Name: designing automated, high-throughput, continuous cell growth experiments using evolver
Uploaded: 2019-05-19T14:30:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER at JoVE.com

Мы благодарим б. Стэффорд за помощь в проектировании системы и х. Халиля, а. Солтаничзаде, а. Сун, с. Пайк и а. Кавале за помощь в строительстве системы. Мы признаем, электроника дизайн фонда (ЭДФ), инженерно-технический продукт инновационный центр (EPIC), а программное обеспечение & применение инновационной лаборатории (парус) в институте Харири для вычислений в Бостонском университете за их услуги. Эта работа была поддержана НФ (MCB-1350949 to А.С.К.), и DARPA грантов HR0011-15-C-0091 и HR0011-18-2-0014 (до А.С.К.). А.С.К. также признает, финансирование из низ директор новый новатор награда (1DP2AI131083-01), DARPA молодой факультет премии (D16AP00142), и ННФ в области вычислительной техники (СРС-1522074).

<ol>
	<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+Bacterial+Cultures.">The Growth of Bacterial Cultures.</a> Annual Review of Microbiology. , (1949).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria.">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 36 (12), 708-719 (1950).</li><li>Bull, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renaissance+of+continuous+culture+in+the+post-genomics+age.">The renaissance of continuous culture in the post-genomics age.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 37 (10), 993-1021 (2010).</li><li>Gresham, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enduring+utility+of+continuous+culturing+in+experimental+evolution.">The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution.</a> Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).</li><li>Lang, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+genetic+hitchhiking+and+clonal+interference+in+forty+evolving+yeast+populations.">Pervasive genetic hitchhiking and clonal interference in forty evolving yeast populations.</a> Nature. 500 (7464), 571-574 (2013).</li><li>Maddamsetti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation,+Clonal+Interference,+and+Frequency-Dependent+Interactions+in+a+Long-Term+Evolution+Experiment+with+Escherichia+coli.">Adaptation, Clonal Interference, and Frequency-Dependent Interactions in a Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli.</a> Genetics. 200 (2), 619-631 (2015).</li><li>Ishii, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+High-Throughput+Analyses+Monitor+the+Response+of+E.+coli+to+Perturbations.">Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations.</a> Science. 316 (5824), 593-597 (2007).</li><li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+Growth+Rate,+Cell+Cycle,+Stress+Response,+and+Metabolic+Activity+in+Yeast.">Coordination of Growth Rate, Cell Cycle, Stress Response, and Metabolic Activity in Yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li><li>Moser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+performance+under+conditions+relevant+for+industrial+bioreactors.">Genetic circuit performance under conditions relevant for industrial bioreactors.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (11), 555-564 (2012).</li><li>Kao, K. C., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+clonal+interference+during+adaptive+evolution+in+asexual+populations+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1499-1504 (2008).</li><li>Toprak, E., Veres, A., Michel, J. -. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+paths+to+antibiotic+resistance+under+dynamically+sustained+drug+selection.">Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection.</a> Nature Genetics. 44 (1), 101-105 (2011).</li><li>Hope, E. A., Amorosi, C. J., Miller, A. W., Dang, K., Heil, C. S., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Evolution+Reveals+Favored+Adaptive+Routes+to+Cell+Aggregation+in+Yeast.">Experimental Evolution Reveals Favored Adaptive Routes to Cell Aggregation in Yeast.</a> Genetics. 206 (2), 1153-1167 (2017).</li><li>Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Use+of+Multiplexed+Chemostat+Arrays.">Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), 2-7 (2013).</li><li>Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost,+customizable+turbidostat+for+use+in+synthetic+circuit+characterization.">A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (1), 32-38 (2015).</li><li>Toprak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+morbidostat:+an+automated+continuous-culture+device+for+studying+bacterial+drug+resistance+under+dynamically+sustained+drug+inhibition.">Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition.</a> Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).</li><li>Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise,+automated+control+of+conditions+for+high-throughput+growth+of+yeast+and+bacteria+with+eVOLVER.">Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).</li><li>Bondi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+scalability+and+their+impact+on+performance.">Characteristics of scalability and their impact on performance.</a> Proceedings of the Second International Workshop on Software and Performance - WOSP &#8217;00. , 195-203 (2000).</li><li>Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Chemostats+in+Microbial+Systems+Biology.">The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50168 (2013).</li><li>Sanchez, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+paralog+divergence+modulates+genome+evolution+across+yeast+species.">Differential paralog divergence modulates genome evolution across yeast species.</a> PLOS Genetics. 13 (2), e1006585 (2017).</li><li>Gibney, P. A., Lu, C., Caudy, A. A., Hess, D. C., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+metabolic+and+signaling+genes+are+required+for+heat-shock+survival+and+have+little+overlap+with+the+heat-induced+genes.">Yeast metabolic and signaling genes are required for heat-shock survival and have little overlap with the heat-induced genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), E4393-E4402 (2013).</li><li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418 (6896), 387-391 (2002).</li><li>Piper, M. D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+oligonucleotide+microarray+transcriptome+analyses.+An+interlaboratory+comparison+using+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Reproducibility of oligonucleotide microarray transcriptome analyses. An interlaboratory comparison using chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (40), 37001-37008 (2002).</li><li>Badarinarayana, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays.">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature Biotechnology. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li><li>Dai, J., Hyland, E. M., Yuan, D. S., Huang, H., Bader, J. S., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Nucleosome+Function:+A+Highly+Versatile.">Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile.</a> Library of Synthetic Histone H3 and H4. 134 (6), 1066-1078 (2008).</li><li>McGeachy, A. M., Meacham, Z. A., Ingolia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Accessible+Continuous-Culture+Turbidostat+for+Pooled+Analysis+of+Complex+Libraries.">An Accessible Continuous-Culture Turbidostat for Pooled Analysis of Complex Libraries.</a> bioRxiv. , 450536 (2018).</li><li>Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+the+continuous+directed+evolution+of+biomolecules.">A system for the continuous directed evolution of biomolecules.</a> Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).</li><li>Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+and+stringency+modulation+in+phage-assisted+continuous+evolution.">Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 216-222 (2014).</li><li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth.">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7 (May), 12546 (2016).</li><li>Wenger, J. W., Piotrowski, J., Nagarajan, S., Chiotti, K., Sherlock, G., Rosenzweig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hunger+Artists:+Yeast+Adapted+to+Carbon+Limitation+Show+Trade-Offs+under+Carbon+Sufficiency.">Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency.</a> PLoS Genetics. 7 (8), e1002202 (2011).</li><li>Yona, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+duplication+is+a+transient+evolutionary+solution+to+stress.">Chromosomal duplication is a transient evolutionary solution to stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 21010-21015 (2012).</li><li>Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+stable,+reproducible+microbial+communities+from+different+fecal+donors+using+minibioreactor+arrays+(MBRAs).">Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs).</a> Microbiome. 3, 42 (2015).</li><li>Goldford, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+simplicity+in+microbial+community+assembly.">Emergent simplicity in microbial community assembly.</a> Science. 361 (6401), 469-474 (2018).</li><li>Lagier, J. -. C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+the+human+microbiota+and+culturomics.">Culturing the human microbiota and culturomics.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).</li><li>Fukami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+Contingency+in+Community+Assembly:+Integrating+Niches,+Species+Pools,+and+Priority+Effects.">Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).</li><li>Friedman, J., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+systems+biology:+The+dynamics+of+interacting+populations.">Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations.</a> Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).</li><li>Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. M., Schmitz, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+continuous+evolution+of+genes+and+pathways+in+yeast.">In vivo continuous evolution of genes and pathways in yeast.</a> Nature Communications. 7, 13051 (2016).</li><li>Ravikumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+Continuous+Evolution+of+Genes+at+Mutation+Rates+above+Genomic+Error+Thresholds.">Scalable, Continuous Evolution of Genes at Mutation Rates above Genomic Error Thresholds.</a> Cell. 175, (2018).</li></ol>

Авторы, Брэндон г. Вонг и Ахмад с. Халил, являются сооснователями Fynch БиоНайс инк, которая разрабатывает платформу Эволвер, используемые в этой статье.

Выбор роста является незаменимым инструментом в биологии, широко используемый для создания и характеристики фенотипических различий между клеточной популяции. В то время как партии культур позволяют выбор роста ограниченным образом, непрерывные методы культуры резко расширяют степень контроля и предсказуемости этих экспериментов, оказывая точное регулирование по форме и динамике отбора, чтобы генерировать повторяемые количественные результаты22. Непрерывная культура используется для тщательного контроля отбора для библиотек высокого разнообразия20,23,24,25и для внедрения сложных адаптивных режимов в экспериментальных и направленная эволюция11,12,26,27. Непрерывная культура также позволяет точную характеристику клеток через массив количественно контролируемых условиях, чтобы лучше понять сложные генетические системы и оптимизировать инженерии штаммов биопроизводство9,14 , 28.
Однако, нет универсального протокола для непрерывной культуры, так как незначительные изменения в селективных условиях могут привести к резким изменениям биологических исходов4,29,30. Экспериментаторы должны уметь выбирать между режимами отбора и соответствующим образом адаптировать экспериментальные протоколы и оборудование. В дополнение к предложению выбора между параметрами управления, такие системы идеально будут достаточно сложными, чтобы самостоятельно управлять несколькими параметрами одновременно в высоко-параллельных экспериментах, которые необходимы для расшифровки взаимодействующих входов в сложных биологических систем (например, Эпистаз). Эволюционивер решает эту проблему, предоставляя пользователям возможность произвольно управлять обратной связью между условиями культуры и функциями флюидов для указания узкоспециализированных экологических ниш.
Чтобы преодолеть ограничения в текущей настройке и расширить или изменить параметры управления, смарт-рукав может быть легко изменен, чтобы добавить новые датчики или приводов. Дополнительно, уменьшая объем флакона уменьшал бы расходования средств, которые могут быть значительно в непрерывной культуре. В то время как текущий дизайн позволяет измерение и контроль температуры, агитация культуры, световой индукции, мутности, и флюидики, другие параметры должны быть измерены внешне путем отбора проб из флаконов. Текущая работа включает в себя способность контролировать ферментативную активность через люциферазы и регулировать растворенный кислород и pH непосредственно в культурах Эвовер. Кроме того, не будучи продемонстрирован в этой работе, Эвовер может взаимодействовать с новыми миллимузидической мультипикционными устройствами16 , которые рисуют на принципах крупномасштабной интеграции (происходящий из электроники и принятой микрофлюидией) для того, чтобы недорого включить более сложные флюидов обработки (например, мультиплексы флюидов входы, пузырек к флаконе переводы). Эти подарочные модули могут быть разработаны и изготовлены полностью в лаборатории, что позволяет пользователям маршрутных жидкостей программично приводя различные комбинации клапанов в автоматизированных fluiудических процедур. Это позволяет пользователям преодолевать жесткие флюидные конструкции, традиционно используемые в непрерывной культуре, а также масштабировать fluiудические возможности с высокой пропускной способностью с меньшим числом дорогостоящих элементов управления (например, периститетические насосы). Наконец, мы надеемся на включение автомасштабирования платформы, которая будет использовать эти миллифлюидики и DIY компонентов, преодоление ограничения ручного взаимодействия во время длительных и больших экспериментов, где выборки культур будет громоздким.
В дополнение к физическим модификациям платформы, веб-программное обеспечение открывает новые степени свободы, позволяя пользователям писать, редактировать и обмениваться пользовательскими скриптами эволюционирующих, генерируя полностью автоматизированные, основанные на обратной связи программы культуры (например, turbidostat). Пользователи могут программно развертки по параметру диапазоны в тонкие вариации на ту же схему отбора или подключить алгоритмы управления в новых комбинациях, чтобы указать любое количество сложных схем отбора. Кроме того, способность легко отслеживать культуры в режиме реального времени преобразует способ, в котором эксперименты проводятся. Мониторинг в режиме реального времени, пользователи могут 1) проверить согласованность между пробегов, критическая особенность для биопроизводство приложений и высокой пропускной способностью экспериментов, и 2) вмешиваться во время экспериментов, если это необходимо, чтобы устранить сложные штаммы, которые проявляют плохой рост или формирование биопленки, или диагностировать ошибки пользователей (например, загрязнение). Наконец, с несколькими потоками данных, собираемых и интерпретируется в режиме реального времени для каждой отдельной культуры, Эволюционивер генерирует высокую плотность данных, что может облегчить машинное обучение подходы для нового анализа вниз по течению.
Помимо продемонстрировали использует для пригодности характеристика, выбор библиотеки, и Лаборатория эволюции, мы рассматриваем ряд смежных областях, как созрели для реализации в Эвовер с интегрированной флюидики. эксперименты эвовера с образцами микробиома могли бы проанализировать стабильность сообщества в контролируемых средах31,32, исследовать состав микробиоты с помощью методов культуромики33, или динамично смешивать виды, чтобы Допросите экологическую динамику колонизации или вторжения34,35. Многочисленные методы непрерывной направленной эволюции биомолекул может быть легко реализована на устройстве, а26,36,37, значительно увеличивая доступность и пропускную способность этих систем. Способность оптимизировать условия выращивания, такие как состав СМИ, температура и деформаций в динамичной, высокой пропускной природы может помочь в оптимизации усилий для промышленного биомантуринга приложений9. Далее мы предусматриваем вертикально интегрирующую Эвовер с другими методами анализа, такими как микроскопия и поток цитометрии в замкнутом цикле моды, обеспечивая полностью автоматизированную систему для роста и анализа клеточных культур как в одиночной клетке, так и в популяции Уровней. Кроме того, с некоторыми аппаратными изменениями в смарт-рукав, таких как уплотнения судна и контроля содержания газа, Эволюционивер потенциально может быть адаптирована для поддержки роста более широкого диапазона типов клеток, таких как подвеска клеток млекопитающих. Также возможно поместить всю структуру в анаэробную камеру для анаэробной клеточной культуры. Заглядывая вперед, мы стремимся создать нашу программную основу в централизованную облачную инфраструктуру и считаем, что это позволит пользователям легко настраивать, анализировать и обмениваться своими данными удаленно без необходимости физически присутствовать в лаборатории. Функционирующая в качестве куратора данных, облачная инфраструктура также поддается крупномасштабным метаанализу во всех экспериментах. Мы предполагаем, что Эволюционивер и эти будущие достижения значительно расширят сферу возможных экспериментов по выбору роста, способствуя автоматизации и инновациям в непрерывной культуре.

Непрерывные методы культуры клетки, сперва превращили почти 70 лет тому назад1,2, наслаждаются недавним возрождением3,4. Это связано с стечением факторов. Во-первых, развитие методов высокой пропускной способности, которые сделали возможным зачтение и создание большого числа генотипов5,6, создало сопутствующий спрос на экспериментальные методики, облегчающие Хорошо контролируемый рост клеток и фенотипирование. С этой целью непрерывная культура представляет собой мощный экспериментальный подход, чтобы извлечь выгоду из возникающих достижений геномной. Содействуя росту/экспериментам над клеточными популяциями в точно контролируемых (и динамичных) условиях окружающей среды, непрерывная культура предоставляет средства для строгого сопоставления генотипов к фенотипам7,8, количественно охарактеризовать инженерии штаммов и организмов9, и отслеживать адаптивные генетические изменения в лабораторных исследований эволюции10,11,12.
Во-вторых, недавнее появление методов доступного прототипирования, таких как аддитивное производство и элементы аппаратного и программного обеспечения с открытым исходным кодом, позволило более широкому кругу пользователей разрабатывать и создавать свои собственные рентабельные формы непрерывных систем культуры непосредственно в лаборатории. Все это привело к захватывающим массив сделай сам (DIY) устройства, которые выполняют непрерывную функциональность культуры, такие как ххимиотерастат13, turbidostat14, или морбидостат15. К сожалению, хотя успех в решении конкретных (нишевых) проблем, для которых они были разработаны, эти специальные решения, как правило, не имеют возможности масштабировать в пропускной способности и/или экспериментальной конструкции сложности.
Система Эвовер была разработана с целью создания единой платформы, которая может вместить растущие экспериментальные потребности непрерывной культуры и соответствовать скорости и масштабу возникающих геномных методов16 (рис. 1a). Дизайн эволюционирует реализует общие принципы, лежащие в основе высоко масштабируемые технологии из других дисциплин17, в том числе стандартизированные следы, модульные компоненты, и с открытым исходным кодом принципы проектирования. Таким образом, решения для новых нишевых приложений могут быть спроектированы без серьезных изменений в системе. Состоит из высоко модульных и с открытым исходным кодом, оборудование, электроника, и веб-программное обеспечение, Эволюционивер является первой автоматизированной непрерывной системы культуры, которые могут быть экономически эффективно и легко повторно настроен на проведение практически любого типа эксперимент по росту высокой пропускной способности. Благодаря модульным и программируемым смарт-рукавам, в которых находятся все датчики и приводы, необходимые для управления отдельными культурами, Эволвер однозначно обеспечивает масштабирование как пропускной способности, так и индивидуального контроля условий культуры. Кроме того, как веб-платформа, Эвовер обменивается данными и информацией с удаленными компьютерами в режиме реального времени, позволяя одновременному мониторингу сотен отдельных культур и автоматизированной культуры возмущений через произвольно определенный контроль Алгоритмы.
В предыдущей работе16, надежные показатели Эволвер был продемонстрирован в долгосрочных экспериментах в течение сотен часов работы, и его способность культивировать различные организмы, от E. coli и с . цервиии для неодомашненных Микробов. Была проведена серия различных экспериментов по отбору, в которых программно определены многомерные градиенты отбора были применены по всему спектру индивидуальных условий культуры и в результате этого клеточные фитнес-ландшафты были Количественно. Здесь цель состоит в том, чтобы предоставить пользователям Эвовер описание того, как использовать систему для проектирования и этих типов экспериментов. В качестве иллюстративного примера, методы количественного фитнес-пейзаж с. сервициэ мутантов через двумерный экологический градиент, состоящий из температуры и осмотического напряжения представлены. Протокол направляет пользователей через настройку платформы Эвовер для этого эксперимента как программно, в использовании программного обеспечения для установки заказной мутности и контроля температуры процедуры для каждой из 16 параллельных культур непрерывного, и физически, через макет флюидики надлежащим образом маршрут СМИ различной концентрации соли. Этот протокол должен служить в качестве общей рубрики для настройки Эволюционивер для выполнения широкого спектра автоматизированных непрерывных экспериментов культуры для различных исследований и дисциплин.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Gallon Plastic Hedpack with cap</td>
			<td>Midwest Brewing and Winemaking Supplies</td>
			<td>45-56Y8-E2FR</td>
			<td>For waste collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-D(+)-Glucose</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>00805</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Autosampler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine population fractions via single cell fluoresence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118-07-0</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8&#34; Tube ID, 250&#176;F Maximum Temperature</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>5121K731</td>
			<td>For media input branching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50371500</td>
			<td>For Sterilization of fluidic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom eVOLVER vial lid</td>
			<td>FynchBio</td>
			<td></td>
			<td>Lid has ports for sampling and fluidic input/output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10018301</td>
			<td>For flow cytometry sampling plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For sterilization of fluidic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eVOLVER Unit</td>
			<td>FynchBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-420</td>
			<td>For vial sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-57</td>
			<td>Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB8002000</td>
			<td>Must be fitted with tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8&#34; ID, 1/4&#34; OD</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51135K73</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Mini</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>For running the experiment/collecting data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP243820</td>
			<td>For flow cytometry sampling plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K141</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K144</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K291</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K294</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-4910-04</td>
			<td>Culture vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fsher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring OD600 of overnight cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-4902-08</td>
			<td>Culture vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing automated, high-throughput, continuous cell growth experiments using evolver

Непрерывные методы культуры позволяют клеткам выращиваемых в количественно контролируемых экологических условиях, и, таким образом, широко полезны для измерения фенотипов фитнеса и улучшения нашего понимания того, как генотипы формируются путем выделения. Обширные недавние усилия, направленные на разработку и применение нишевых устройств непрерывной культуры, выявили преимущества проведения новых форм контроля за культурой клеток. Это включает в себя определение пользовательского давления отбора и увеличения пропускной способности для исследований, начиная от долгосрочных экспериментальных эволюции генома широкий выбор библиотеки и синтетической схемы гена характеристика. Платформа Эволюционивер была недавно разработана для удовлетворения растущего спроса: непрерывная платформа культуры с высокой степенью масштабируемости, гибкости и автоматизации. Эвовер обеспечивает единый стандартизацию платформы, которая может быть (пере)-настроен и масштабируется с минимальными усилиями для выполнения многих различных типов высокой пропускной способностью или многомерных экспериментов отбора роста. Здесь представлен протокол для предоставления пользователям фреймворка Эвовер описание для настройки системы для проведения пользовательского, крупномасштабный непрерывный эксперимент роста. В частности, протокол направляет пользователей о том, как запрограммировать систему на мультиплексный два выбора давления-температура и осмоллярность-через многие флаконы Эвовер для того, чтобы количественно фитнес-пейзажи сахаромицеты сервициэ мутанты в порядке Разрешение. Мы показываем, как устройство может быть настроено как программно, через его с открытым исходным кодом веб-программное обеспечение, и физически, путем организации fluiудической и аппаратной макеты. Процесс физически настройке устройства, программирование культуры рутины, мониторинг и взаимодействующих с экспериментом в режиме реального времени через Интернет, выборки флаконов для последующего автономного анализа, и после эксперимента анализа данных являются подробными. Это должно послужить отправной точкой для исследователей различных дисциплин, чтобы применить Эвовер в разработке своих собственных сложных и высокопроизводительных экспериментов по росту клеток для изучения и манипулирования биологическими системами.

Описанный здесь протокол использовался для построения фитнес-карт для генетических вариантов с. цервициэ через двумерный градиент напряжения температуры и солености. В частности, для каждого варианта деформации, мы использовали Эвовер для проведения pairwise конкуренции эксперименты против флуоресцентно-помечены ссылкой штамм (S. cer штамм BY4741 с интегрированными учредительный репортер mNeonGreen) в 16 различных комбинации этих напряжений (рис. 1). Для вариантов, два нокаут штаммов были выбраны каждый предсказал быть чувствительны к одному из стресса осей условие: ΔPRX1 который, как сообщается, имеют дефекты фитнес в высоких температурах20 и ΔPBS2 с Фитнес дефекты на высокой концентрации соли21. В качестве контрольного варианта использовался немаркированные штамм BY4741 дикого типа, которые, как ожидается, будут выполнять аналогично эталему деформации. В общей сложности, эти 3 72-часовой конкурс эксперименты проводились одновременно в 48 флаконы через три Эвовер (16-флакон) устройства все запустить с одного компьютера.
Интерактивная приборная панель Эвовер используется для навигации большого объема данных, генерируемых в ходе каждого эксперимента (Диаграмма 2A). Репрезентативные следы OD во всех 16 флаколах одного устройства Эвовер показаны на рисунке 2B. Каждый след отображает характерную пилозуб из алгоритма управления турбидостатом, который использует обратную связь на OD для запуска разведений и поддержания культур в узком диапазоне плотности (0,2-0,3 в данном случае). Данные о состоянии и температуре непрерывно измеряются, передаются в базу данных с поддержкой облака и обновляются в режиме реального времени в интерактивной приборной панели Эволюционивер. Из непрерывно потоковых данных показатели более высокого порядка (например, темпы роста, совокупные поколения) могут быть рассчитаны и нанесены на приборную панель (Рисунок 2C) и даже используются в качестве параметров обратной связи в различных схемах отбора (например, мормордостат).
Чтобы создать фитнес-карты, мы измеряем скорость, с которой эталон переконкурирует с вариантом деформации, включив измерения потока цитометрии и данные о росте Эвовера. В частности, популяции фракций вычисляются как соотношение между вариантом деформации по эталону, используя данные потока цитометрии из каждого образца времени. Для каждой культуры и времени, прошедшее число поколений интерполируется от данных о темпах роста в каждом периоде разбавления. Построение отношения бревна против поколений, качественные различия между условиями начинают появляться (Рисунок 3A). Для расчета пригодности, склон подходит через линейную часть каждого участка18,19, уступая количественное значение Фитнес (с обеих знак и скорость), который описывает, как вариант штамм конкурирует против эталонных штамма ( Рисунок 3B). В этом эксперименте отрицательные значения пригодности указывают на то, что вариант штамма превосходит по эталонных штаммов. Построение теплокарт из всех фитнес-вычислений позволяет визуализировать двумерный фитнес-ландшафт, выявляя тонкие количественные различия в производительности между штаммами и условиями (Рисунок 3C).
Из фитнес-карты, мы видим, что каждый вариант штамма экспонатов фитнес дефекты, которые проявляются в различных формах. ΔPRX1 в первую очередь чувствительны к высоким температурам, но соль стресс, как представляется, добавка эффект, увеличивая фитнес дефект. И наоборот, ΔPBS2 показывает фитнес дефекты в первую очередь в ответ на высокие концентрации соли, с минимальными различиями вдоль оси температуры. Эти результаты подчеркивают полезность экспериментов по отбору в высоком разрешении, особенно для расшифровки взаимодействий множественных факторов экологического стресса, которые могут иметь Аддитивные, синергетические или эпистатические эффекты.
Наконец, важно отметить, что в некоторых случаях, особенно при тяжелых условиях стресса, Фитнес расчеты могут привести к преувеличенным или искаженные результаты. Например, кажется, что ΔPBS2 показывает крутой положительный наклон в состоянии 39 °c/1 M относительно эталонных штаммов (Рисунок 3a). Это объясняется плохим ростом обоих штаммов, что отражено в данных дикого типа и ограничивает полезность данной метрики в этом состоянии. Недостаточное число поколений приводит к 1) бедное разделение точек времени, которое мешает фитинга склона, и 2) чувствительность к стохастической эффекты, возникающие из фазы ЛАГ. Хотя мы не решили сделать это в этом исследовании, данные о росте в реальном времени, собранные Эвовер во время эксперимента, можно было бы использовать для информирования о решении продлить эксперимент и собрать дополнительные временные точки для этого условия с небольшим усилием. В последующих экспериментах, начиная коэффициенты могут также быть модулированы, чтобы продлить длину линейного региона до насыщения происходит.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3.jpg"> Рисунок 1: обзор структуры Эвовер и экспериментального дизайна. A) эвовер является автоматизированной непрерывной платформой для культуры, позволяющей многопараметру контролировать условия культуры. Платформа состоит из смарт-рукава, в котором находятся датчики и приводы для управления условиями культуры, перисталический массив насоса для текучий носитель и отходы в и из культур, сенсорный экран для взаимодействия вручную с устройством, и компьютер используется для взаимодействия с облачной инфраструктурой, где передаются данные с платформы. (B) эвовер может быть настроен несколькими способами: физически, через ячейки и средства массовой информации входы, и программно, регулируя алгоритмы управления смарт-рукав флакона культуры модулей. Это может быть использовано для программы многомерного отбора/экологические градиенты в высоком разрешении, с выходы, состоящие из физически собранных ячеек в определенных временных точках и в режиме реального времени потокового данных культуры. (C) Настройка Эвовера для проведения фитнес-эксперимента роста через двумерный градиент выделения, состоящий из температуры и осмотического напряжения. флаконы культуры Эвовер были посеяны равными пропорциями эталона и варианта штамма дрожжей. Режим turbidostat был запрограммирован для поддержания всех культур в экспоненциальной фазе в определенном окне OD (OD 0,2-0,3). Температура и условия в средствах массовой информации были разнообразны через массив смарт-рукав, чтобы сформировать два независимых градиентов напряжения. Базовые средства массовой информации состояли из ИПД (2% глюкозы) + 100 мкг/мл карбенциллин + 25 мкг/мл хлорамфеникола в качестве меры предосторожности против бактериального заражения. Медиа композиции были разнообразны, добавив дополнительный нав до 0 м, 0,6 M, 0,8 M, или 1,0 м. температура была запрограммирована на одно из четырех значений: 30 ° c, 35 ° c, 37 ° c, или 39 ° c. D) примеры сырья для культуры ОД и фракций населения в трех проверенных условиях. Эксперимент по конкуренции был сохранен для 72 h, пробуя на 24 h и затем каждые 12 h до заключения эксперимента. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig2.jpg"> Рисунок 2: Эвовер в реальном времени анализа данных приборной панели. (A) эвовер данные обрабатываются и передаются в режиме реального времени с помощью облачного программного обеспечения в интерактивную приборную панель. Через приборную панель, пользователи могут определить и инициировать свои собственные режимы культуры на подключенный Эволюционивер, монитор в настоящее время работает эксперименты по всем подразделениям Эвовер, и изменять экспериментальные условия вручную на отдельных флакон или набор флаконов, если это необходимо. (B) OD трассировки для каждого флакона по матрице условий, протестированных на протяжении всего эксперимента. Трассировки можно просматривать в реальном времени, чтобы убедиться, что эксперимент выполняется по желанию и используется после эксперимента для дальнейшего анализа. (C) темпы роста и клеточных поколений можно вычислить из следов OD на лету, чтобы отслеживать прогресс эксперимента. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig3.jpg"> Рисунок 3: Строительство фитнес-поверхностей. (A) ячейки популяции фракций естественный лог (вариант штамма/ссылка штамм) заговор против клеточных поколений. Цвет указывает на температуру выделения, а капли выделяют концентрацию соли. (B) для количественной оценки относительной пригодности варианта к эталему деформации, метрика пригодности получена от скорости, с которой клеточная фракция изменяется за поколения. Эта метрика рассчитывается из линейной области клеточных участков фракции, используя как минимум три точки. (C) относительные метрики пригодности отображаются на теплокарте для построения фитнес-поверхности над градиентами экологического стресса. Верхний правый угловой условие (39 ° c/1.0 M) для дикого типа и ΔPBS2 не включены в этот анализ, поскольку культуры прошли через недостаточное поколение (см. репрезентативные результаты). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER at JoVE.com

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Фреймворк «Эвовер» обеспечивает высокопропускную непрерывную микробную культуру с высоким разрешением и динамическим контролем над экспериментальными параметрами. Этот протокол демонстрирует, как применять систему для проведения сложного фитнес-эксперимента, направляя пользователей на программирование автоматизированного контроля над многими отдельными культурами, измеряя, собирая и взаимодействуя с экспериментальными данными в режиме реального времени.

Проектирование автоматизированных, высокая пропускная способность, непрерывный рост клеток эксперименты с использованием Эволюционивер

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

eVOLVER дает исследователям экспериментальную свободу, возможность определять свои собственные эксперименты роста культуры с автоматизированной обратной связью по нескольким параметрам и масштабировать ее до любого размера, который им нужен. eVOLVER является более гибким, чем другие устройства. Пользователи могут легко настроить программное обеспечение в Python, а также аппаратное обеспечение, путем изменения умных рукавов, которые держат датчики для каждой культуры.Система может показаться сложной на первый взгляд с несколькими компонентами и соединениями. Визуальное руководство дает пользователям впервые больше уверенности в самостоятельном запуске экспериментов. Правильная настройка имеет решающее значение.Не забудьте понять, что делает каждый компонент. Таким образом, вы можете подтвердить, что они работают. Убедитесь, что все правильно и тесно связано.В то время как предназначен для аэробного культивирования бактерий и дрожжей в различных условиях, eVOLVER также может быть изменен для анаэробного брожения или для поддержания клеток млекопитающих в подвеске. Это видео продемонстрирует, как настроить, инициализировать и запустить высокую пропускную способность непрерывного культурного эксперимента с помощью платформы eVOLVER. За день до эксперимента подготовь средства массовой информации, флаконы и инокулум в соответствии с рукописью.В трех больших стаканах приготовьте два стакана по 10% отбеливателя и один стакан из 70% этанола. Используя выключатели на устройстве eVOLVER, включите пятивольтовое питание на eVOLVER, подождите пять секунд, затем включите 12 вольт питания. При запуске нескольких флаконов из одной и той же бутылки мультимедиа подключите несколько линий ввода мультимедиа с трубчатыми сплиттерами.Пользовательские трубные сплиттеры могут быть построены с более низкими компонентами. Погрузите линии ввода мультимедиа в первый стакан отбеливателя и линии медиа-эфлюкса во втором стакане отбеливателя. Подключите нижний конец линий ввода мультимедиа ко второму стакану с линиями eflux.Поместите линии отходов в отходы carboy. Добавьте один-два литра отбеливателя в отходы carboy стерилизовать отходы, образуюсь в ходе эксперимента. Используя сенсорный экран на eVOLVER, перейдите в раздел установки и запустите все насосы в течение 20 секунд, чтобы заполнить линии жидкости с 10%bleach.Разрешить отбеливатель сидеть в очередях, по крайней мере 30 минут, чтобы стерилизовать. Запустите насосы снова с помощью сенсорного экрана, пока линии больше не погружаются, толкая воздух через линии, чтобы получить как можно больше отбеливателя, как это возможно. Поместите линии ввода мультимедиа в стакан этанола, заполните линии этанолом, промойте их воздухом.Затем прикрепите линии ввода мультимедиа к медиа-бутылкам с нижними разъемами и запустите насосы до тех пор, пока средства массовой информации полностью не пробегут через линии, промывки любого остаточного этанола. Частично вставьте стерилизованные флаконы в смарт-рукава eVOLVER и подключит входные линии к короткой соломе притока и линиям отходов к длинному eflux strawq в соответствии с цветовой кодировкой. Отрегулируйте на сенсорном экране eVOLVER для запуска всех насосов в 10 секунд шагом, чтобы заполнить флаконы со средствами массовой информации.Обеспечить визуальный осмотр, eflux насосы эффективно удаления средств массовой информации через eflux соломинки для предотвращения переполнения. Затем, нажмите флаконы вниз, пока полностью заключены смарт рукав. На интерактивной странице интерактивной настройки сенсорного экрана eVOLVER перетащите палец через сенсорный экран или нажмите кнопку Select All, чтобы выбрать все флаконы и установить начальные условия температуры на уровне 30 градусов по Цельсию и перемешать до 10.На компьютере укажите устройство eVOLVER, на которое будет работать эксперимент. Убедитесь, что были выбраны желаемые настройки калибровки. Откройте панель мониторинга eVOLVER и перейдите на страницу Experiment Manager.Выберите базовый эксперимент в панели Experiment Navigator или существующий эксперимент в качестве отправной точки и нажмите Клон. Перейдите на страницу редактора эксперимента. Используйте панели Vial Selector и Параметр определения, чтобы настроить температуру до 30 градусов по Цельсию и установить верхний и нижний порог OD для каждого флакона в соответствии с экспериментальной конструкцией.Сохранить эксперимент, нажав Сохранить. Затем нажмите на стрелку, чтобы вернуться на страницу Менеджер эксперимента и нажмите кнопку Воспроизведение для запуска. После начала эксперимента перейдите на панель данных в режиме реального времени в интерактивной панели мониторинга.Для каждого флакона проверьте, что значения OD держатся на нуле. Просмотрите графики температуры, чтобы проверить, что температура находится на уровне или прогрессирует к 30 градусов по Цельсию. Чтобы подготовить инокулум, сначала измерьте OD ночных культур и вычислите желаемое полное разбавление для ночных культур, предполагая объем флакона 25 миллилитров и желаемый стартовый ОД около 0,05.Через порт отбора проб, пипетка рассчитывается объем инокулы или смеси инокулы. Проверьте графики на приборной панели, чтобы увидеть, что OD увеличивается до 0,05. Рост клеток и состояние флакона можно контролировать в режиме реального времени, как эксперимент продолжается, что позволяет исследователю вмешаться, если какие-либо проблемы возникают.eVOLVER - это автоматизированная платформа непрерывной культуры, позволяющая многопараметровый контроль культурных условий. Квалификационные различия были показаны между диким типом, чувствительными к температуре и чувствительными к соли группами, когда коэффициенты журнала были построены против поколений, интерполированных из данных о темпах роста eVOLVER. Цвет указывает на температуру отбора, в то время как тире различать концентрации соли.Наклон, протяжаемый через линейную часть каждого участка, используя минимум три точки, дает количественное значение пригодности, которое описывает, как штамм варианта конкурирует с эталонным штаммом. Отрицательные значения пригодности показывают что напряжение варианта out-competed напряжением справки. Всегда проверяйте, что все насосы работают эффективно и что линии жидкости не подальше от любых засоров.Переполнение может разрушить эксперимент и потенциально повредить умные рукава. Образцы, взятые из eVOLVER, могут быть впоследствии секвенированы для проверки геномных изменений в результате эксперимента. Эта информация может быть использована для инженера новых штаммов или систем.Для исследователей, использующих эволюцию лаборатории или выбор библиотеки, легко применять уникальное давление отбора в каждом эксперименте eVOLVER. Контроль обратной связи и динамические среды теперь также очень доступны. Отходы carboy будет содержать небольшое количество отбеливателя и этанола после эксперимента.Проконсультируйтесь со своим координатором по безопасности лаборатории для надлежащей утилизации отходов.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Роботизированной платформы для высокой пропускной способности выделения протопластов и трансформации

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Возмущения Циркулирующие микроРНК при синдроме раздраженного кишечника Обнаружен Использование Multiplexed высокой пропускной способностью экспрессии генов платформы

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Высокопроизводительный роботизированная Изоляция термочувствительных Смертельное Мутанты в<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Использование Флуоресцентный ПЦР-капиллярного электрофореза гель Техника генотипу CRISPR / cas9-опосредованной Нокаут Мутанты в формате высокой пропускной способностью

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Высоким содержанием жиров питание и высокая пропускная способность Triacylglyceride Assay в Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Поколения родной Chromatin иммунопреципитации секвенирования библиотек для анализа плотности нуклеосома

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Надежные ДНК изоляции и высокопроизводительного секвенирования строительство библиотеки для образцов гербария

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Высок объём идентификации наркотиков синергических сочетаний методом дублирования2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Одной молекулы флуоресценции In Situ гибридизация (smFISH) анализ многообещающий вегетативного роста дрожжей и мейоз

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...