Name: designing automated, high-throughput, continuous cell growth experiments using evolver
Uploaded: 2019-05-19T14:30:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER at JoVE.com

Agradecemos a B. Stafford por sua ajuda na concepção do sistema, e H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. pipe, e A. Cavale para ajudar na construção do sistema. Reconhecemos a Electronics design Facility (EDF), o centro de inovação de produtos de engenharia (EPIC) e o software & Application Innovation Lab (SAIL) no Instituto Hariri para computação da Universidade de Boston para os seus serviços. Este trabalho foi apoiado por um prêmio de carreira NSF (MCB-1350949 a A.S.K.), e DARPA concede HR0011-15-C-0091 e HR0011-18-2-0014 (para A.S.K.). A.S.K. também reconhece o financiamento do novo prêmio inovador do diretor da NIH (1DP2AI131083-01), DARPA Young Faculty Award (D16AP00142) e NSF Expeditions in Computing (CCF-1522074).

1. preparando mídia, frascos e Iníbulo
Nota: Este protocolo supõe que os usuários já calibraram o sistema de eVOLVER e estão usando a configuração esperta da luva descrita no trabalho anterior16. As mangas inteligentes são facilmente redesenhadas ou modificadas, mas os detalhes de configuração dos parâmetros de volume e controle podem diferir para configurações alternativas.
<ol><li>No dia anterior ao experimento, prepare 2 mL de culturas líquidas durante a noite de estirpes de referência de S. cerevisiae BY4741 e cepas variantes em meios de YPD (levedura peptona dextrose) a 30 ° c em uma incubadora de agitação definida para pelo menos 300 rpm</li>
	<li>Transfira o meio estéril de YPD em frascos limpos, autoclavados cabidos com a tubulação. Alternativamente, a mídia pode ser autoclavada diretamente em garrafas pré-equipadas com tubos. Nota: Os frascos são cabido com a tubulação perfurando um furo no tampão e na tubulação running com os conectores para fixá-lo no lugar. Consulte tabela de materiais.</li>
	<li>Adicione a barra de agitação a cada frasco e aparafuse uma tampa do frasco equipado com palhas de fluxo e efluxo. Assegure-se de que todos os componentes estejam limpos pela inspeção visual.</li>
	<li>Coloque frascos em um rack autoclavável, cubra com folha e autoclave em um ciclo de gravidade ou vácuo com uma etapa de esterilização de 20 min.</li>
</ol>2. Configurando um experimento
<ol><li>Em três grandes Taças, prepare 500 mL de lixívia de 10%, 200 mL de lixívia a 10% e 300 mL de etanol a 70%.</li>
	<li>Usando os interruptores no dispositivo de eVOLVER, gire sobre a fonte de alimentação de 5 V no eVOLVER, espere 5 s, a seguir gire sobre a fonte de alimentação de 12 V.</li>
	<li>Se estiver executando vários frascos da mesma garrafa de mídia, conecte várias linhas de entrada de mídia com divisores de tubulação. Os divisores feitos encomenda da tubulação podem ser construídos com componentes de Luer.</li>
	<li>Mergulhe as linhas de entrada de mídia na primeira taça de lixívia e as linhas de fluxo de mídia no segundo copo de lixívia. Coloque a extremidade a jusante das linhas de entrada de mídia no segundo copo com as linhas de efluxo. Coloque as linhas de resíduos em carboy desperdício.</li>
	<li>Adicionar 1-2 L de lixívia em grande resíduo vazio carboy, que irá esterilizar resíduos gerados durante o experimento. Consulte um coordenador de segurança para garantir o descarte adequado de resíduos.</li>
	<li>Usando a tela sensível ao toque no eVOLVER, navegue até a seção de configuração e execute todas as bombas por 20 s para encher as linhas de fluido com 10% de lixívia. Durante a execução, certifique-se pela inspeção visual de que todas as linhas foram preenchidas e que as bombas estão operando normalmente. Deixe lixívia para sentar nas linhas por pelo menos 30 min para esterilizar.</li>
	<li>Execute as bombas novamente usando o aplicativo touchscreen até que as linhas não estão mais submersas, empurrando o ar através das linhas para obter o máximo de lixívia para fora possível.</li>
	<li>Coloque as linhas de entrada de mídia no copo de etanol e repita como acima, enchendo as linhas com etanol e rubor com ar. Nota: Como o etanol mata rapidamente, não há necessidade de esperar 30 min para a esterilização.</li>
	<li>Anexar as linhas de entrada de mídia para as garrafas de mídia com os conectores luer e executar as bombas até que a mídia totalmente corre através das linhas, liberando qualquer etanol residual.</li>
	<li>Inserir parcialmente frascos esterilizados no eVOLVER Smart Sleeves e ligar as linhas às posições apropriadas, de acordo com a codificação de cores nas linhas. Comece anexando linhas de entrada para a palha de fluxo curto, e depois as linhas de resíduos para a palha de efluxo longo. Atenção: É crítico verificar se há conexões soltas ou linhas roteadas incorretamente. Se não o fizer, causará transbordar e potencialmente danificar a luva inteligente.</li>
	<li>Execute todas as bombas em incrementos de 10 s para encher os frascos com a mídia. Certifique-se por inspeção visual efluxo bombas são eficientemente removendo mídia através do efluxo palhas, para evitar transbordos. Se as palhetas de efluxo não parecem funcionar eficientemente, inspecione as conexões de linha fluídico e a bomba peristáltica. Corrija ou substitua as peças conforme necessário.</li>
	<li>Empurre os frascos para baixo até que seja totalmente encerrado pela luva inteligente.</li>
	<li>Defina as condições iniciais para parâmetros experimentais usando o touchscreen eVOLVER na página de configuração interativa. Para todos os frascos, defina a temperatura para 30 ° c e a agitação para 10. Isto pode ser feito para todos os frascos de uma só vez, arrastando um dedo através da tela sensível ao toque para selecionar todos os frascos.</li>
</ol>3. Configurando o software eVOLVER e programando rotinas de cultura algorítmica
<ol><li>No painel do eVOLVER em um computador, navegue até a página do Gerenciador de experimentos. Selecione o experimento base no painel do navegador de experimento ou um experimento existente como ponto de partida e clique em clonar novo. Nota: É possível usar experimentos de outros grupos colando o link do GitHub para o repositório onde a definição experimental é salva no Gerenciador de experimento.</li>
	<li>Especifique o nome do experimento e o dispositivo eVOLVER no qual o experimento será executado. Certifique-se de que as configurações de calibração desejadas foram selecionadas modificando esses campos na página.</li>
	<li>Use o seletor de frascos e os painéis de definição de parâmetros para definir condições experimentais. Por exemplo, para definir a temperatura dos frascos para injetáveis 0-4 a 30 ° c, selecione os frascos no selector do frasco para injetáveis, defina a definição do parâmetro como 30 e clique em definir. Repita este parâmetro para OD para definir um limiar superior e inferior para cada frasco para injetáveis.</li>
	<li>Após a conclusão das definições de parâmetros experimentais, salve o experimento clicando em salvar e clique em Iniciar para executar.</li>
</ol>4. iniciando experimento e monitoramento em tempo real
<ol><li>Depois que o experimento estiver em andamento, navegue até o painel de dados em tempo real no painel interativo. Para cada frasco para injetáveis, verifique se os valores de OD estão a segurar a zero e se as temperaturas estão a progredir para níveis programados navegando pelos gráficos.</li>
	<li>Para preparar o inônio, medir o OD de culturas durante a noite, calcular a diluição da prega desejada assumindo um volume de frasco de 25 mL, e pipeta volume calculado de inum em frascos através do porto de amostragem. Por exemplo, para chegar a um OD inicial desejado de cerca de 0, 5 no frasco de cultura de culturas durante a noite que estão em OD 2,0, 625 μL de células devem ser adicionados a cada frasco.</li>
	<li>Verifique os gráficos no Dashboard para ver que os gráficos de OD foram actualizados em conformidade. Um aumento perto do OD começando desejado deve ser visto nos gráficos.</li>
	<li>Rastreie diferentes tipos de dados (como OD, temperatura, taxa de crescimento, gerações e consumo de mídia) ao longo do experimento navegando pelos gráficos correspondentes no painel. Esses valores podem informar as decisões experimentais do usuário (por exemplo, cronogramas de horário) ou até mesmo usadas em funções para realizar comentários automatizados.</li>
	<li>Para substituir os frascos de mídia experimento médio, pause o experimento no painel do Gerenciador de experimentos para evitar que ocorram eventos de bomba. Desaperte rapidamente a linha de mídia da garrafa vazia e conecte-a à nova garrafa. Evite tocar nas extremidades do tubo para evitar a contaminação. Retomar o experimento no Gerenciador de experimento.</li>
</ol>5. amostragem de células de levedura de tubos eVOLVER
<ol><li>Prepare uma solução de cicloheximida para inibir a síntese proteica e fixar células de levedura para análise de citometria de fluxo. Em um tubo cônico de 15 mL, adicione 12 mL de PBS e 12 μL de cicloheximida 20 mg/mL e Vortex por 5 s.</li>
	<li>Usando uma pipeta multicanal, alíquota 100 μl em cada poço de uma placa inferior redonda de 96 poços.</li>
	<li>Enrole a placa na folha de alumínio para bloquear a luz e manter a 4 ° c até que seja necessário.</li>
	<li>Para provar, pipetar através da porta de amostragem na tampa do frasco com comprimento prolongado 200 μL de pontas.</li>
	<li>Pipetar 100 μL de um frasco para injetáveis para um poço na placa de fixação, misturando 2-3x pipetando para cima e para baixo, depois recupere em folha e devolva a placa a 4 ° c.</li>
</ol>6. experimento quebrar e limpar
<ol><li>Prepare 1 L de lixívia de 10% e 2 500 mL de soluções de água em grandes Taças.</li>
	<li>Pare o experimento enviando o comando Stop no painel do Gerenciador de experimentos. Os dados ainda são armazenados no banco de dados habilitado para nuvem e ainda podem ser visualizados posteriormente no painel de dados em tempo real do painel ou baixados para análise offline.</li>
	<li>Remova os frascos de Smart Sleeves e coloque-os em um rack de autoclave para evitar estouros em etapas subsequentes.</li>
	<li>Desaparafuse as linhas de entrada de mídia das garrafas de mídia e coloque-as na taça de lixívia de 10%. Execute as bombas da interface do usuário do eVOLVER como na configuração para esterilizar linhas e frascos.</li>
	<li>Desconecte linhas de frascos e submergir linhas em água di. Executar bombas para liberar todos os lixívia fora do sistema primeiro com água DI, em seguida, com ar.</li>
	<li>Desligue o eVOLVER desligando primeiro a fonte de alimentação de 12 V, aguardando 5 s e, em seguida, desligue a fonte de alimentação de 5 V.</li>
	<li>Mergulhe barras de agitação e bonés em 10% lixívia, em seguida, enxaguar com água DI. Certifique-se de enxaguar o influxo e efluxo canudos de cada tampa, executando DI água através deles. Esfregue os frascos usando a escova do tubo de ensaio se a película se formou em paredes.</li>
	<li>Elimine os resíduos de forma adequada e enxague completamente os recipientes. Atenção: Os recipientes waste conterá uma mistura do alvejante de 10%, do desperdício esterilizado da cultura de pilha, e de quantidades do traço do etanol. Consulte um coordenador de segurança para o manuseamento e eliminação adequados.</li>
</ol>7. QUANTIFYING fitness usando análise de citometria de fluxo de populações fracionárias
<ol><li>Analise amostras coletadas da seção 5 usando um citômetro do fluxo equipado com o canal e os detectores apropriados da fluorescência16.</li>
	<li>Adquira pelo menos 10.000 eventos por amostra e porta para células intactas usando os dados de dispersão de avanço e de lado.</li>
	<li>Portão com base no canal de fluorescência apropriado (por exemplo, GFP) para determinar a distribuição fracionária de cada população.</li>
	<li>Em um computador, salve os dados no local desejado na página Gerenciador de experimentos clicando no botão "exportar".</li>
	<li>A partir dos arquivos de dados do eVOLVER, determine o número de gerações concluídas por cada ponto de tempo para cada frasco. No código eVOLVER, as gerações são calculadas pela primeira segmentação dos dados de OD entre cada evento de diluição, então cada segmento é cabido com um exponencial básico do formulário <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq1.jpg"> a cada segmento, rendendo r, a taxa de crescimento16. O número de gerações ao longo de um período de tempo é então calculado usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq2v2.jpg">
</li>
	<li>Plotar o log-ratio das populações rotuladas e sem rótulo do fluxo de dados de citometria vs número de geração dos cálculos acima no momento em que as amostras foram tomadas. Identifique a região linear e ajuste a inclinação de acordo com a seguinte equação. Esta inclinação é comumente definida como a aptidão competitiva18,19. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq3v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
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Os autores, Brandon G. Wong e Ahmad S. Khalil, são cofundadores da Fynch Bioscience Inc., que desenvolve a plataforma eVOLVER usada neste artigo.

A seleção de crescimento é uma ferramenta indispensável na biologia, amplamente utilizada para gerar e caracterizar diferenças fenotípicas entre populações celulares. Enquanto as culturas de lote permitem a seleção de crescimento de forma limitada, as técnicas contínuas de cultura expandem drasticamente o grau de controle e previsibilidade desses experimentos, exercendo uma regulação precisa sobre a forma e a dinâmica de seleção para gerar resultados quantitativos e repetíveis22. A cultura contínua tem sido empregada para controlar rigorosamente a seleção de bibliotecas de alta diversidade20,23,24,25, e implementar sofisticados regimes adaptativos em experimental e evolução dirigida11,12,26,27. A cultura contínua igualmente permite a caracterização precisa das pilhas através de uma disposição de condições quantitativamente controladas para compreender melhor sistemas genéticos complexos e para aperfeiçoar tensões projetadas da bioprodução9,14 , a 28.
No entanto, não existe um protocolo universal para a cultura contínua, pois mudanças sutis nas condições seletivas podem levar a mudanças dramáticas nos desfechos biológicos4,29,30. Os experimentadores devem ser capazes de escolher entre os regimes de seleção e adaptar os protocolos experimentais e equipamentos em conformidade. Além de oferecer uma escolha entre os parâmetros de controle, esses sistemas seriam idealmente sofisticados o suficiente para gerenciar de forma independente vários parâmetros simultaneamente em experimentos altamente paralelos que são necessários para decifrar entradas interagindo em complexos sistemas biológicos (por exemplo, epistasis). o eVOLVER aborda esse desafio, permitindo que os usuários programem arbitrariamente o controle de feedback entre as condições de cultura e as funções fluímicas para especificar nichos ambientais altamente especializados.
Para superar as limitações na configuração atual e expandir ou alterar os parâmetros de controle, a luva inteligente pode ser facilmente redesenhada para adicionar novos sensores ou atuadores. Adicionalmente, reduzir o volume do frasco diminuiria as despesas dos meios, que podem ser significativas na cultura contínua. Quando o projeto atual permitir a medida e o controle da temperatura, da agitação da cultura, da indução clara, do turbidity, e do fluidics, outros parâmetros devem ser medidos externamente pela amostragem dos frascos. O trabalho atual inclui incorporar a capacidade de monitorar a atividade enzimática via luciferase e regular o oxigênio dissolvido e o pH diretamente nas culturas do eVOLVER. Além disso, embora não demonstrado neste trabalho, eVOLVER pode interface com novos dispositivos de multiplexação milifluídico16 que desenhar sobre os princípios de integração em grande escala (proveniente da eletrônica e adotado por Microfluidics), a fim de permitir uma manipulação fluídico mais complexa (por exemplo entradas fluídico multiplexados, transferências do frasco-à-frasco). Estes módulos do wetware podem ser projetados e manufacturados completamente no laboratório, permitindo que os usuários roteem líquidos programando programaticamente combinações diferentes de válvulas em rotinas fluídico automatizadas. Isto permite que os usuários superem os projetos fluídico rígidos usados tradicional na cultura contínua, mas igualmente para escalar capacidades fluídico ao elevado-throughput com um número menor de elementos de controle caros (por exemplo bombas peristáltica). Por fim, esperamos incorporar uma plataforma de autoamostragem que utilizará esses componentes de millifluidics e DIY, superando a limitação da interação manual durante experimentos mais longos e maiores, onde culturas de amostragem seriam complicadas.
Além de modificações físicas na plataforma, o software baseado na Web abre novos graus de liberdade, permitindo que os usuários escrevam, editem e compartilhem scripts do eVOLVER personalizados, gerando programas de cultura totalmente automatizados e habilitados para comentários (por exemplo, turbidostat). Os usuários podem varrer programaticamente entre intervalos de parâmetros em variações sutis no mesmo esquema de seleção ou conectar algoritmos de controle em novas combinações para especificar qualquer número de esquemas de seleção sofisticados. Além disso, a capacidade de monitorar facilmente culturas em tempo real transforma a maneira em que os experimentos são conduzidos. Com o monitoramento em tempo real, os usuários podem 1) verificar a consistência entre as execuções, um recurso crítico para aplicações de bioprodução e experimentos de alta produtividade, e 2) intervir durante experimentos, se necessário, para solucionar problemas de tensões desafiadoras que exibem crescimento deficiente ou formação de biofilme, ou diagnosticar erros do usuário (por exemplo, contaminação). Finalmente, com vários fluxos de dados sendo coletados e interpretados em tempo real para cada cultura individual, o eVOLVER gera uma alta densidade de dados, o que pode facilitar abordagens de aprendizado de máquina para a análise de novos downstream.
Além dos usos demonstrados para caracterização de condicionamento físico, seleção de bibliotecas e evolução laboratorial, vemos uma série de campos relacionados como maduros para implementação no eVOLVER com fluidics integrados. os experimentos Evolver com amostras de microbioma podem ensaiar a estabilidade da Comunidade em ambientes controlados31,32, explorar a composição da microbiota usando técnicas de culturomicina33, ou misturar dinamicamente espécies para Interrogue a dinâmica ecológica de colonização ou invasão34,35. Os métodos numerosos para a evolução dirigida contínua das biomoléculas podiam facilmente ser implementados no dispositivo também26,36,37, aumentando extremamente a acessibilidade e a taxa de transferência destes sistemas. A capacidade de otimizar as condições de crescimento, como composição de mídia, temperatura e tensões em uma natureza dinâmica e de alta taxa de transferência, pode ajudar na otimização de esforços para aplicações de biomanufatura industrial9. Nós imaginamos mais verticalmente integrando eVOLVER com outras técnicas da análise tais como a microscopia e a citometria do fluxo em uma forma Closed do laço, fornecendo um sistema inteiramente automatizado para o crescimento e a análise de culturas celulares na única pilha e na população Níveis. Além disso, com algumas modificações de hardware para a luva inteligente, tais como vedação do navio e o teor de gás de controle, eVOLVER poderia potencialmente ser adaptado para apoiar o crescimento de uma gama mais ampla de tipos de células, como a suspensão de células de mamíferos. Também é viável colocar toda a estrutura em uma câmara anaeróbia para cultura celular anaeróbia. Olhando para a frente, pretendemos construir a nossa estrutura de software em uma infra-estrutura de nuvem centralizada e acredito que isso permitiria aos usuários facilmente configurar, analisar e compartilhar seus dados remotamente, sem a necessidade de estar fisicamente presente no laboratório. Funcionando como curador de dados, a infraestrutura de nuvem também se emprestaria a análises de meta em grande escala em experimentos. Prevemos que o eVOLVER e esses futuros avanços expandirão enormemente o escopo de possíveis experimentos de seleção de crescimento facilitando a automação e a inovação na cultura contínua.

Técnicas contínuas da cultura da pilha, desenvolvidas primeiramente quase 70 anos há1,2, estão apreciando um revival recente3,4. Isto é devido a uma confluência de factores. Em primeiro lugar, o desenvolvimento de técnicas de alta produtividade-ônicas, que tornaram possível a leitura e geração de grande número de genótipos5,6, criou uma demanda concomitante de técnicas experimentais que facilitam crescimento celular bem controlado e fenotipagem. Para este fim, a cultura contínua representa uma poderosa abordagem experimental para capitalizar os avanços genóricos emergentes. Ao facilitar as seleções de crescimento/experimentos em populações celulares em condições ambientais precisamente controladas (e dinâmicas), a cultura contínua fornece um meio para mapear rigorosamente os genótipos para os fenótipos7,8, caracterizar quantitativamente cepas e organismos projetados9, e rastrear alterações genéticas adaptativas nos estudos de evolução laboratorial10,11,12.
Em segundo lugar, o recente surgimento de técnicas de prototipagem acessíveis, como manufatura aditiva e elementos de hardware e software de código aberto, permitiu que um conjunto mais amplo de usuários projetem e construam suas próprias formas rentáveis de sistemas de cultura contínuos diretamente no laboratório. Tudo isso levou a uma empolgante variedade de dispositivos do tipo "faça você mesmo" (DIY) que executam funcionalidades contínuas de cultura, como o quimiostat13, o turbidostat14ou o morbidostat15. Infelizmente, embora bem sucedido em abordar problemas específicos (de nicho) para os quais eles foram projetados, essas soluções ad hoc geralmente não têm a capacidade de dimensionar na taxa de transferência e/ou complexidade de design experimental.
O sistema eVOLVER foi projetado com o objetivo de criar uma única plataforma que possa acomodar as crescentes necessidades experimentais da cultura contínua e corresponder à velocidade e escala das técnicas genómicas emergentes16 (Figura 1a). o design do eVOLVER implementa princípios comuns subjacentes a tecnologias altamente escaláveis de outras disciplinas17, incluindo pegadas padronizadas, componentes modulares e princípio de design de código aberto. Assim, as soluções para novas aplicações de nicho podem ser projetadas sem grandes modificações no sistema. Composto por wetware altamente modular e de código aberto, hardware, eletrônica e software baseado na Web, o eVOLVER é o primeiro sistema de cultura contínua automatizado que pode ser rentável e prontamente re-configurado para realizar praticamente qualquer tipo de experimento de crescimento de alta produtividade. Através de Smart Sleeves modulares e programáveis que abriam todos os sensores e atuadores necessários para controlar culturas individuais, o eVOLVER permite exclusivamente o dimensionamento da taxa de transferência e o controle individual das condições de cultura. Além disso, como uma plataforma baseada na Web, o eVOLVER troca dados e informações com computadores remotos em tempo real, permitindo o monitoramento simultâneo de centenas de culturas individuais e perturbações da cultura automatizada através de controle definido arbitrariamente Algoritmos.
No trabalho anterior16, o desempenho robusto do Evolver foi demonstrado em experimentos de longo prazo ao longo de centenas de horas de operação, e sua capacidade de cultivar vários organismos, de e. coli e s. cerevisiae a não domesticados Micróbios. Uma série de experimentos distintos de seleção de crescimento foi realizada, na qual foram aplicados gradientes de seleção multidimensionais programaticamente definidos em uma matriz de condições de cultura individuais e as paisagens de aptidão celular resultantes foram Quantificados. Aqui, o objetivo é fornecer aos usuários do eVOLVER uma descrição de como usar o sistema para projetar e esses tipos de experimentos. Como um exemplo ilustrativo, os métodos que quantificam a paisagem da aptidão de mutantes de S. cerevisiae através de um inclinação ambiental bidimensional compor da temperatura e do esforço osmótica são apresentados. O protocolo orienta os usuários através da configuração da estrutura eVOLVER para este experimento tanto programaticamente, usando o software para definir rotinas de controle de temperatura e turbidez personalizadas para cada uma das 16 culturas contínuas paralelas, e fisicamente, através do layout de fluínicos para rotear adequadamente as mídias de diferentes concentrações de sal. Este protocolo deve servir como uma rubrica geral para configurar o eVOLVER para executar uma ampla variedade de experimentos de cultura contínua automatizados para diversos estudos e disciplinas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Gallon Plastic Hedpack with cap</td>
			<td>Midwest Brewing and Winemaking Supplies</td>
			<td>45-56Y8-E2FR</td>
			<td>For waste collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-D(+)-Glucose</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>00805</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Autosampler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine population fractions via single cell fluoresence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118-07-0</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8&#34; Tube ID, 250&#176;F Maximum Temperature</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>5121K731</td>
			<td>For media input branching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50371500</td>
			<td>For Sterilization of fluidic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom eVOLVER vial lid</td>
			<td>FynchBio</td>
			<td></td>
			<td>Lid has ports for sampling and fluidic input/output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10018301</td>
			<td>For flow cytometry sampling plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For sterilization of fluidic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eVOLVER Unit</td>
			<td>FynchBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-420</td>
			<td>For vial sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-57</td>
			<td>Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB8002000</td>
			<td>Must be fitted with tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8&#34; ID, 1/4&#34; OD</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51135K73</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Mini</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>For running the experiment/collecting data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP243820</td>
			<td>For flow cytometry sampling plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K141</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K144</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K291</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K294</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-4910-04</td>
			<td>Culture vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fsher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring OD600 of overnight cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-4902-08</td>
			<td>Culture vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing automated, high-throughput, continuous cell growth experiments using evolver

Os métodos contínuos da cultura permitem que as pilhas sejam crescidas condições ambientais quantitativamente controladas, e são assim amplamente úteis para medir fenótipos da aptidão e melhorar nossa compreensão de como os genótipos são dados forma pela seleção. Extensos esforços recentes para desenvolver e aplicar nicho de dispositivos de cultura contínua revelaram os benefícios da realização de novas formas de controle da cultura celular. Isso inclui definir pressões de seleção personalizadas e aumentar a taxa de transferência para estudos que vão desde a evolução experimental de longo prazo até seleções de bibliotecas de todo o genoma e caracterização de circuitos de genes sintéticos. A plataforma eVOLVER foi desenvolvida recentemente para atender a essa crescente demanda: uma plataforma de cultura contínua com alto grau de escalabilidade, flexibilidade e automação. o eVOLVER fornece uma única plataforma de padronização que pode ser (re) configurada e dimensionada com o mínimo de esforço para executar muitos tipos diferentes de experimentos de seleção de crescimento de alta taxa de transferência ou multidimensionais. Aqui, um protocolo é apresentado para fornecer aos usuários do Framework eVOLVER uma descrição para configurar o sistema para realizar um experimento de crescimento contínuo personalizado e em grande escala. Especificamente, o protocolo orienta os usuários sobre como programar o sistema para multiplex duas pressões de seleção — temperatura e osmolaridade — em muitos frascos eVOLVER, a fim de quantificar as paisagens de fitness de mutantes Saccharomyces cerevisiae em multa Resolução. Mostramos como o dispositivo pode ser configurado de forma programática, por meio de seu software baseado na Web de código aberto e fisicamente, organizando layouts fluídico e de hardware. O processo de configuração física do dispositivo, programação da rotina de cultura, monitoramento e interação com o experimento em tempo real pela Internet, amostragem de frascos para análise offline subsequente e análise de dados pós-experimento são detalhados. Isso deve servir como ponto de partida para pesquisadores em diversas disciplinas para aplicar o eVOLVER no projeto de suas próprias experiências de crescimento de células complexas e de alto rendimento para estudar e manipular sistemas biológicos.

O protocolo descrito aqui foi usado para construir mapas de aptidão para variantes genéticas de S. cerevisiae através de um gradiente de estresse bidimensional de temperatura e salinidade. Especificamente, para cada cepa variante, usamos o eVOLVER para realizar experimentos de competição emparelhados contra uma cepa de referência com rótulo fluorescentamente (S. cerevisiae Strain BY4741 com um repórter constitutivo integrado mNeonGreen) em 16 diferentes combinações destas tensões (Figura 1). Para variantes, duas cepas de nocaute foram selecionadas cada uma prevista para ser sensível a um dos eixos de condição de estresse: Δprx1 que foi relatado para ter defeitos de aptidão em altas temperaturas20 e δpbs2 com defeitos de aptidão em alta concentrações de sal21. Como variante de controle, utilizou-se uma cepa BY4741 de tipo selvagem sem rótulo, que se espera que se realize de forma semelhante à cepa de referência. No total, estes experimentos de competição de 3 72 horas foram conduzidos simultaneamente em 48 frascos em três dispositivos eVOLVER (16-Vial) todos executados a partir de um único computador.
O painel interativo do eVOLVER é usado para navegar pela grande quantidade de dados gerados durante cada experimento (Figura 2a). Os traços representativos de OD em todos os 16 frascos de um único dispositivo eVOLVER são mostrados na Figura 2b. Cada traço exibe um padrão de dente de serra característico do algoritmo de controle de turbidostato, que usa o feedback sobre o OD para desencadear diluições e manter as culturas em uma faixa de densidade estreita (0,2-0,3 neste caso). Os dados de OD e temperatura são continuamente medidos, transmitido para o banco de dados habilitado para nuvem e atualizados em tempo real no painel interativo do eVOLVER. De dados continuamente em transmissão, as métricas de ordem superior (por exemplo, taxa de crescimento, gerações cumulativas) podem ser calculadas e plotadas no painel (Figura 2C) e até mesmo usadas como parâmetros de feedback em diferentes esquemas de seleção (por exemplo, morbidostat).
Para gerar mapas de condicionamento físico, medimos a taxa na qual a cepa de referência supera a cepa variante incorporando medições de citometria de fluxo e dados de crescimento do eVOLVER. Especificamente, as frações populacionais são calculadas como a taxa de log da cepa variante sobre a cepa de referência usando dados de citometria de fluxo de cada amostra de ponto temporal. Para cada cultura e ponto de tempo, o número decorrido de gerações é interpolado a partir dos dados da taxa de crescimento do eVOLVER em cada período de diluição. Traçando as relações de log contra gerações, as diferenças qualitativas entre as condições começam a surgir (Figura 3a). Para calcular a aptidão, uma inclinação é ajustada através da porção linear de cada parcela18,19, produzindo um valor quantitativo de aptidão (com sinal e taxa) que descreve como a cepa variante compete contra a cepa de referência ( Figura 3B). Neste experimento, valores de aptidão negativa indicam que a cepa variante é supercompetida pela cepa de referência. A construção de Heatmaps de todos os cálculos de aptidão permite a visualização da paisagem bidimensional da aptidão, revelando diferenças quantitativas sutis no desempenho entre cepas e condições (Figura 3C).
Dos Heatmaps da aptidão, nós vemos que cada tensão variante exibe os defeitos da aptidão que se manifestam em maneiras diferentes. Δprx1 é principalmente sensível a altas temperaturas, mas o estresse salino parece ter um efeito aditivo, aumentando o defeito de condicionamento físico. Por outro lado, Δpbs2 mostra defeitos de condicionamento físico principalmente em resposta a altas concentrações de sal, com diferenças mínimas ao longo do eixo de temperatura. Estes resultados destacam a utilidade de experimentos de seleção de alta resolução especialmente para decifrar interações de múltiplos estressores ambientais, que podem ter efeitos aditivos, sinergéticos ou epistáticos.
Finalmente, é importante notar que, em alguns casos, particularmente para condições severas de stress, os cálculos de aptidão podem levar a resultados exagerados ou distorcida. Por exemplo, Δpbs2 parece mostrar uma inclinação positiva íngreme na condição nacl de 39 ° c/1 M em relação à cepa de referência (Figura 3a). Isto é atribuído ao crescimento pobre de ambas as tensões, que é refletida nos dados selvagens do tipo e limita a utilidade desta métrica particular nesta circunstância. Um número insuficiente de gerações resulta em 1) má separação dos temporais que interfere com o encaixe da inclinação, e 2) sensibilidade aos efeitos estocásticos que originam da fase da retardação. Embora não tenhamos sido eleitos para fazer isso neste estudo, os dados de crescimento em tempo real coletados pelo Evolver durante o experimento poderiam ter sido usados para informar a decisão de estender o experimento e coletar temporais adicionais para essa condição com pouco esforço. Em experimentos de acompanhamento, as proporções iniciais também podem ser moduladas para estender o comprimento da região linear antes que ocorra a saturação.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3.jpg"> Figura 1: visão geral da estrutura eVOLVER e design experimental. (A) Evolver é uma plataforma de cultura contínua e automatizada que permite o controle multiparamo de condições de cultura. A plataforma consiste em Smart Sleeves, que abrirem os sensores e atuadores para controlar as condições de cultura, uma matriz de bomba peristáltica para fluxo de mídia e resíduos dentro e fora das culturas, um touchscreen para interagir manualmente com o dispositivo, e um computador usado para interagir com a infraestrutura de nuvem em que os dados da plataforma são transmitido. (B) o Evolver pode ser configurado de várias maneiras: fisicamente, por meio de entradas de célula e mídia e programaticamente ajustando os algoritmos que controlam os módulos de frasco de cultura de luva inteligente. Isso pode ser utilizado para programar gradientes de seleção/ambiente multidimensionais em alta resolução, com saídas consistindo de células coletadas fisicamente em pontos de tempo definidos e streaming em tempo real de dados de cultura. (C) configurando o Evolver para realizar uma experiência de fitness de crescimento em um gradiente de seleção bidimensional, composto por temperatura e estresse osmótico. os frascos de cultura eVOLVER foram semeados com proporções iguais de uma cepa de levedura de referência e variante. Uma rotina do turbidostat foi programada para manter todas as culturas na fase exponencial em uma janela definida do OD (OD 0.2-0.3). As condições de temperatura e mídia foram variadas em toda a matriz de Smart Sleeve para formar dois gradientes de estresse independentes. O meio de base foi composto por YPD (2% de glicose) + 100 μg/mL de carbenicilina + 25 μg/mL de cloranfenicol como precaução contra a contaminação bacteriana. As composições de mídia foram variadas através da adição de NaCl suplementar a 0 M, 0,6 M, 0,8 M, ou 1,0 M. as temperaturas do frasco foram programadas para um dos quatro valores: 30 ° c, 35 ° c, 37 ° c ou 39 ° c. (D) exemplos de produção bruta para a cultura OD e frações populacionais de três condições testadas. O experimento de competição foi mantido por 72 h, amostragem a 24 h e, posteriormente, a cada 12 h até a conclusão do experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig2.jpg"> Figura 2: painel de análise de dados em tempo real do eVOLVER. (A) o Evolver data é processado e transmitido em tempo real através de software baseado em nuvem para um Dashboard interativo. Por meio do Dashboard, os usuários podem definir e iniciar suas próprias rotinas de cultura em um eVOLVER conectado, monitorar experimentos atualmente em execução em todas as unidades do eVOLVER e variar as condições experimentais manualmente em um frasco ou conjunto de frascos individuais, se necessário. B) traços de OD para cada frasco para injetáveis em toda a matriz de condições testadas durante toda a duração do experimento. Os rastreamentos podem ser visualizados em tempo real para garantir que o experimento esteja sendo executado como desejado e usado pós-experimento para análise posterior. (C) as taxas de crescimento e as gerações de células podem ser calculadas a partir de traços de OD na mosca para rastrear o progresso da experiência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig3.jpg"> Figura 3: Construção de superfícies de condicionamento físico. (A) registro natural das frações da população da pilha (tensão variante/tensão da referência) plotados de encontro às gerações da pilha. A cor indica a temperatura da seleção enquanto traços distinguem as concentrações de sal. (B) para quantificar a aptidão relativa da variante para a cepa de referência, uma métrica de aptidão é derivada da taxa em que a fração da população celular muda ao longo das gerações. Essa métrica é calculada a partir da região linear das parcelas de fração celular usando um mínimo de três pontos. (C) as métricas relativas de condicionamento físico são exibidas em um mapa de calor para construir uma superfície de condicionamento físico sobre os gradientes de estresse ambiental. A condição de canto superior direito (39 ° c/1,0 M NaCl) para o tipo selvagem e Δpbs2 não são incluídas nesta análise, pois as culturas passaram por gerações insuficientes (ver resultados representativos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

A estrutura eVOLVER permite a cultura microbiana contínua de alto débito com alta resolução e controle dinâmico sobre parâmetros experimentais. Este protocolo demonstra como aplicar o sistema para realizar um experimento de condicionamento físico complexo, orientando os usuários a programar o controle automatizado sobre muitas culturas individuais, medindo, coletando e interagindo com dados experimentais em tempo real.

Projetando experimentos de crescimento de células contínuas, de alta produtividade e automatizados usando o eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

O eVOLVER dá aos pesquisadores liberdade experimental, a capacidade de definir seus próprios experimentos de crescimento de cultura com feedback automatizado sobre múltiplos parâmetros e dimensioná-los para qualquer tamanho que eles precisam. O eVOLVER é mais flexível do que outros dispositivos. Os usuários podem facilmente personalizar o software em Python, bem como o hardware, modificando as mangas inteligentes que seguram sensores para cada cultura.O sistema pode parecer complicado à primeira vista com múltiplos componentes e conexões. Um guia visual dá aos usuários da primeira vez mais confiança na execução de experimentos por conta própria. A configuração adequada é crítica.Certifique-se de entender o que cada componente faz. Então você pode confirmar que eles estão trabalhando. Certifique-se de que tudo está roteado corretamente e conectado com força.Embora projetado para cultivo aeróbico de bactérias e leveduras em condições variadas, o eVOLVER também poderia ser modificado para fermentação anaeróbica ou para manter células mamíferas em suspensão. Este vídeo demonstrará como configurar, inicializar e executar um experimento de cultura contínua de alto rendimento usando a plataforma eVOLVER. Um dia antes do experimento, preparem a mídia, os frascos e o inóculo de acordo com o manuscrito.Em três béquers grandes, prepare dois béquers de 10% de alvejante e um béquer de 70% de etanol. Usando os interruptores no dispositivo eVOLVER, ligue a fonte de alimentação de cinco volts no eVOLVER, espere por cinco segundos e ligue a fonte de alimentação de 12 volts. Se executar vários frascos da mesma garrafa de mídia, conecte várias linhas de entrada de mídia com divisores de tubos.Divisores de tubulação personalizados podem ser construídos com componentes inferiores. Submergir as linhas de entrada de mídia no primeiro béquer de alvejante e nas linhas eflux da mídia no segundo béquer de alvejante. Conecte a extremidade a jusante das linhas de entrada de mídia ao segundo béquer com as linhas eflux.Coloque linhas de lixo em um carboy de lixo. Adicione um a dois litros de alvejante no carboy de resíduos para esterilizar os resíduos gerados durante o experimento. Usando a tela sensível ao toque no eVOLVER, navegue até a seção de configuração e execute todas as bombas por 20 segundos para encher as linhas de fluido com alvejante de 10%.Deixe o alvejante sentar nas linhas por pelo menos 30 minutos para esterilizar. Execute as bombas novamente usando a tela sensível ao toque até que as linhas não estejam mais submersas, empurrando o ar através das linhas para obter o máximo de alvejante possível. Coloque linhas de entrada de mídia no béquer de etanol, encha as linhas com etanol, lave-as com ar.Em seguida, conecte as linhas de entrada de mídia às garrafas de mídia com os conectores inferiores e execute as bombas até que a mídia passe totalmente pelas linhas que liberam qualquer etanol residual. Insira parcialmente frascos esterilizados nas mangas inteligentes eVOLVER e conecte as linhas de entrada à palha de fluxo curto e às linhas de resíduos ao longo eflux strawq de acordo com a codificação de cores. Ajuste na tela sensível ao toque eVOLVER para executar todas as bombas em incrementos de 10 segundos para encher os frascos com mídia.Certifique-se de que, por inspeção visual, as bombas eflux estão removendo eficientemente a mídia através dos canudos eflux para evitar transbordamentos. Em seguida, empurre os frascos para baixo até ficar totalmente envolto pela manga inteligente. Na página de configuração interativa eVOLVER touchscreen, arraste um dedo pela tela sensível ao toque ou pressione o botão Selecionar Tudo para selecionar todos os frascos e definir as condições iniciais de temperatura em 30 graus Celsius e a agitação para 10.Em um computador, especifique o dispositivo eVOLVER no qual o experimento será executado. Certifique-se de que as configurações de calibração desejadas foram selecionadas. Abra o painel eVOLVER e navegue até a página Gerenciador de experimentos.Selecione o experimento Base no painel Navegador de Experimentos ou um experimento existente como ponto de partida e clique em Clone. Navegue até a página do Editor de Experimentos. Use os painéis de definição de seletor de frascos e parâmetros para ajustar a temperatura a 30 graus Celsius e definir um limiar superior e inferior de OD para cada frasco de acordo com o design experimental.Salve o experimento clicando em Salvar. Em seguida, clique na seta para voltar à página Gerenciador de experimentos e clique no botão Reproduzir para executar. Uma vez que o experimento esteja em andamento, navegue até o painel Dados em Tempo Real no painel interativo.Para cada frasco, verifique se os valores de OD estão segurando a zero. Navegue pelos gráficos de temperatura para verificar se as temperaturas estão em 30 graus Celsius. Para preparar o inóculo, primeiro meça o OD das culturas noturnas e calcule a diluição total desejada para culturas noturnas assumindo um volume de frasco de 25 mililitros e um OD inicial desejado de cerca de 0,05.Através da porta de amostragem, pipeta o volume calculado de inóculo ou mistura de inocula. Verifique os gráficos no painel para ver se o OD está aumentando para 0,05. O crescimento celular e as condições do frasco podem ser monitorados em tempo real, pois o experimento está em andamento, permitindo que o pesquisador intervenha caso ocorram problemas.O eVOLVER é uma plataforma automatizada de cultura contínua que permite o controle multiparmetro das condições da cultura. Diferenças qualitativas foram mostradas entre os grupos selvagens, sensíveis à temperatura e sensíveis ao sal quando as razões de registro foram traçadas contra gerações interpoladas a partir de dados de taxa de crescimento eVOLVER. A cor indica a temperatura da seleção, enquanto os traços distinguem as concentrações de sal.Uma inclinação que se encaixa na porção linear de cada parcela usando um mínimo de três pontos, produz um valor de aptidão quantitativa que descreve como a tensão variante compete contra a cepa de referência. Os valores negativos de aptidão indicam que a cepa variante é out-competida pela cepa de referência. Verifique sempre se todas as bombas estão funcionando eficientemente e que as linhas de fluido estão livres de quaisquer tamancos.Um estouro pode arruinar um experimento e potencialmente danificar as mangas inteligentes. Amostras colhidas do eVOLVER podem ser sequenciadas posteriormente para verificar alterações genômicas como resultado do experimento. Essas informações podem ser usadas para projetar novas cepas ou sistemas.Para pesquisadores que usam a evolução do laboratório ou a seleção da biblioteca, é fácil aplicar pressões de seleção únicas em cada experimento eVOLVER. O controle de feedback e ambientes dinâmicos também são muito acessíveis. O carboy de lixo conterá pequenas quantidades de alvejante e etanol após um experimento.Consulte o coordenador de segurança do laboratório para o descarte adequado dos resíduos.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genética

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Perturbações de circulação miRNAs na Síndrome do Cólon Irritável detectada usando um multiplexado de alta capacidade: Plataforma Gene Expression

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Alto Throughput Robotically Isolamento Assistida da temperatura sensível Lethal Mutantes em<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto Throughput em Drosophila Melanogaster.

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

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Identificação de alta produtividade de combinações de drogas sinérgica pelo método de sobreposição2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...