Name: designing automated, high-throughput, continuous cell growth experiments using evolver
Uploaded: 2019-05-19T14:30:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER at JoVE.com

Agradecemos a B. Stafford por su ayuda en el diseño del sistema, y H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. Pipe, y a. Cavale para la ayuda con la construcción del sistema. Reconocemos el servicio de diseño electrónico (EDF), el centro de innovación de productos de ingeniería (EPIC) y el software & Application Innovation Lab (SAIL) en el Instituto Hariri de computación de la Universidad de Boston por sus servicios. Este trabajo fue apoyado por un premio de carrera de la NSF (MCB-1350949 a A.S.K.), y DARPA otorga HR0011-15-C-0091 y HR0011-18-2-0014 (a A.S.K.). A.S.K. también reconoce el financiamiento del nuevo premio Innovator del Director de la NIH (1DP2AI131083-01), el premio DARPA de la Facultad joven (D16AP00142) y las expediciones NSF en computación (CCF-1522074).

1. preparación de medios, viales e Inóbulo
Nota: Este protocolo asume que los usuarios ya han calibrado el sistema eVOLVER y están utilizando la configuración de Smart Sleeve descrita en el trabajo anterior16. Las mangas inteligentes se rediseñan o modifican fácilmente, pero los detalles de configuración de los parámetros de volumen y control pueden diferir para configuraciones alternativas.
<ol><li>El día antes del experimento, prepare 2 mL de cultivos líquidos durante la noche de cepas de referencia de S. cerevisiae BY4741 y variantes en medios YPD (levadura peptona dextrosa) a 30 ° c en una incubadora agitada de al menos 300 r.p.m.</li>
	<li>Transfiera los medios de YPD estériles a botellas limpias y esterilizadas en autoclave equipadas con tubos. Alternativamente, los medios pueden ser esterilizados en autoclave directamente en botellas pre-equipadas con tubos. Nota: Las botellas se ajustan con el tubo perforando un orificio en la tapa y ejecutando el tubo a través de él con conectores para asegurarla en su lugar. Ver tabla de materiales.</li>
	<li>Añadir la barra de agitación a cada vial y atornillar una tapa de vial equipada con las pajitas de flujo y derrame. Asegúrese de que todos los componentes estén limpios mediante inspección visual.</li>
	<li>Coloque los viales en un bastidor autoclavable, cubra con papel de aluminio y autoclave en un ciclo de gravedad o vacío con un paso de esterilización de 20 minutos.</li>
</ol>2. configuración de un experimento
<ol><li>En tres grandes vasos de precipitados, prepare 500 mL de lejía al 10%, 200 mL de lejía al 10% y 300 mL de etanol al 70%.</li>
	<li>Utilizando los interruptores del dispositivo eVOLVER, encienda la fuente de alimentación de 5 V en el eVOLVER, espere 5 s y, a continuación, encienda la fuente de alimentación de 12 V.</li>
	<li>Si ejecuta varios viales del mismo frasco de medios, conecte varias líneas de entrada de medios con divisores de tubos. Los divisores de tubos personalizados se pueden construir con componentes Luer.</li>
	<li>Sumerja las líneas de entrada de medios en el primer vaso de lejía y las líneas de efluente de los medios en el segundo vaso de lejía. Coloque el extremo descendente de las líneas de entrada de medios en el segundo vaso de precipitados con las líneas de efluente. Coloque las líneas de desecho en el CARBOY de desecho.</li>
	<li>Agregue 1-2 L de blanqueador en un gran CARBOY de desecho vacío, que esterilizará los desechos generados durante el experimento. Consulte con un coordinador de seguridad para asegurar la eliminación adecuada de los desechos.</li>
	<li>Utilizando la pantalla táctil del eVOLVER, navegue hasta la sección de configuración y ejecute todas las bombas durante 20 s para llenar las líneas fluidas con un 10% de lejía. Mientras se ejecuta, asegúrese mediante inspección visual de que todas las líneas se han llenado y que las bombas están operando normalmente. Deje que el cloro se siente en las líneas durante al menos 30 minutos para esterilizar.</li>
	<li>Vuelva a ejecutar las bombas utilizando la aplicación de pantalla táctil hasta que las líneas ya no estén sumergidas, empujando el aire a través de las líneas para obtener la mayor cantidad de cloro posible.</li>
	<li>Coloque las líneas de entrada de los medios en el vaso de etanol y repita como en la parte superior, llenando las líneas con etanol y enjuagando con aire. Nota: Como el etanol mata rápidamente, no hay necesidad de esperar 30 minutos para la esterilización.</li>
	<li>Conecte las líneas de entrada de medios a las botellas de medios con los conectores luer y ejecute las bombas hasta que el medio se ejecute completamente a través de las líneas, enjuagando cualquier etanol residual.</li>
	<li>Inserte parcialmente viales esterilizados en las mangas inteligentes eVOLVER y conecte las líneas a las posiciones apropiadas, de acuerdo con la codificación de color en las líneas. Empiece por unir las líneas de entrada a la pajita de afluencia corta, y luego pierda las líneas a la paja de derrame largo. PRECAUCIÓN: Es fundamental comprobar si hay conexiones sueltas o líneas enrutadas incorrectamente. Si no lo hace, causará desbordamientos y potencialmente dañará la funda inteligente.</li>
	<li>Ejecute todas las bombas en incrementos de 10 s para llenar los viales con medios. Asegúrese de que las bombas de eflujo de inspección visual están eliminando eficientemente los medios a través de las pajitas de eflujo, para evitar desbordamientos. Si las pajitas de eflujo no parecen estar funcionando eficientemente, inspeccione las conexiones de la línea de fluido y la bomba peristóntica. Corrija o reemplace las piezas según sea necesario.</li>
	<li>Empuje los viales hasta que estén completamente encerrados por la funda inteligente.</li>
	<li>Establezca las condiciones iniciales para los parámetros experimentales utilizando la pantalla táctil de eVOLVER en la página de configuración interactiva. Para todos los viales, ajustar la temperatura a 30 ° c y el revuelo a 10. Esto se puede hacer para todos los viales a la vez arrastrando un dedo a través de la pantalla táctil para seleccionar todos los viales.</li>
</ol>3. configurar eVOLVER software y programar rutinas de cultura algorítmica
<ol><li>En el panel eVOLVER de un equipo, vaya a la página del administrador de experimentos. Seleccione el experimento base en el panel navegador de experimentos o un experimento existente como punto de partida y haga clic en clonar nuevo. Nota: Es posible utilizar experimentos de otros grupos pegando el enlace de GitHub al repositorio donde la definición experimental se guarda en el administrador del experimento.</li>
	<li>Especifique el nombre del experimento y el dispositivo eVOLVER en el que se ejecutará el experimento. Asegúrese de que se han seleccionado los ajustes de calibración deseados modificando estos campos en la página.</li>
	<li>Utilice el selector de viales y los paneles de definición de parámetros para establecer condiciones experimentales. Por ejemplo, para ajustar la temperatura de los viales 0-4 a 30 ° c, seleccione los viales en el selector del vial, establezca la definición de parámetro en 30 y haga clic en establecer. Repita este procedimiento para OD para establecer un umbral superior e inferior para cada vial.</li>
	<li>Después de completar las definiciones de parámetros experimentales, guarde el experimento haciendo clic en Guardar y haga clic en iniciar para ejecutar.</li>
</ol>4. iniciando experimento y monitorización en tiempo real
<ol><li>Una vez que el experimento esté en curso, navegue hasta el panel de datos en tiempo real en el panel interactivo. Para cada vial, compruebe que los valores OD se mantienen en cero, y que las temperaturas están en o avanzando hacia niveles programados navegando a través de los gráficos.</li>
	<li>Para preparar el inóbulo, mida la OD de los cultivos nocturnos, calcule la dilución de pliegue deseada asumiendo un volumen vial de 25 mL, y Pipetee el volumen calculado del inóbulo en viales a través del puerto de muestreo. Por ejemplo, para alcanzar un OD inicial deseado de alrededor de 0,05 en el vial de cultivo de cultivos nocturnos que estén en OD 2,0, se deben añadir 625 μL de células a cada vial.</li>
	<li>Compruebe los gráficos en el panel para ver que los gráficos OD se han actualizado en consecuencia. Un aumento a cerca de la OD inicial deseada se debe ver en los gráficos.</li>
	<li>Realice un seguimiento de diferentes tipos de datos (como OD, temperatura, tasa de crecimiento, generaciones y consumo de medios) a lo largo del experimento navegando a través de los gráficos correspondientes en el panel. Estos valores pueden informar decisiones experimentales por parte del usuario (p. ej., puntos de tiempo de programación) o incluso utilizarse en funciones para realizar comentarios automatizados.</li>
	<li>Para reemplazar las botellas de medios experimento medio, detenga el experimento en el panel del administrador del experimento para evitar que ocurran eventos de bomba. Desenrosque rápidamente la línea de medios de la botella vacía y conéctelo a la nueva botella. Evite tocar los extremos del tubo para evitar la contaminación. Reanude el experimento en el administrador del experimento.</li>
</ol>5. muestreo de células de levadura de eVOLVER viales
<ol><li>Prepare una solución de cicloheximida para inhibir la síntesis de proteínas y fijar las células de levadura para el análisis de citometría de flujo. En un tubo cónico de 15 mL, añadir 12 mL de PBS y 12 μL de 20 mg/mL de cicloheximida y vórtice durante 5 s.</li>
	<li>Utilizando una picada multicanal, alícuota 100 μL en cada pozo de una placa inferior de 96-bien redonda.</li>
	<li>Envolver la placa en papel de aluminio para bloquear la luz y mantener a 4 ° c hasta que sea necesario.</li>
	<li>Para muestrear, Pipetear a través del puerto de muestreo de la tapa del vial utilizando puntas de longitud extendida 200 μL.</li>
	<li>Pipetear 100 μL de un vial a un pozo en la placa de fijación, mezclando 2-3x por pipeteo hacia arriba y hacia abajo, luego recupérese en papel de aluminio y devuelva la placa a 4 ° c.</li>
</ol>6. experimente romper y limpiar
<ol><li>Prepare 1 L de 10% de lejía y 2 500 mL de soluciones de agua DI en grandes vasos de precipitados.</li>
	<li>Detenga el experimento enviando el comando STOP en el panel del administrador de experimentos. Los datos todavía se almacenan en la base de datos habilitada para la nube, y todavía se pueden ver más adelante en el panel de datos en tiempo real del panel o descargar para el análisis sin conexión.</li>
	<li>Retire los viales de Smart sleeves y colóquelo en un rack de autoclave para evitar desbordamientos en los siguientes pasos.</li>
	<li>Desenroscar las líneas de entrada de los medios de las botellas de los medios y colocarlos en el vaso de lejía 10%. Ejecute bombas desde la interfaz de usuario de eVOLVER como en la configuración para esterilizar líneas y viales.</li>
	<li>Desconecte las líneas de los viales y sumerja las líneas en el agua DI. Ejecutar bombas para eliminar todo el cloro del sistema primero con agua DI, luego con el aire.</li>
	<li>Apague eVOLVER apagando primero la fuente de alimentación de 12 V, esperando 5 s, y luego apagando la fuente de alimentación de 5 V.</li>
	<li>Remoje las barras y las tapas en un 10% de lejía y enjuáguelas con agua DI. Asegúrese de enjuagar la afluencia y las pajitas de eflujo de cada tapón mediante la ejecución de agua DI a través de ellos. Limpie los viales usando un cepillo de tubo de prueba si se ha formado una película en las paredes.</li>
	<li>Deseche los desechos apropiadamente y enjuague bien los recipientes de desecho. PRECAUCIÓN: Los recipientes de desechos contendrán una mezcla de 10% de lejía, desechos de cultivos celulares esterilizados y cantidades traza de etanol. Consulte a un coordinador de seguridad para un manejo y eliminación adecuados.</li>
</ol>7. cuantificación de la aptitud mediante el análisis de citometría de flujo de poblaciones fraccionadas
<ol><li>Analice las muestras recogidas de la sección 5 utilizando un CITOMETRO de flujo equipado con el canal de fluorescencia y los detectores16apropiados.</li>
	<li>Adquiera al menos 10.000 eventos por muestra y puerta para celdas intactas utilizando los datos de dispersión de avance y de lado.</li>
	<li>Puerta basada en el canal de fluorescencia apropiado (p. ej., GFP) para determinar la distribución fraccional de cada población.</li>
	<li>En un equipo, guarde los datos en la ubicación deseada desde la página Administrador de experimentos haciendo clic en el botón "exportar".</li>
	<li>En los archivos de datos de eVOLVER, determine el número de generaciones completadas por cada punto de tiempo para cada vial. En el código eVOLVER, las generaciones se calculan primero segmentando los datos OD entre cada evento de dilución, luego cada segmento es apto con un exponencial básico de la <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq1.jpg"> forma a cada segmento, produciendo r, la tasa de crecimiento16. El número de generaciones durante un período de tiempo se calcula mediante la siguiente fórmula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq2v2.jpg">
</li>
	<li>Trazar la relación logaritmo de las poblaciones etiquetadas y sin etiquetar a partir de los datos de citometría de flujo frente al número de generación de los cálculos anteriores en el momento en que se tomaron las muestras. Identifique la región lineal y ajuste la pendiente de acuerdo con la siguiente ecuación. Esta pendiente se define comúnmente como la aptitud competitiva18,19. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq3v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
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C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+the+human+microbiota+and+culturomics.">Culturing the human microbiota and culturomics.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).</li><li>Fukami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+Contingency+in+Community+Assembly:+Integrating+Niches,+Species+Pools,+and+Priority+Effects.">Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).</li><li>Friedman, J., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+systems+biology:+The+dynamics+of+interacting+populations.">Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations.</a> Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).</li><li>Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. 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Los autores, Brandon G. Wong y Ahmad S. Khalil, son cofundadores de Fynch BioScience Inc., que desarrolla la plataforma eVOLVER utilizada en este artículo.

La selección del crecimiento es una herramienta indispensable en la biología, ampliamente utilizada para generar y caracterizar las diferencias fenotíricas entre las poblaciones celulares. Mientras que los cultivos por lotes permiten la selección de crecimiento de una manera limitada, las técnicas continuas de cultivo amplían drásticamente el grado de control y previsibilidad de estos experimentos, ejerciendo una regulación precisa sobre la forma y la dinámica de la selección para generar resultados repetibles y cuantitativos22. Se ha empleado la cultura continua para controlar rigurosamente la selección de las bibliotecas de alta diversidad20,23,24,25, y para implementar sofisticados regímenes adaptativos en experimentos y dirigió la evolución11,12,26,27. La cultura continua también permite una caracterización precisa de las células a través de una serie de condiciones controladas cuantitativamente para comprender mejor los sistemas genéticos complejos y optimizar las cepas de bioproducción de ingeniería9,14 , 28.
Sin embargo, no existe un protocolo universal para la cultura continua, ya que los cambios sutiles en las condiciones selectivas pueden llevar a cambios drásticos en los resultados biológicos4,29,30. Los experimentadores deben poder elegir entre los regímenes de selección y adaptar los protocolos y equipos experimentales en consecuencia. Además de ofrecer una opción entre los parámetros de control, estos sistemas serían idealmente lo suficientemente sofisticados como para administrar de forma independiente varios parámetros simultáneamente en experimentos altamente paralelos que son necesarios para descifrar las entradas de interacción en complejos sistemas biológicos (p. ej., epistasis). eVOLVER aborda este desafío al permitir a los usuarios programar arbitrariamente el control de retroalimentación entre las condiciones de cultivo y las funciones fluícas para especificar nichos ambientales altamente especializados.
Para superar las limitaciones de la configuración actual y expandir o cambiar los parámetros de control, el Smart Sleeve podría rediseñarse fácilmente para añadir nuevos sensores o actuadores. Además, reducir el volumen del vial disminuiría los gastos de los medios, que pueden ser significativos en la cultura continua. Si bien el diseño actual permite la medición y el control de la temperatura, la agitación de la cultura, la inducción de la luz, la turbidez y los fluidics, otros parámetros deben medirse externamente mediante el muestreo de los viales. El trabajo actual incluye la incorporación de la capacidad de monitorear la actividad enzimática a través de luciferasa y regular el oxígeno disuelto y el pH directamente en las culturas eVOLVER. Además, aunque no se demuestre en este trabajo, eVOLVER puede interactuar con nuevos dispositivos de multiplexación milifluídica16 que se basan en los principios de integración a gran escala (originarios de la electrónica y adoptados por microfluidos) con el fin de permiten un manejo de fluidos más complejo de manera económica (p. ej., entradas de fluidos multiplexados, transferencias de vial a vial). Estos módulos de wetware pueden diseñarse y fabricarse completamente en el laboratorio, lo que permite a los usuarios enrutar fluidos mediante la activación mediante programación de diferentes combinaciones de válvulas en rutinas de fluidos automatizadas. Esto permite a los usuarios superar los diseños de fluidos rígidos tradicionalmente utilizados en la cultura continua, pero también para escalar las capacidades de fluidos a un alto rendimiento con un menor número de elementos de control costosos (por ejemplo, bombas peristálticas). Por último, esperamos incorporar una plataforma de automuestreo que utilizará estos milifluidics y componentes DIY, superando la limitación de la interacción manual durante los experimentos más largos y más grandes donde los cultivos de muestreo serían engorrosos.
Además de las modificaciones físicas de la plataforma, el software basado en la Web abre nuevos grados de libertad al permitir a los usuarios escribir, editar y compartir scripts eVOLVER personalizados, generando programas de cultura totalmente automatizados y habilitados para la retroalimentación (p. ej., turbidostat). Los usuarios pueden barrer mediante programación a través de rangos de parámetros en variaciones sutiles en el mismo esquema de selección o conectar algoritmos de control en combinaciones novedosas para especificar cualquier número de esquemas de selección sofisticados. Además, la capacidad de monitorear fácilmente las culturas en tiempo real transforma la forma en que se realizan los experimentos. Con la monitorización en tiempo real, los usuarios pueden 1) comprobar la coherencia entre las corridas, una característica crítica para las aplicaciones de bioproducción y los experimentos de alto rendimiento, y 2) intervenir durante los experimentos si es necesario, para solucionar problemas de cepas desafiantes que exhiben crecimiento deficiente o formación de biopelículas, o diagnosticar errores de usuario (por ejemplo, contaminación). Por último, con múltiples flujos de datos recopilados e interpretados en tiempo real para cada cultura individual, eVOLVER genera una alta densidad de datos, lo que puede facilitar enfoques de aprendizaje automático para un nuevo análisis descendente.
Más allá de los usos demostrados para la caracterización del acondicionamiento físico, la selección de bibliotecas y la evolución del laboratorio, vemos una serie de campos relacionados como maduros para su implementación en eVOLVER con fluidics integrados. los experimentos de Evolver con muestras de microbioma podrían analizar la estabilidad de la comunidad en ambientes controlados31,32, explorar la composición de la microbiota utilizando técnicas de culturomics33, o mezclar dinámicamente especies para interrogar la dinámica ecológica de la colonización o invasión34,35. Numerosos métodos para la evolución continua dirigida de biomoléculas podrían implementarse fácilmente en el dispositivo, así26,36,37, aumentando en gran medida la accesibilidad y el rendimiento de estos sistemas. La capacidad de optimizar las condiciones de crecimiento, como la composición de los medios, la temperatura y las cepas en una naturaleza dinámica y de alto rendimiento, puede ayudar en los esfuerzos de optimización para aplicaciones industriales de biofabricación9. Además, imaginamos la integración vertical de eVOLVER con otras técnicas de análisis como la microscopía y la citometría de flujo en forma de lazo cerrado, proporcionando un sistema totalmente automatizado para el crecimiento y el análisis de cultivos celulares tanto en célula única como en población Niveles. Además, con algunas modificaciones de hardware en el Smart Sleeve, como sellar el recipiente y controlar el contenido de gas, eVOLVER podría adaptarse potencialmente para apoyar el crecimiento de una gama más amplia de tipos de células, como las células de mamífero de suspensión. También es factible colocar todo el marco en una cámara anaeróbica para el cultivo celular anaeróbico. Mirando hacia el futuro, nuestro objetivo es construir nuestro marco de software en una infraestructura de nube centralizada y creemos que esto permitiría a los usuarios configurar, analizar y compartir fácilmente sus datos de forma remota sin necesidad de estar físicamente presentes en el laboratorio. Funcionando como conservador de datos, la infraestructura de la nube también se prestaría a grandes análisis de meta a través de experimentos. Anticipamos que eVOLVER y estos futuros avances ampliarán en gran medida el alcance de los posibles experimentos de selección de crecimiento facilitando la automatización y la innovación en la cultura continua.

Las técnicas continuas de cultivo celular, desarrolladas por primera vez hace casi 70 años1,2, están disfrutando de un reciente Revival3,4. Esto se debe a una confluencia de factores. En primer lugar, el desarrollo de técnicas de alto rendimiento-omics, que han hecho posible leer y generar un gran número de genotipos5,6, ha creado una demanda concomitante de técnicas experimentales que facilitan crecimiento celular bien controlado y fenotipado. Con este fin, la cultura continua representa un poderoso enfoque experimental para capitalizar los avances genómicos emergentes. Al facilitar las selecciones de crecimiento/experimentos sobre las poblaciones celulares en condiciones ambientales controladas con precisión (y dinámicas), la cultura continua proporciona un medio para mapear rigurosamente los genotipos a los fenotipos7,8, caracterizar cuantitativamente las cepas de ingeniería y los organismos9, y rastrear los cambios genéticos adaptativos en los estudios de evolución de laboratorio10,11,12.
En segundo lugar, la reciente aparición de técnicas de prototipado accesibles, como la fabricación aditiva y los elementos de hardware y software de código abierto, ha permitido a un conjunto más amplio de usuarios diseñar y construir sus propias formas rentables de sistemas de cultivo continuos directamente en el laboratorio. Todo esto ha conducido a una emocionante variedad de dispositivos hágalo usted mismo (DIY) que realizan funcionalidades de cultivo continuo, tales como el quimiostat13, turbidostat14, o morbidostat15. Desafortunadamente, aunque con éxito en abordar problemas específicos (nicho) para los que fueron diseñados, estas soluciones ad hoc generalmente carecen de la capacidad de escalar en el rendimiento y/o la complejidad del diseño experimental.
El sistema eVOLVER fue diseñado con el objetivo de crear una plataforma única que pueda acomodar las crecientes necesidades experimentales de la cultura continua y coincida con la velocidad y la escala de las técnicas genómicas emergentes16 (figura 1A). el diseño de eVOLVER implementa principios comunes que subyacen a tecnologías altamente escalables de otras disciplinas17, incluyendo huellas estandarizadas, componentes modulares y principio de diseño de código abierto. Por lo tanto, las soluciones para nuevas aplicaciones de nicho se pueden diseñar sin grandes modificaciones en el sistema. Compuesto por un software de código abierto, hardware, electrónica y Web de fuente abierta altamente modular, eVOLVER es el primer sistema automatizado de cultivo continuo que puede ser rentable y fácilmente reconfigurado para llevar a cabo prácticamente cualquier tipo de experimento de crecimiento de alto rendimiento. A través de mangas inteligentes modulares y programables que albergar todos los sensores y actuadores necesarios para controlar las culturas individuales, eVOLVER habilita de forma única el escalado tanto del rendimiento como del control individual de las condiciones de cultivo. Además, como plataforma basada en la web, eVOLVER intercambia datos e información con computadoras remotas en tiempo real, permitiendo el monitoreo simultáneo de cientos de culturas individuales y perturbaciones de la cultura automatizada a través del control arbitrariamente definido Algoritmos.
En el trabajo anterior16, el rendimiento robusto de Evolver se demostró en experimentos a largo plazo durante cientos de horas de funcionamiento, y su capacidad para cultivar diversos organismos, desde E. coli y s. cerevisiae hasta Microbios. Se realizaron una serie de experimentos de selección de crecimiento distintos, en los que se aplicaron gradientes multidimensionales de selección multidimensionales mediante programación A través de una serie de condiciones de cultivo individuales y los paisajes de aptitud celular resultantes fueron Cuantificado. Aquí, el objetivo es proporcionar a los usuarios de eVOLVER una descripción de cómo utilizar el sistema para diseñar y este tipo de experimentos. Como ejemplo ilustrativo, se presentan métodos que cuantifican el paisaje físico de los mutantes de S. cerevisiae a través de un gradiente medioambiental bidimensional compuesto por la temperatura y el estrés osmótico. El protocolo guía a los usuarios a través de la configuración del marco eVOLVER para este experimento mediante programación, en el uso del software para establecer rutinas personalizadas de turbidez y control de temperatura para cada una de las 16 culturas continuas paralelas, y físicamente, a través de la disposición de los fluidos para enrutar apropiadamente los medios de diferentes concentraciones de sal. Este protocolo debe servir como una rúbrica general para configurar eVOLVER para ejecutar una amplia variedad de experimentos de cultivo continuos automatizados para diversos estudios y disciplinas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Gallon Plastic Hedpack with cap</td>
			<td>Midwest Brewing and Winemaking Supplies</td>
			<td>45-56Y8-E2FR</td>
			<td>For waste collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-D(+)-Glucose</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>00805</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Autosampler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine population fractions via single cell fluoresence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118-07-0</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8&#34; Tube ID, 250&#176;F Maximum Temperature</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>5121K731</td>
			<td>For media input branching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50371500</td>
			<td>For Sterilization of fluidic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom eVOLVER vial lid</td>
			<td>FynchBio</td>
			<td></td>
			<td>Lid has ports for sampling and fluidic input/output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10018301</td>
			<td>For flow cytometry sampling plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For sterilization of fluidic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eVOLVER Unit</td>
			<td>FynchBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-420</td>
			<td>For vial sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-57</td>
			<td>Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB8002000</td>
			<td>Must be fitted with tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8&#34; ID, 1/4&#34; OD</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51135K73</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Mini</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>For running the experiment/collecting data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP243820</td>
			<td>For flow cytometry sampling plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K141</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K144</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K291</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K294</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-4910-04</td>
			<td>Culture vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fsher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring OD600 of overnight cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-4902-08</td>
			<td>Culture vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing automated, high-throughput, continuous cell growth experiments using evolver

Los métodos de cultivo continuos permiten que las células se cultiven bajo condiciones ambientales controladas cuantitativamente y, por lo tanto, son ampliamente útiles para medir los fenotipos de acondicionamiento físico y mejorar nuestra comprensión de cómo se forman los genotipos mediante la selección. Extensos esfuerzos recientes para desarrollar y aplicar dispositivos de cultivo continuo nicho han revelado los beneficios de la realización de nuevas formas de control de la cultura celular. Esto incluye definir presiones de selección personalizadas y aumentar el rendimiento para estudios que van desde la evolución experimental a largo plazo hasta selecciones de bibliotecas de todo el genoma y caracterización del circuito genético sintético. La plataforma eVOLVER se desarrolló recientemente para satisfacer esta creciente demanda: una plataforma de cultura continua con un alto grado de escalabilidad, flexibilidad y automatización. eVOLVER proporciona una única plataforma de normalización que se puede (re) configurar y escalar con un esfuerzo mínimo para realizar muchos tipos diferentes de experimentos de selección de crecimiento de alto rendimiento o multidimensionales. Aquí, se presenta un protocolo para proporcionar a los usuarios del marco de eVOLVER una descripción para configurar el sistema para llevar a cabo un experimento de crecimiento continuo a gran escala personalizado. Específicamente, el protocolo guía a los usuarios sobre cómo programar el sistema para multiplexar dos presiones de selección — temperatura y osmolaridad — a través de muchos viales de eVOLVER con el fin de cuantificar los paisajes de fitness de los mutantes Saccharomyces cerevisiae en finas solución. Mostramos cómo el dispositivo se puede configurar mediante programación, a través de su software basado en Web de código abierto, y físicamente, mediante la organización de diseños de fluidos y hardware. El proceso de configurar físicamente el dispositivo, programar la rutina de la cultura, monitorear e interactuar con el experimento en tiempo real a través de Internet, los viales de muestreo para el análisis offline posterior y el análisis de datos post experimento se detallan. Esto debería servir como punto de partida para que los investigadores de diversas disciplinas apliquen eVOLVER en el diseño de sus propios experimentos de crecimiento celular complejos y de alto rendimiento para estudiar y manipular sistemas biológicos.

El protocolo descrito aquí se usó para construir mapas de acondicionamiento físico para variantes genéticas de S. cerevisiae a través de un gradiente de tensión bidimensional de temperatura y salinidad. Específicamente, para cada cepa variante, usamos eVOLVER para llevar a cabo experimentos de competición en parejas contra una cepa de referencia con una etiqueta fluorescente (cepaS. cerevisiae BY4741 con un reportero constitutivo de mNeonGreen integrado) en 16 diferentes combinaciones de estas tensiones (figura 1). Para las variantes, se seleccionaron dos cepas Knockout cada una pronosticada para ser sensible a uno de los ejes de condición de tensión: Δprx1 que se ha reportado que tiene defectos de acondicionamiento físico en altas temperaturas20 y δpbs2 con defectos de acondicionamiento físico a altas concentraciones de sal21. Como variante de control, se utilizó una cepa BY4741 sin etiquetar de tipo salvaje, que se esperaba que se desempeñe de manera similar a la cepa de referencia. En total, estos experimentos de competición de 3 72 horas se realizaron simultáneamente en 48 viales a través de tres dispositivos eVOLVER (16 viales) que funcionan desde un solo ordenador.
El panel interactivo de eVOLVER se utiliza para navegar por la gran cantidad de datos generados durante cada experimento (figura 2A). Las trazas de OD representativas en los 16 viales de un solo dispositivo eVOLVER se muestran en la figura 2B. Cada rastro muestra un patrón de diente de sierra característico del algoritmo de control de turbidostat, que utiliza retroalimentación sobre OD para desencadenar diluciones y mantener cultivos en un rango de densidad estrecha (0.2-0.3 en este caso). Los datos de OD y de temperatura se miden continuamente, se transmiten a la base de datos habilitada para la nube y se actualizan en tiempo real en el panel interactivo de eVOLVER. A partir de datos continuamente en transmisión, las métricas de orden superior (por ejemplo, la tasa de crecimiento, las generaciones acumulativas) pueden calcularse y trazarse en el tablero (figura 2C) e incluso utilizarse como parámetros de retroalimentación en diferentes esquemas de selección (p. ej., morbidostat).
Para generar mapas de acondicionamiento físico, medimos la velocidad a la que la cepa de referencia supera a la cepa variante incorporando tanto mediciones de citometría de flujo como datos de crecimiento de eVOLVER. En concreto, las fracciones de población se calculan como la relación logaritmo de deformación de variante sobre deformación de referencia utilizando datos de citometría de flujo de cada muestra de punto de tiempo. Para cada referencia cultural y punto de tiempo, el número transcurrido de generaciones se interpolan a partir de los datos de la tasa de crecimiento de eVOLVER en cada período de dilución. Al trazar las relaciones de logaritmo con las generaciones, empiezan a surgir diferencias cualitativas entre las condiciones (figura 3a). Para calcular la aptitud, una pendiente se ajusta a través de la porción lineal de cada parcela18,19, produciendo un valor de aptitud cuantitativa (con signo y velocidad) que describe cómo la cepa variante compite contra la cepa de referencia ( Figura 3B). En este experimento, los valores negativos de la aptitud indican que la cepa de variante es supercompetido por la cepa de referencia. La construcción de mapas térmicos de todos los cálculos de aptitud permite la visualización del paisaje de fitness bidimensional, revelando sutiles diferencias cuantitativas en el rendimiento entre las cepas y las condiciones (Figura 3C).
De los Heatmaps de acondicionamiento físico, vemos que cada cepa variante exhibe defectos de aptitud que se manifiestan de diferentes maneras. Δprx1 es principalmente sensible a las altas temperaturas, pero el estrés de la sal parece tener un efecto aditivo, aumentando el defecto de acondicionamiento físico. Por el contrario, Δpbs2 muestra defectos de acondicionamiento físico principalmente en respuesta a altas concentraciones de sal, con mínimas diferencias a lo largo del eje de la temperatura. Estos resultados resaltan la utilidad de los experimentos de selección de alta resolución, especialmente para descifrar las interacciones de múltiples factores estresores ambientales, que podrían tener efectos aditivos, sinérgicos o epistáticos.
Por último, es importante tener en cuenta que en algunos casos, particularmente para las condiciones de estrés severo, los cálculos de aptitud pueden conducir a resultados exagerados o sesgados. Por ejemplo, Δpbs2 parece mostrar una pendiente positiva pronunciada en la condición nacl de 39 ° c/1 M en relación con la cepa de referencia (figura 3a). Esto se atribuye a un crecimiento deficiente de ambas cepas, que se refleja en los datos de tipo salvaje y limita la utilidad de esta métrica en particular en esta condición. Un número insuficiente de generaciones da como resultado 1) pobre separación de los puntos de tiempo que interfiere con el ajuste de la pendiente, y 2) la sensibilidad a los efectos estocásticos que provienen de la fase de retardo. Si bien no elegimos hacerlo en este estudio, los datos de crecimiento en tiempo real recopilados por eVOLVER durante el experimento podrían haberse utilizado para informar la decisión de extender el experimento y recopilar puntos de tiempo adicionales para esta condición con poco esfuerzo. En los experimentos de seguimiento, las proporciones iniciales también se podrían modular para extender la longitud de la región lineal antes de que se produzca la saturación.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3.jpg"> Figura 1: visión general del marco de eVOLVER y diseño experimental. (A) Evolver es una plataforma de cultivo automatizado y continuo que permite el control multiparaméit de las condiciones de cultivo. La plataforma se compone de mangas inteligentes, que se encuentran los sensores y actuadores para controlar las condiciones de cultivo, una matriz de bomba peristótica para los medios de flujo y residuos en y fuera de las culturas, una pantalla táctil para interactuar manualmente con el dispositivo, y un ordenador utiliza para interactuar con la infraestructura de nube donde se transmiten los datos de la plataforma. (B) Evolver se puede configurar de múltiples maneras: físicamente, a través de entradas de medios y celulares, y mediante programación ajustando los algoritmos que controlan los módulos de vial de cultivo de Smart sleeve. Esto se puede utilizar para programar la selección multidimensional/gradientes ambientales en alta resolución, con salidas compuestas de celdas físicamente recogidas en puntos de tiempo definidos y transmisión en tiempo real de datos de referencia cultural. (C) configurar Evolver para llevar a cabo un experimento de fitness de crecimiento a través de un gradiente de selección bidimensional, compuesto por la temperatura y el estrés osmótico. los viales de cultivo de eVOLVER fueron sembrados con proporciones iguales de una cepa de levadura de referencia y variante. Se programó una rutina de turbidostat para mantener todas las culturas en fase exponencial en una ventana de OD definida (OD 0.2-0.3). Las condiciones de temperatura y medios se variaron en la matriz de Smart sleeve para formar dos gradientes de tensión independientes. Los medios de base se componían de YPD (2% de glucosa) + 100 μg/mL de carbenicilina + 25 μg/mL de cloranfenicol como precaución contra la contaminación bacteriana. Las composiciones de los medios fueron variadas añadiendo NaCl suplementarios a 0 M, 0,6 M, 0,8 M, o 1,0 M. las temperaturas del vial se programaron a uno de cuatro valores: 30 ° c, 35 ° c, 37 ° c o 39 ° c. (D) ejemplos de producción cruda para la cultura OD y fracciones de población de tres condiciones probadas. El experimento de competición se mantuvo por 72 h, muestreo a las 24 h y posteriormente cada 12 h hasta la conclusión del experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig2.jpg"> Figura 2: panel de análisis de datos en tiempo real de eVOLVER. (A) los datos de Evolver se procesan y transmiten en tiempo real a través del software basado en la nube a un panel interactivo. A través del Dashboard, los usuarios pueden definir e iniciar sus propias rutinas de cultivo en un eVOLVER conectado, monitorear experimentos en ejecución en todas las unidades de eVOLVER y variar las condiciones experimentales manualmente en un vial individual o conjunto de viales si es necesario. (B) trazas de OD para cada vial a través de la matriz de condiciones probadas durante toda la duración del experimento. Las trazas se pueden ver en tiempo real para asegurar que el experimento se está ejecutando como se desea y se utiliza después del experimento para un análisis más detallado. (C) las tasas de crecimiento y las generaciones celulares se pueden calcular a partir de trazas de OD sobre la marcha para rastrear el progreso del experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig3.jpg"> Figura 3: Construcción de superficies de acondicionamiento físico. (A) fracción de población de células logaritmo natural (cepa variante/cepa de referencia) trazada contra generaciones celulares. El color indica la temperatura de selección mientras que los guiones distinguen las concentraciones de sal. (B) para cuantificar la adecuación relativa de la variante a la cepa de referencia, una métrica de aptitud se deriva de la tasa a la que la fracción de la población celular cambia a lo largo de las generaciones. Esta métrica se calcula a partir de la región lineal de los trazados de fracción celular utilizando un mínimo de tres puntos. (C) las métricas de acondicionamiento físico relativo se muestran en un mapa térmico para construir una superficie de acondicionamiento físico sobre los degradados de estrés ambiental. La condición de la esquina superior derecha (39 ° c/1,0 M NaCl) para el tipo silvestre y Δpbs2 no se incluyen en este análisis ya que las culturas pasaron por generaciones insuficientes (ver resultados representativos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

El marco eVOLVER permite un cultivo microbiano continuo de alto rendimiento con alta resolución y control dinámico sobre parámetros experimentales. Este protocolo demuestra cómo aplicar el sistema para llevar a cabo un experimento de fitness complejo, guiar a los usuarios en la programación de control automatizado sobre muchas culturas individuales, midiendo, recopilando e interactuando con datos experimentales en tiempo real.

Diseño automatizado, de alto rendimiento, experimentos de crecimiento de células continuas utilizando eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

eVOLVER ofrece a los investigadores libertad experimental, la capacidad de definir sus propios experimentos de crecimiento cultural con retroalimentación automatizada sobre múltiples parámetros y escalarla a cualquier tamaño que necesiten. eVOLVER es más flexible que otros dispositivos. Los usuarios pueden personalizar fácilmente el software en Python, así como el hardware, modificando las mangas inteligentes que contienen sensores para cada cultivo.El sistema puede parecer complicado a primera vista con múltiples componentes y conexiones. Una guía visual proporciona a los usuarios por primera vez más confianza en la ejecución de experimentos por su cuenta. La configuración adecuada es fundamental.Asegúrese de entender lo que hace cada componente. Así que puedes confirmar que están trabajando. Asegúrese de que todo esté enrutado correctamente y conectado firmemente.Mientras que diseñado para el cultivo aeróbico de bacterias y levaduras en diferentes condiciones, eVOLVER también podría ser modificado para la fermentación anaeróbica o para mantener las células de los mamíferos en suspensión. Este vídeo demostrará cómo configurar, inicializar y ejecutar un experimento de referencia cultural continua de alto rendimiento mediante la plataforma eVOLVER. El día antes del experimento, prepare medios, viales e inóculo según el manuscrito.En tres vasos grandes, prepara dos vasos de 10% de lejía y un vaso de 70% de etanol. Con los interruptores del dispositivo eVOLVER, encienda la fuente de alimentación de cinco voltios en el eVOLVER, espere cinco segundos y, a continuación, encienda la fuente de alimentación de 12 voltios. Si ejecuta varios viales desde la misma botella de medios, conecte varias líneas de entrada de medios con divisores de tubos.Los divisores de tubos personalizados se pueden construir con componentes inferiores. Sumerja las líneas de entrada de medios en el primer vaso de lejía y las líneas de eflux de medios en el segundo vaso de lejía. Conecte el extremo descendente de las líneas de entrada de medios al segundo vaso de precipitados con las líneas de eflux.Coloque las líneas de desecho en un carboy de desecho. Agregue de uno a dos litros de lejía al carboy de desechos para esterilizar los residuos generados durante el experimento. Usando la pantalla táctil en el eVOLVER, navegue a la sección de configuración y ejecute todas las bombas durante 20 segundos para llenar las líneas de fluido con 10% de lejía.Deje que la lejía se siente en las líneas durante al menos 30 minutos para esterilizar. Vuelva a ejecutar las bombas con la pantalla táctil hasta que las líneas ya no estén sumergidas, empujando el aire a través de las líneas para obtener la mayor cantidad posible de lejía. Coloque las líneas de entrada de medios en el vaso de etanol, llene las líneas con etanol, enjuácelas con aire.A continuación, conecte las líneas de entrada de medios a las botellas de medios con los conectores inferiores y ejecute las bombas hasta que el soporte corra completamente a través de las líneas eliminando cualquier etanol residual. Inserte parcialmente viales esterilizados en los manguitos inteligentes eVOLVER y conecte las líneas de entrada a la paja de entrada corta y las líneas de desecho al strawq de elux largo de acuerdo con la codificación de color. Ajuste la pantalla táctil eVOLVER para ejecutar todas las bombas en incrementos de 10 segundos para llenar los viales con medios.Asegúrese de que, mediante inspección visual, las bombas de eflux están eliminando eficientemente los medios a través de las pajitas de eflux para evitar desbordamientos. A continuación, empuje los viales hacia abajo hasta que estén completamente encerrados por la manga inteligente. En la página de configuración interactiva de la pantalla táctil eVOLVER, arrastre un dedo por la pantalla táctil o pulse el botón Seleccionar todo para seleccionar todos los viales y establecer las condiciones iniciales de temperatura a 30 grados centígrados y el revuelo en 10.En un equipo, especifique el dispositivo eVOLVER en el que se ejecutará el experimento. Asegúrese de que se han seleccionado los ajustes de calibración deseados. Abra el panel de eVOLVER y vaya a la página Administrador de experimentos.Seleccione el experimento Base en el panel Navegador de experimentos o en un experimento existente como punto de partida y haga clic en Clonar. Vaya a la página Editor de experimentos. Utilice los paneles Selector de viales y Definición de parámetros para ajustar la temperatura a 30 grados centígrados y establecer un umbral superior e inferior de OD para cada vial de acuerdo con el diseño experimental.Guarde el experimento haciendo clic en Guardar. A continuación, haga clic en la flecha para volver a la página Administrador de experimentos y haga clic en el botón Reproducir para ejecutar. Una vez que el experimento está en curso, vaya al panel Datos en tiempo real en el panel interactivo.Para cada vial, compruebe que los valores de OD se mantienen en cero. Navegue a través de los gráficos de temperatura para comprobar que las temperaturas están en o progresando hacia 30 grados Celsius. Para preparar el inóculo, primero mida el OD de los cultivos nocturnos y calcule la dilución completa deseada para cultivos nocturnos asumiendo un volumen de vial de 25 mililitros y un OD inicial deseado de aproximadamente 0,05.A través del puerto de muestreo, pipetear el volumen calculado de inóculo o mezcla de inóculas. Compruebe los gráficos en el panel para ver que el OD está aumentando a 0.05. El crecimiento celular y las condiciones del vial se pueden controlar en tiempo real a medida que el experimento está en curso, lo que permite al investigador intervenir si se produce algún problema.eVOLVER es una plataforma de cultivo continua automatizada que permite el control multiparámetro de las condiciones de cultivo. Se mostraron diferencias cualitativas entre los grupos de tipo silvestre, sensibles a la temperatura y sensibles a la sal cuando las relaciones de registro se trazaron con comparación con generaciones interpoladas a partir de datos de la tasa de crecimiento de eVOLVER. El color indica la temperatura de selección, mientras que los guiones distinguen las concentraciones de sal.Un ajuste de pendiente a través de la parte lineal de cada parcela utilizando un mínimo de tres puntos, produce un valor de aptitud cuantitativo que describe cómo la cepa variante compite contra la cepa de referencia. Los valores de aptitud negativos indican que la cepa variante está fuera de competencia por la tensión de referencia. Compruebe siempre que todas las bombas funcionen de manera eficiente y que las líneas de fluidos estén libres de obstrucciones.Un desbordamiento puede arruinar un experimento y potencialmente dañar las mangas inteligentes. Las muestras tomadas de eVOLVER se pueden secuenciar posteriormente para comprobar si hay alteraciones genómicas como resultado del experimento. Esta información se puede utilizar para diseñar nuevas cepas o sistemas.Para los investigadores que utilizan la evolución del laboratorio o la selección de bibliotecas, es fácil aplicar presiones de selección únicas en cada experimento de eVOLVER. El control de retroalimentación y los entornos dinámicos ahora también son muy accesibles. El carboy de desechos contendrá pequeñas cantidades de lejía y etanol después de un experimento.Consulte a su coordinador de seguridad de laboratorio para la eliminación adecuada de residuos.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Una plataforma robótica para de alto rendimiento de protoplastos aislamiento y Transformación

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Investigación

Genética

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Las perturbaciones de circulación miRNAs en el Síndrome del Intestino Irritable detectó utilizando una plataforma de expresión de genes de multiplexado de alto rendimiento

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

De alto rendimiento de aislamiento robótica asistida sensible a la temperatura del letal mutantes en<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando una técnica fluorescente PCR-capilar Electroforesis en gel con el genotipo CRISPR / Cas9 mediada Knockout mutantes en un formato de alto rendimiento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

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Alimentación dieta alta en grasas y alto rendimiento Triacylglyceride ensayo en Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

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We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

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Alto rendimiento identificación de combinaciones de fármacos sinérgicos por el método de superposición2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...