+Assembly:+Integrating+Niches,+Species+Pools,+and+Priority+Effects.">Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).</li><li>Friedman, J., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+systems+biology:+The+dynamics+of+interacting+populations.">Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations.</a> Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).</li><li>Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. 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Les auteurs, Brandon G. Wong et Ahmad S. Khalil, sont cofondateurs de Fynch Bioscience Inc., qui développe la plateforme eVOLVER utilisée dans cet article.

La sélection de la croissance est un outil indispensable en biologie, largement utilisé pour générer et caractériser les différences phénotypiques entre les populations cellulaires. Bien que les cultures par lots permettent la sélection de la croissance d’une manière limitée, les techniques de culture continue augmentent considérablement le degré de contrôle et de prévisibilité de ces expériences, en exerçant une réglementation précise sur la forme et la dynamique de la sélection pour générer reproductibles, résultats quantitatifs22. Une culture continue a été employée pour contrôler rigoureusement la sélection des bibliothèques à haute diversité20,23,24,25, et pour mettre en œuvre des régimes d’adaptation sophistiqués dans les systèmes expérimentaux et Evolution dirigée11,12,26,27. La culture continue permet également une caractérisation précise des cellules dans un ensemble de conditions contrôlées quantitativement pour mieux comprendre les systèmes génétiques complexes et optimiser les souches de bioproduction d’ingénierie9,14 , le 28.
Cependant, il n’existe pas de protocole universel pour la culture continue, car des changements subtils aux conditions sélectives peuvent entraîner des changements radicaux dans les résultats biologiques4,29,30. Les expérimentateurs doivent pouvoir choisir entre les régimes de sélection et adapter les protocoles et l’équipement expérimentaux en conséquence. En plus d’offrir un choix entre les paramètres de contrôle, ces systèmes seraient idéalement assez sophistiqués pour gérer indépendamment plusieurs paramètres simultanément dans des expériences hautement parallèles qui sont nécessaires pour déchiffrer les entrées en interaction dans les complexes systèmes biologiques (p. ex. epistasis). eVOLVER résout ce défi en permettant aux utilisateurs de programmer arbitrairement le contrôle des retours entre les conditions de culture et les fonctions fluidiques afin de spécifier des niches environnementales hautement spécialisées.
Pour surmonter les limitations dans la configuration actuelle et développer ou modifier les paramètres de contrôle, le Smart Sleeve pourrait facilement être redessiné pour ajouter de nouveaux capteurs ou actionneurs. En outre, réduire le volume des flacons diminuerait les dépenses des médias, ce qui peut être significatif dans la culture continue. Bien que la conception actuelle permette de mesurer et de contrôler la température, l’agitation de la culture, l’induction de la lumière, la turbidité et la fluidité, d’autres paramètres doivent être mesurés à l’extérieur par échantillonnage à partir des flacons. Le travail actuel comprend l’incorporation de la capacité de surveiller l’activité enzymatique via la luciférase et de réguler l’oxygène dissous et le pH directement dans les cultures eVOLVER. En outre, bien qu’il ne soit pas démontré dans ce travail, eVOLVER peut s’interfacer avec de nouveaux dispositifs de multiplexage Millifluidique16 qui s’inspirer des principes d’intégration à grande échelle (provenant de l’électronique et adoptés par les microfluidiques) afin de permettent une manipulation plus complexe de la fluidité (par exemple, des entrées fluidiques multiplexées, des transferts de flacon à flacon). Ces modules de mouillage peuvent être conçus et fabriqués entièrement dans le laboratoire, ce qui permet aux utilisateurs de router les fluides en actifiant par programmation différentes combinaisons de vannes dans des routines fluidiques automatisées. Cela permet aux utilisateurs de surmonter les conceptions fluidiques rigides traditionnellement utilisées dans la culture continue, mais aussi de faire évoluer les capacités fluidiques vers un débit élevé avec un plus petit nombre d’éléments de contrôle coûteux (p. ex. pompes péristaltiques). Enfin, nous espérons incorporer une plate-forme d’échantillonnage automatique qui utilisera ces composants de millifluidics et de bricolage, en dépassant la limitation de l’interaction manuelle pendant les expériences plus longues et plus grandes où les cultures d’échantillonnage seraient encombrantes.
En plus des modifications physiques apportées à la plate-forme, le logiciel Web ouvre de nouveaux degrés de liberté en permettant aux utilisateurs d’écrire, de modifier et de partager des scripts eVOLVER personnalisés, générant des programmes de culture entièrement automatisés et activés pour les retours (par exemple, turbidostat). Les utilisateurs peuvent balayer par programme les plages de paramètres dans des variantes subtiles sur le même schéma de sélection ou connecter des algorithmes de contrôle dans de nouvelles combinaisons pour spécifier un nombre quelconque de schémas de sélection sophistiqués. En outre, la capacité de surveiller facilement les cultures en temps réel transforme la façon dont les expériences sont menées. Avec la surveillance en temps réel, les utilisateurs peuvent 1) vérifier la cohérence entre les exécutions, une caractéristique critique pour les applications de bioproduction et les expériences à haut débit, et 2) intervenir au cours des expériences si nécessaire, pour dépanner les souches difficiles qui présentent formation de biofilm ou de diagnostic des erreurs de l’utilisateur (p. ex. contamination). Enfin, avec la collecte et l’interprétation de plusieurs flux de données en temps réel pour chaque culture individuelle, eVOLVER génère une forte densité de données, ce qui peut faciliter les approches d’apprentissage automatique pour une nouvelle analyse en aval.
Au-delà des utilisations démontrées pour la caractérisation de conditionnement physique, la sélection de bibliothèque et l’évolution de laboratoire, nous avons vu un certain nombre de domaines connexes comme mûrs pour la mise en œuvre dans eVOLVER avec Fluidics intégré. les expériences d’Evolver avec des échantillons de microbiome pourraient analyser la stabilité de la Communauté dans les environnements contrôlés31,32, explorer la composition de microbiote à l’aide des techniques culturomics33, ou mélanger dynamiquement les espèces à interroger la dynamique écologique de la colonisation ou de l’invasion34,35. De nombreuses méthodes pour l’évolution dirigée continue des biomolécules pourraient facilement être mises en œuvre sur le dispositif aussi bien26,36,37, augmentant considérablement l’accessibilité et le débit de ces systèmes. La capacité d’optimiser les conditions de croissance telles que la composition des médias, la température et les souches dans une nature dynamique et à haut débit peut faciliter les efforts d’optimisation pour les applications de biomanufacturisation industrielle9. Nous avons davantage l’idée d’intégrer verticalement eVOLVER avec d’autres techniques d’analyse telles que la microscopie et la cytométrie en flux en boucle fermée, fournissant un système entièrement automatisé pour la croissance et l’analyse des cultures cellulaires à la fois à une seule cellule et à la population Niveaux. De plus, avec certaines modifications matérielles de la Smart Sleeve telles que l’étanchéité du récipient et le contrôle de la teneur en gaz, eVOLVER pourrait potentiellement être adapté pour soutenir la croissance d’une plus large gamme de types de cellules, tels que les cellules de mammifères de suspension. Il est également possible de placer l’ensemble du cadre dans une chambre anaérobie pour la culture cellulaire anaérobie. En regardant vers l’avenir, nous visons à construire notre infrastructure logicielle dans un environnement Cloud centralisé et croyons que cela permettrait aux utilisateurs de facilement configurer, analyser et partager leurs données à distance sans avoir besoin d’être physiquement présent dans le laboratoire. Fonctionnant en tant que conservateur de données, l’infrastructure cloud se prêterait également à des méta-analyses à grande échelle dans les expériences. Nous prévoyons que eVOLVER et ces futures avancées élargira grandement la portée des expériences possibles de sélection de la croissance en facilitant l’automatisation et l’innovation dans la culture continue.

Les techniques continues de culture cellulaire, développées pour la première fois il y a près de 70 ans,1,2, profitent d’un renouveau récent,3,4. Cela est dû à une confluence de facteurs. Premièrement, le développement de techniques d’OMICS à haut débit, qui ont permis de lire et de générer un grand nombre de génotypes5,6, a créé une demande concomitante de techniques expérimentales qui facilitent croissance cellulaire bien contrôlée et le phénotypage. À cette fin, la culture continue représente une approche expérimentale puissante pour capitaliser sur les avancées génomiques émergentes. En facilitant les sélections/expériences de croissance sur les populations cellulaires dans des conditions environnementales contrôlées (et dynamiques) précises, la culture continue fournit un moyen de cartographier rigoureusement les génotypes aux phénotypes7,8, caractériser quantitativement les souches et les organismes d’ingénierie9, et suivre les changements génétiques adaptatifs dans les études d’évolution en laboratoire10,11,12.
Deuxièmement, l’émergence récente de techniques de prototypage accessibles, telles que la fabrication additive et les éléments matériels et logiciels open source, a permis à un plus large éventail d’utilisateurs de concevoir et de construire leurs propres formes rentables de systèmes de culture continue directement dans le laboratoire. Tout cela a conduit à un éventail passionnant de faire-it-yourself (DIY) des dispositifs qui exécutent des fonctionnalités de culture continue, comme le chémostat13, turbidostat14, ou morbidostat15. Malheureusement, bien qu’ils aient réussi à résoudre des problèmes spécifiques (de niche) pour lesquels ils ont été conçus, ces solutions ad hoc manquent généralement de la capacité d’évoluer dans le débit et/ou la complexité de la conception expérimentale.
Le système eVOLVER a été conçu dans le but de créer une plate-forme unique qui peut répondre aux besoins expérimentaux croissants de culture continue et correspondre à la vitesse et à l’échelle des techniques génomiques émergentes16 (figure 1a). la conception d’eVOLVER met en œuvre des principes communs sous-jacents à des technologies hautement évolutives d’autres disciplines17, y compris des empreintes normalisées, des composants modulaires et des règles de conception Open-source. Ainsi, les solutions pour les nouvelles applications de niche peuvent être conçues sans modifications majeures du système. Composé de logiciels de haute modularité et open source, de matériel, d’électronique et de logiciel Web, eVOLVER est le premier système de culture continue automatisé qui peut être rentable et facilement reconfiguré pour effectuer pratiquement n’importe quel type de expérience de croissance à haut débit. Grâce à des manchons intelligents modulaires et programmables qui permettent de loger tous les capteurs et actionneurs nécessaires pour contrôler les cultures individuelles, eVOLVER permet une mise à l’échelle unique du débit et du contrôle individuel des conditions de culture. En outre, en tant que plate-forme Web, eVOLVER échange des données et des informations avec des ordinateurs distants en temps réel, permettant une surveillance simultanée de centaines de cultures individuelles et de perturbations de culture automatisées par le biais d’un contrôle arbitrairement défini Algorithmes.
Dans les travaux précédents16, la performance robuste d’Evolver a été démontrée dans des expériences à long terme sur des centaines d’heures de fonctionnement, et sa capacité à cultiver divers organismes, de E. coli et s. cerevisiae à non domestiqué Microbes. Une série d’expériences de sélection de croissance distinctes ont été réalisées, dans lesquelles des gradients de sélection multidimensionnels définis par programme ont été appliqués dans un ensemble de conditions de culture individuelles et les paysages cellulaires de conditionnement physique qui en résultent ont été Quantifiés. Ici, l’objectif est de fournir aux utilisateurs d’eVOLVER une description de la façon d’utiliser le système pour concevoir et ces types d’expériences. À titre d’exemple, on présente des méthodes quantifiant le paysage de forme physique des mutants de S. cerevisiae à travers un gradient environnemental bidimensionnel composé de la température et du stress osmotique. Le protocole guide les utilisateurs en configurant l’infrastructure eVOLVER pour cette expérience à la fois par programmation, en utilisant le logiciel pour définir des routines de turbidité et de contrôle de température personnalisées pour chacune des 16 cultures continues parallèles, et physiquement, à travers la disposition fluidique pour acheminer de manière appropriée les médias de différentes concentrations de sel. Ce protocole devrait servir de rubrique générale pour configurer eVOLVER afin d’exécuter une grande variété d’expériences de culture continue automatisées pour diverses études et disciplines.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Gallon Plastic Hedpack with cap</td>
			<td>Midwest Brewing and Winemaking Supplies</td>
			<td>45-56Y8-E2FR</td>
			<td>For waste collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-D(+)-Glucose</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>00805</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Autosampler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine population fractions via single cell fluoresence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118-07-0</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8&#34; Tube ID, 250&#176;F Maximum Temperature</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>5121K731</td>
			<td>For media input branching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50371500</td>
			<td>For Sterilization of fluidic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom eVOLVER vial lid</td>
			<td>FynchBio</td>
			<td></td>
			<td>Lid has ports for sampling and fluidic input/output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10018301</td>
			<td>For flow cytometry sampling plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For sterilization of fluidic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eVOLVER Unit</td>
			<td>FynchBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-420</td>
			<td>For vial sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-57</td>
			<td>Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB8002000</td>
			<td>Must be fitted with tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8&#34; ID, 1/4&#34; OD</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51135K73</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Mini</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>For running the experiment/collecting data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP243820</td>
			<td>For flow cytometry sampling plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K141</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K144</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K291</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K294</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-4910-04</td>
			<td>Culture vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fsher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring OD600 of overnight cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-4902-08</td>
			<td>Culture vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing automated, high-throughput, continuous cell growth experiments using evolver

Les méthodes de culture continue permettent aux cellules d’être cultivées dans des conditions environnementales contrôlées quantitativement, et sont donc largement utiles pour mesurer les phénotypes de conditionnement physique et améliorer notre compréhension de la façon dont les génotypes sont façonnés par la sélection. De vastes efforts récents pour développer et appliquer des dispositifs de culture continue de niche ont révélé les avantages de la conduite de nouvelles formes de contrôle de la culture cellulaire. Cela comprend la définition de pressions de sélection personnalisées et l’augmentation du débit pour des études allant de l’évolution expérimentale à long terme aux sélections de bibliothèques à l’échelle du génome et à la caractérisation synthétique des circuits génétiques. La plateforme eVOLVER a été développée récemment pour répondre à cette demande croissante: une plate-forme de culture continue avec un haut degré d’évolutivité, de flexibilité et d’automatisation. eVOLVER fournit une plate-forme unique de normalisation qui peut être (re)-configurée et mise à l’échelle avec un effort minimal pour effectuer de nombreux types différents d’expériences de sélection de croissance à haut débit ou multi-dimensionnelle. Ici, un protocole est présenté pour fournir aux utilisateurs du Framework eVOLVER une description pour configurer le système pour effectuer une expérience de croissance continue à grande échelle personnalisée. Plus précisément, le protocole guide les utilisateurs sur la façon de programmer le système pour multiplexer deux pressions de sélection — température et osmolarité — à travers de nombreuses flacons eVOLVER afin de quantifier les paysages de forme physique des mutants Saccharomyces cerevisiae à l’amende résolution. Nous montrons comment l’appareil peut être configuré à la fois par programmation, via son logiciel open source basé sur le Web, et physiquement, en organisant des dispositions fluidiques et matérielles. Le processus de mise en place physique de l’appareil, la programmation de la routine de culture, la surveillance et l’interaction avec l’expérience en temps réel sur Internet, les flacons d’échantillonnage pour l’analyse hors ligne ultérieure, et l’analyse des données post-expérience sont détaillés. Cela devrait servir de point de départ aux chercheurs de diverses disciplines pour appliquer eVOLVER dans la conception de leurs propres expériences de croissance cellulaire complexes et à haut débit pour étudier et manipuler les systèmes biologiques.

Le protocole décrit ici a été utilisé pour construire des cartes de conditionnement physique pour les variantes génétiques de S. cerevisiae à travers un gradient de stress bidimensionnel de la température et de la salinité. Plus précisément, pour chaque souche variant, nous avons utilisé eVOLVER pour effectuer des expériences de compétition par paires contre une souche de référence marquée par fluorescence (S. cerevisiae souche BY4741 avec un reporter constitutif mNeonGreen intégré) dans 16 différents combinaisons de ces contraintes (figure 1). Pour les variantes, deux souches à élimination directe ont été choisies, chacune étant prédite sensible à l’un des axes de la condition de contrainte: Δprx1 qui a été rapporté pour avoir des défauts de conditionnement physique à des températures élevées20 et δpbs2 avec des défauts de remise en forme à haute concentrations de sel21. En tant que variante de contrôle, on a utilisé une souche BY4741 de type sauvage non étiquetée, qui devrait fonctionner de la même façon que la souche de référence. Au total, ces expériences de compétition de 3 72 heures ont été menées simultanément dans 48 flacons sur trois appareils eVOLVER (16 flacons) tous exécutés à partir d’un seul ordinateur.
Le tableau de bord interactif eVOLVER permet de naviguer dans la grande quantité de données générées au cours de chaque expérience (figure 2a). Les traces représentatives d’OD sur les 16 flacons d’un seul appareil eVOLVER sont affichées à la figure 2b. Chaque trace affiche un modèle caractéristique de la dent de scie de l’algorithme de contrôle de turbidostat, qui utilise la rétroaction sur OD pour déclencher des dilutions et maintenir des cultures dans une plage de densité étroite (0.2-0.3 dans ce cas). Les données d’OD et de température sont continuellement mesurées, transmises à la base de données Cloud et mises à jour en temps réel dans le tableau de bord interactif eVOLVER. Des données diffusées en continu, des métriques d’ordre supérieur (par exemple, le taux de croissance, les générations cumulatives) peuvent être calculées et tracées dans le tableau de bord (Figure 2c) et même utilisées comme paramètres de rétroaction dans différents schémas de sélection (par exemple, morbidostat).
Pour générer des cartes de remise en forme, nous mesurons la vitesse à laquelle la souche de référence dépasse la souche variant en incorporant à la fois des mesures de cytométrie en flux et des données de croissance eVOLVER. Plus précisément, les fractions de population sont calculées comme le rapport logarithmique de la souche variant par rapport à la souche de référence à l’aide des données de cytométrie en flux de chaque échantillon de temps. Pour chaque culture et chaque point temporel, le nombre de générations écoulées est interpolé à partir des données de taux de croissance eVOLVER pour chaque période de dilution. Tracer les rapports logarithmique par rapport aux générations, les différences qualitatives entre les conditions commencent à émerger (figure 3A). Pour calculer la forme physique, une pente est ajustée à travers la portion linéaire de chaque parcelle18,19, donnant une valeur de conditionnement physique quantitative (avec le signe et le taux) qui décrit comment la souche variant est en concurrence avec la souche de référence ( Figure 3B). Dans cette expérience, les valeurs de remise en forme négatives indiquent que la souche de variante est surlignée par la souche de référence. La construction de cartes thermiques à partir de tous les calculs de conditionnement physique permet de visualiser le paysage de conditionnement physique en deux dimensions, révélant des différences quantitatives subtiles de performance entre les souches et les conditions (figure 3C).
À partir des cartes thermiques de conditionnement physique, nous voyons que chaque souche de variante présente des défauts de forme physique qui se manifestent de différentes façons. Δprx1 est principalement sensible aux températures élevées, mais le stress du sel semble avoir un effet additif, augmentant le défaut de remise en forme. Inversement, Δpbs2 montre des défauts de conditionnement physique principalement en réponse à des concentrations élevées de sel, avec des différences minimales le long de l’axe de température. Ces résultats soulignent l’utilité des expériences de sélection à haute résolution, en particulier pour déchiffrer les interactions de multiples facteurs de stress environnementaux, qui pourraient avoir des effets additifs, synergiques ou épistatiques.
Enfin, il est important de noter que dans certains cas, en particulier pour les conditions de stress sévères, les calculs de conditionnement physique peuvent entraîner des résultats exagérés ou faussé. Par exemple, Δpbs2 semble montrer une pente positive abrupte dans la condition de 39 ° c/1 M de NaCl par rapport à la souche de référence (figure 3A). Ceci est attribué à une faible croissance des deux souches, qui se reflète dans les données de type sauvage et limite l’utilité de cette métrique particulière dans cette condition. Un nombre insuffisant de générations entraîne 1) une mauvaise séparation des points de temps qui interfère avec l’ajustement de la pente, et 2) la sensibilité aux effets stochastiques provenant de la phase de latence. Bien que nous n’ayons pas choisi de le faire dans cette étude, les données de croissance en temps réel recueillies par eVOLVER au cours de l’expérience auraient pu être utilisées pour informer la décision d’étendre l’expérience et de collecter des points de temps supplémentaires pour cette condition avec peu d’effort. Dans les expériences de suivi, les ratios de départ peuvent également être modulées pour prolonger la longueur de la région linéaire avant que la saturation ne se produise.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3.jpg"> Figure 1: vue d’ensemble du cadre eVOLVER et de la conception expérimentale. (A) Evolver est une plate-forme de culture continue automatisée permettant le contrôle multiparamètre des conditions de culture. La plate-forme se compose de Smart Sleeves, qui maison les capteurs et les actionneurs pour contrôler les conditions de culture, un réseau de pompes péristaltiques pour les fluides et les déchets dans et hors des cultures, un écran tactile pour interagir manuellement avec l’appareil, et un ordinateur utilisé pour interagir avec l’infrastructure cloud où les données de la plateforme sont diffusées en continu. (B) Evolver peut être configuré de plusieurs façons: physiquement, par le biais des entrées de cellules et de médias, et par programmation en ajustant les algorithmes contrôlant les modules de fiole de culture Smart Sleeve. Ceci peut être utilisé pour programmer la sélection multidimensionnelle/gradients environnementaux à haute résolution, avec des sorties composées de cellules collectées physiquement à des points de temps définis et de la diffusion en temps réel des données de culture. (C) configurer Evolver pour réaliser une expérience de conditionnement physique de croissance sur un gradient de sélection bidimensionnel, composé de température et de stress osmotique. les flacons de culture eVOLVER ont été ensemencés avec des proportions égales d’une souche de levure de référence et variant. Une routine de turbidostat a été programmée pour maintenir toutes les cultures en phase exponentielle dans une fenêtre OD définie (OD 0.2-0.3). Les conditions de température et de support ont été variées dans la baie Smart Sleeve pour former deux gradients de contrainte indépendants. Les milieux de base étaient composés de YPD (2% de glucose) + 100 μg/mL de carbénicilline + 25 μg/mL de chloramphénicol par précaution contre la contamination bactérienne. Les compositions médiatiques ont été variées en ajoutant du NaCl supplémentaire à 0 M, 0,6 M, 0,8 M, ou 1,0 M. les températures des flacons ont été programmées à l’une des quatre valeurs suivantes: 30 ° c, 35 ° c, 37 ° c ou 39 ° c. Dexemples de production brute pour la culture OD et les fractions de population de trois conditions testées. L’expérience de compétition a été maintenue pour 72 h, échantillonnage à 24 h et par la suite tous les 12 h jusqu’à la conclusion de l’expérience. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig2.jpg"> Figure 2: tableau de bord d’analyse des données en temps réel eVOLVER. (A) les données Evolver sont traitées et diffusées en temps réel via un logiciel basé sur le Cloud vers un tableau de bord interactif. Grâce au tableau de bord, les utilisateurs peuvent définir et initier leurs propres routines de culture sur un eVOLVER connecté, surveiller les expériences en cours d’exécution sur toutes les unités eVOLVER et varier les conditions expérimentales manuellement sur un flacon individuel ou un ensemble de flacons si nécessaire. B) des traces d’OD pour chaque flacon dans la matrice des conditions testées pendant toute la durée de l’expérience. Les suivis peuvent être visualisés en temps réel pour s’assurer que l’expérience fonctionne comme désiré et utilisé après l’expérience pour une analyse plus approfondie. (C) les taux de croissance et les générations cellulaires peuvent être calculés à partir de traces OD à la volée pour suivre les progrès de l’expérience. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig3.jpg"> Figure 3: Construction de surfaces de conditionnement physique. (A) fractions de lapopulation cellulaire log naturel (souche variant/souche de référence) tracée contre les générations cellulaires. La couleur indique la température de sélection tandis que les tirets distinguent les concentrations de sel. (B) pour quantifier l’aptitude relative de la variante à la souche de référence, une métrique de forme physique est dérivée de la vitesse à laquelle la fraction de la population cellulaire change au fil des générations. Cette métrique est calculée à partir de la région linéaire des parcelles de fraction cellulaire à l’aide d’un minimum de trois points. (C) les métriques relatives de conditionnement physique sont affichées dans une carte thermique pour construire une surface de conditionnement physique sur les gradients de contrainte environnementale. L’état du coin supérieur droit (39 ° c/1,0 M NaCl) pour le type sauvage et le Δpbs2 ne sont pas inclus dans cette analyse car les cultures sont passées par des générations insuffisantes (voir résultats représentatifs). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Le Framework eVOLVER permet une culture microbienne continue à haut débit avec une haute résolution et un contrôle dynamique sur les paramètres expérimentaux. Ce protocole démontre comment appliquer le système pour mener une expérience de conditionnement physique complexe, guidant les utilisateurs sur la programmation de contrôle automatisé sur de nombreuses cultures individuelles, la mesure, la collecte et l’interaction avec les données expérimentales en temps réel.

Conception automatisée, à haut débit, des expériences de croissance cellulaire continue à l’aide d’eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

eVOLVER donne aux chercheurs une liberté expérimentale, la capacité de définir leurs propres expériences de croissance culturelle avec rétroaction automatisée sur de multiples paramètres et de l’échelle à n’importe quelle taille dont ils ont besoin. eVOLVER est plus flexible que les autres appareils. Les utilisateurs peuvent facilement personnaliser les logiciels en Python ainsi que le matériel, en modifiant les manches intelligentes qui détiennent des capteurs pour chaque culture.Le système peut sembler compliqué à première vue avec plusieurs composants et connexions. Un guide visuel donne aux utilisateurs pour la première fois plus de confiance dans l’exécution d’expériences par eux-mêmes. Une bonne configuration est essentielle.Assurez-vous de comprendre ce que chaque composant fait. Ainsi, vous pouvez confirmer qu’ils fonctionnent. Assurez-vous que tout est acheminé correctement et bien relié.Bien qu’il soit conçu pour la culture aérobie des bactéries et des levures dans des conditions variables, eVOLVER pourrait également être modifié pour la fermentation anaérobie ou pour maintenir les cellules mammifères en suspension. Cette vidéo montrera comment configurer, initialiser et exécuter une expérience de culture continue à haut débit à l’aide de la plate-forme eVOLVER. La veille de l’expérience, préparez des supports, des flacons et de l’inoculum selon le manuscrit.Dans trois grands béchers, préparer deux béchers de 10% d’eau de Javel et un bécher de 70% d’éthanol. À l’aide des interrupteurs de l’appareil eVOLVER, allumez l’alimentation électrique de cinq volts sur l’eVOLVER, attendez cinq secondes, puis allumez l’alimentation électrique de 12 volts. Si vous exécutant plusieurs flacons à partir de la même bouteille multimédia, connectez plusieurs lignes d’entrée multimédia avec des séparateurs de tubes.Les séparateurs de tubes personnalisés peuvent être construits avec des composants inférieurs. Submergez les lignes d’entrée des médias dans le premier bécher d’eau de Javel et les lignes d’eflux des médias dans le deuxième bécher d’eau de Javel. Connectez l’extrémité aval des lignes d’entrée multimédia au deuxième bécher avec les lignes eflux.Placez les lignes de déchets dans un carboy de déchets. Ajoutez un à deux litres d’eau de Javel dans le carboy de déchets pour stériliser les déchets générés au cours de l’expérience. À l’aide de l’écran tactile sur l’eVOLVER, accédez à la section d’installation et exécutez toutes les pompes pendant 20 secondes pour remplir les lignes fluides avec 10 % d’eau de Javel.Laisser l’eau de Javel reposer dans les lignes pendant au moins 30 minutes pour stériliser. Exécutez à nouveau les pompes à l’aide de l’écran tactile jusqu’à ce que les lignes ne soient plus submergées, poussant l’air à travers les lignes pour obtenir autant d’eau de Javel que possible. Placez les lignes d’entrée des médias dans le bécher à éthanol, remplissez les lignes d’éthanol, rincez-les avec de l’air.Ensuite, fixez les lignes d’entrée des médias aux bouteilles multimédias avec les connecteurs inférieurs et exécutez les pompes jusqu’à ce que le média traverse complètement les lignes en débusçant tout éthanol résiduel. Insérez partiellement des flacons stérilisés dans les manches intelligentes eVOLVER et branchez les lignes d’entrée à la paille d’afflux court et aux lignes de déchets au long strawq eflux selon le codage des couleurs. Réglez sur l’écran tactile eVOLVER pour faire fonctionner toutes les pompes en 10 incréments de 10 secondes pour remplir les flacons de supports.Grâce à l’inspection visuelle, les pompes eflux éliminent efficacement les supports à travers les pailles eflux pour éviter les débordements. Ensuite, poussez les flacons vers le bas jusqu’à ce qu’ils soient entièrement enveloppés par la manche intelligente. Sur la page d’installation interactive à écran tactile eVOLVER, faites glisser un doigt sur l’écran tactile ou appuyez sur le bouton Select All pour sélectionner tous les flacons et définir les conditions initiales de température à 30 degrés Celsius et l’agitation à 10.Sur un ordinateur, spécifiez l’appareil eVOLVER sur quoi l’expérience sera exécuté. Assurez-vous que les paramètres d’étalonnage souhaités ont été sélectionnés. Ouvrez le tableau de bord eVOLVER et accédez à la page Experiment Manager.Sélectionnez l’expérience De base dans le panneau Experiment Navigator ou une expérience existante comme point de départ et cliquez sur Clone. Accédez à la page De l’éditeur d’expérience. Utilisez les panneaux de définition du sélecteur de flacon et des paramètres pour ajuster la température à 30 degrés Celsius et fixer un seuil supérieur et inférieur d’OD pour chaque flacon selon la conception expérimentale.Enregistrez l’expérience en cliquant sur Enregistrer. Cliquez ensuite sur la flèche pour revenir à la page Experiment Manager et cliquez sur le bouton Lecture pour exécuter. Une fois l’expérience en cours, accédez au panneau données en temps réel dans le tableau de bord interactif.Pour chaque flacon, vérifiez que les valeurs d’OD se tiennent à zéro. Parcourez les graphiques de température pour vérifier que les températures sont à ou progressent vers 30 degrés Celsius. Pour préparer l’inoculum, mesurez d’abord l’OD des cultures du jour au lendemain et calculez la dilution complète souhaitée pour les cultures du jour au lendemain en supposant un volume de flacon de 25 millilitres et un OD de départ désiré d’environ 0,05.Par le port d’échantillonnage, pipette le volume calculé de l’inoculum ou le mélange d’inocula. Vérifiez les graphiques sur le tableau de bord pour voir que l’OD augmente à 0,05. La croissance cellulaire et les conditions de flacon peuvent être surveillées en temps réel car l’expérience est en cours, ce qui permet au chercheur d’intervenir en cas de problème.eVOLVER est une plate-forme de culture continue automatisée permettant le contrôle multiparamètre des conditions de culture. Des différences qualitatives ont été montrées entre le type sauvage, les groupes sensibles à la température et les groupes sensibles au sel lorsque les ratios de grumes ont été tracés à partir de générations interpolées à partir de données sur le taux de croissance d’eVOLVER. La couleur indique la température de sélection, tandis que les tirets distinguent les concentrations de sel.Une pente s’insérait dans la partie linéaire de chaque parcelle à l’aide d’un minimum de trois points, donne une valeur quantitative de remise en forme qui décrit comment la souche variante est en concurrence avec la souche de référence. Les valeurs de forme physique négatives indiquent que la souche variante est sur concurrencée par la souche de référence. Vérifiez toujours que toutes les pompes fonctionnent efficacement et que les lignes fluides sont dégagées de tout sabot.Un débordement peut ruiner une expérience et potentiellement endommager les manches intelligentes. Les échantillons prélevés sur eVOLVER peuvent ensuite être séquencés pour vérifier les altérations génomiques à la suite de l’expérience. Ces informations peuvent être utilisées pour concevoir de nouvelles souches ou systèmes.Pour les chercheurs utilisant l’évolution de laboratoire ou la sélection des bibliothèques, il est facile d’appliquer des pressions de sélection uniques dans chaque expérience eVOLVER. Le contrôle de la rétroaction et les environnements dynamiques sont désormais très accessibles. Le carboy de déchets contiendra de petites quantités d’eau de Javel et d’éthanol après une expérience.Consultez votre coordonnateur de la sécurité du laboratoire pour obtenir une élimination adéquate des déchets.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Une plate-forme robotique pour haut débit protoplastes Isolement et Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Recherche

Génétique

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Perturbations de circulation miARN dans le syndrome du côlon irritable détectée en utilisant un multiplexée à haut débit Gene Expression Plate-forme

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

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À haut débit robotisé Isolation assistée sensible à la température létale Mutants en<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

L&#39;utilisation d&#39;un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

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Alimentation de régime riche en graisses et haut débit triacylglycérides essai chez Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Génération d’immunoprécipitation de la chromatine Native séquençage des bibliothèques pour l’analyse de densité de nucléosomes

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Isolement d’ADN robuste et Construction de bibliothèque de séquençage haut-débit pour les spécimens d’herbier

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High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

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Identification de haut débit synergique des associations de médicaments par la méthode2 de chevauchement

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

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Hybridation In Situ de Fluorescence de la molécule unique (smFISH) analyse en bourgeonnement levure croissance végétative et la méiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput Identification des séquences régulatrices du gène à l’aide de prochaine génération séquençage du Chromosome circulaire Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...