Name: designing automated, high-throughput, continuous cell growth experiments using evolver
Uploaded: 2019-05-19T14:30:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER at JoVE.com

Vi tackar B. Stafford för hans hjälp i utformningen av systemet, och H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. pipe, och A. Cavale för hjälp med byggandet av systemet. Vi erkänner Electronics design Facility (EDF), Engineering Product innovation Center (EPIC), och program varan & Application Innovation Lab (SAIL) vid Hariri Institute for Computing vid Boston University för deras tjänster. Detta arbete stöddes av en NSF karriär Award (MCB-1350949 till Ask), och DARPA beviljar HR0011-15-C-0091 och HR0011-18-2-0014 (till Ask). Ask också erkänner finansiering från NIH Director ' s nya innovatör Award (1DP2AI131083-01), DARPA Young fakulteten Award (D16AP00142), och NSF expeditioner i Computing (CCF-1522074).

1. beredning av media, injektions flaskor och Inoculum
Anmärkning: Detta protokoll förutsätter att användarna redan har kalibrerat eVOLVER-systemet och använder Smart Sleeve-konfigurationen som beskrivs i tidigare arbete16. Smarta ärmar är enkelt omdesignade eller modifierade, men inställnings Detaljer för volym och kontroll parametrar kan skilja sig för alternativa konfigurationer.
<ol><li>Dagen före försöket, förbereda 2 mL över natten flytande kulturer av S. cerevisiae BY4741 referens stam och variant stammar i YPD media (jäst Peptone Dextrose) vid 30 ° c i en skakinkubator inställd på minst 300 rpm</li>
	<li>Överför sterila YPD-medier till rena, autoklaverade flaskor försedda med slangar. Alternativt kan mediet vara autoklaverad direkt i flaskor förmonterade med slang. Anmärkning: Flaskorna är lämpliga med slang genom att borra ett hål i locket och rinnande slangar genom den med kontakter för att säkra den på plats. Se material tabell.</li>
	<li>Tillsätt rör stång till varje injektions flaska och skruva på ett Flask lock utrustat med inflöde och efflux sugrör. Se till att alla komponenter är rena genom okulärbesiktning.</li>
	<li>Placera injektions flaskor i ett autoklaverbart rack, täck med folie, och autoklavera på en gravitation eller vakuum cykel med en 20-min sterilisering steg.</li>
</ol>2. skapa ett experiment
<ol><li>I tre stora bägare, Förbered 500 mL 10% blek medel, 200 mL 10% blek medel, och 300 mL 70% etanol.</li>
	<li>Med hjälp av växlarna på eVOLVER enheten, slå på 5 V strömförsörjning på eVOLVER, vänta 5 s, sedan slå på 12 V strömförsörjning.</li>
	<li>Om du kör flera flaskor från samma media flaska, Anslut flera Media inmatnings ledningar med slang splitters. Anpassade slang splittrar kan konstrueras med Luer komponenter.</li>
	<li>Sänk medie inmatnings linjerna i den första blek medels bägaren och mediernas effluxlinjer i den andra blek medels bägaren. Placera den efterföljande änden av medie inmatnings ledningarna i den andra bägaren med effluxlinjerna. Placera avfalls ledningar i avfall Carboy.</li>
	<li>Tillsätt 1-2 L av blek medel i stora tomma avfall Carboy, som kommer att sterilisera avfall som genereras under experimentet. Rådgör med en säkerhets samordnare för att säkerställa korrekt kasse ring av avfall.</li>
	<li>Använda pekskärmen på eVOLVER, navigera till inställnings sektionen, och kör alla pumpar för 20 s för att fylla vätske linjer med 10% blek medel. När du kör, kontrol lera genom visuell inspektion att alla linjer har fyllts och att pumparna fungerar normalt. Låt blek medel sitta i linjerna i minst 30 min för att sterilisera.</li>
	<li>Kör pumpar igen med hjälp av pekskärmen app tills linjerna inte längre nedsänkt, trycka luft genom linjerna för att få så mycket av blek medel som möjligt.</li>
	<li>Placera Media inmatnings ledningar i etanol bägaren och upprepa som i ovan, fylla linjer med etanol och spola med luft. Anmärkning: Som etanol dödar snabbt, finns det ingen anledning att vänta 30 min för sterilisering.</li>
	<li>Anslut Media inmatnings ledningar till media flaskorna med Luer kontakterna och kör pumparna tills medierna helt går igenom linjerna, spola ut eventuell kvarvarande etanol.</li>
	<li>Delvis in steriliserade flaskor i eVOLVER smart ärmar och krok upp linjerna till rätt positioner, enligt färg kodning på linjerna. Börja med att fästa inmatnings ledningar till den korta inflödet halm, och sedan avfall linjer till långa effluxhalm. Var försiktig: Det är viktigt att kontrol lera om det finns lösa anslutningar eller felaktigt dragna linjer. Underlåtenhet att göra detta kommer att orsaka överflöden och potentiellt skada smart Sleeve.</li>
	<li>Kör alla pumpar i steg om 10 s för att fylla injektions flaskorna med media. Kontrol lera genom visuell inspektion effluxpumpar effektivt ta bort Media genom effluxstrån, för att förhindra överflöden. Om effluxstrån inte verkar fungera effektivt, inspektera de fluidiska linje anslutningarna och den peristaltiska pumpen. Korrigera eller byt ut delar efter behov.</li>
	<li>Skjut injektions flaskorna ner tills de är helt inneslutna av Smart Sleeve.</li>
	<li>Ange de ursprungliga villkoren för experimentella parametrar med eVOLVER-pekskärmen på den interaktiva installations sidan. För alla injektions flaskor, Ställ in temperaturen till 30 ° c och rör om till 10. Detta kan göras för alla flaskor på en gång genom att dra ett finger över pekskärmen för att välja alla injektions flaskor.</li>
</ol>3. Konfigurera eVOLVER program vara och programmering Algorithmic kultur rutiner
<ol><li>I den eVOLVER instrument panelen på en dator, navigerar du till den experiment Manager sidan. Välj bas experimentet i panelen experiment Navigator eller ett befintligt experiment som en start punkt och klicka på klona nya. Anmärkning: Det är möjligt att använda experiment från andra grupper genom att klistra in GitHub-länken till lagrings platsen där experimentell definition sparas i experiment hanteraren.</li>
	<li>Ange experiment namnet och den eVOLVER-enhet som experimentet ska köras på. Kontrol lera att önskade kalibrerings inställningar har valts genom att ändra dessa fält på sidan.</li>
	<li>Använd injektions flaskans väljare och parameter definitions rutorna för att ange experimentella förhållanden. Till exempel, för att ställa in temperaturen för injektions flaskorna 0-4 till 30 ° c, Välj injektions flaskorna i injektions flaskans väljare, Ställ in parameter definitionen till 30, och klicka på Ange. Upprepa detta för OD för att ställa in en övre och undre tröskel för varje injektions flaska.</li>
	<li>När experiment parameter definitionerna har slutförts sparar du experimentet genom att klicka på Spara och klicka på starta för att köra.</li>
</ol>4. initiera experiment och övervakning i real tid
<ol><li>När experimentet har påbörjats navigerar du till data panelen i real tid i den interaktiva instrument panelen. För varje injektions flaska, kontrol lera att OD-värdena håller vid noll, och att temperaturerna är på eller fortskrider mot programmerade nivåer genom att bläddra igenom diagrammen.</li>
	<li>För att bereda inokulatet, Mät OD över nattliga kulturer, beräkna den önskade gånger utspädningen med antagande av en injektions flaska volym på 25 ml, och Pipettera beräknad volym inokulatet i injektions flaskor genom provtagnings porten. Till exempel, för att nå en önskad start OD på cirka 0,05 i kultur flaskan från över natten kulturer som är vid OD 2,0, 625 μL av celler bör tillsättas till varje injektions flaska.</li>
	<li>Kontrol lera diagrammen på instrument brädan för att se att OD-diagrammen har uppdaterats i enlighet med detta. En ökning till nära önskad start OD bör ses i diagrammen.</li>
	<li>Spåra olika data typer (t. ex. OD, temperatur, tillväxt takt, generationer och medie konsumtion) genom hela experimentet genom att bläddra igenom motsvarande diagram i instrument panelen. Dessa värden kan informera användaren om experimentella beslut (t. ex. tidsplaner för tidpunkter) eller till och med användas i funktioner för att utföra automatiserad återkoppling.</li>
	<li>Om du vill ersätta Media flaskor mitten experiment, pausa experimentet i experiment hanteraren panelen för att förhindra att pumpen händelser inträffar. Skruva snabbt loss medie linjen från den tomma flaskan och Anslut den till den nya flaskan. Undvik att vidröra ändarna på slangen för att förhindra kontaminering. Återuppta experimentet i experiment hanteraren.</li>
</ol>5. provtagning av jästceller från eVOLVER injektions flaskor
<ol><li>Förbered en cykloheximide lösning för att hämma protein syntesen och Fix jästceller för flödescytometri analys. I ett 15 mL koniskt rör, tillsätt 12 mL PBS och 12 μL 20 mg/mL cykloheximid och Vortex i 5 s.</li>
	<li>Med hjälp av en flerkanalspipett, alikvot 100 μL i varje brunn av en 96-väl rund botten platta.</li>
	<li>Linda plattan i aluminiumfolie för att blockera ut ljus och hålla vid 4 ° c tills det behövs.</li>
	<li>Pipettera genom provtagnings porten på flaskans lock med förlängd längd 200 μL-spetsar.</li>
	<li>Pipettera 100 μL från en injektions flaska till en brunn i fixeringsplattan, blanda 2-3x genom pipettering upp och ner, sedan återhämta sig i folie och tillbaka plattan till 4 ° c.</li>
</ol>6. experiment bryta ner och städa upp
<ol><li>Förbered 1 L av 10% blek medel och 2 500 mL DI vatten lösningar i stora bägare.</li>
	<li>Stoppa experimentet genom att skicka kommandot stop i panelen experiment hanteraren. Data lagras fortfarande i den molnbaserade databasen och kan fortfarande visas senare i data panelen i real tid på instrument panelen, eller hämtas för offlineanalys.</li>
	<li>Ta bort flaskor från smart ärm och placera dem i ett autoklav rack för att undvika överflöden i efterföljande steg.</li>
	<li>Skruva loss Media inmatnings ledningarna från media flaskorna och placera dem i bägaren på 10% blek medel. Kör pumpar från eVOLVER användar gränssnittet som i setup för att sterilisera linjer och flaskor.</li>
	<li>Koppla från ledningar från flaskor och nedkopplingslinjer i DI-vatten. Kör pumpar för att spola alla blek medel ur systemet först med DI vatten, sedan med luft.</li>
	<li>Stäng av eVOLVER genom att först stänga av 12 V strömförsörjning, väntar 5 s, och sedan stänga av 5 V strömförsörjning.</li>
	<li>Blötlägg rör stänger och lock i 10% blek medel, skölj sedan med DI vatten. Var noga med att skölja tillströmningen och efflux halmstrån av varje mössa genom att köra DI vatten genom dem. Skrubba injektions flaskor med test rörs borste om filmen har bildats på väggarna.</li>
	<li>Kassera avfallet på lämpligt sätt och skölj avfalls behållarna noggrant. Var försiktig: Avfalls behållare kommer att innehålla en blandning av 10% blek medel, steriliserat cell odlings avfall, och spår mängder av etanol. Konsultera en säkerhets samordnare för korrekt hantering och kasse ring.</li>
</ol>7. kvantifiera Fitness använda Flow Cytometri analys av fraktionerad populationer
<ol><li>Analysera insamlade prover från avsnitt 5 med hjälp av en flödescytometer utrustad med lämplig fluorescenskanal och detektorer16.</li>
	<li>Förvärva minst 10 000 händelser per prov och grind för intakt celler med hjälp av framåt-och sido spridnings data.</li>
	<li>Grind baserad på lämplig fluorescenskanal (t. ex. GFP) för att bestämma fraktionerad fördelning av varje population.</li>
	<li>Spara data på en dator till önskad plats från sidan experiment hanterare genom att klicka på knappen "Exportera".</li>
	<li>Från eVOLVER datafiler, bestämma antalet generationer som avslut ATS av varje tidpunkt för varje injektions flaska. I eVOLVER-koden beräknas generationer genom att först segmentera OD-data mellan varje utspädnings händelse, då varje segment passar med en grundläggande exponentiell av formuläret <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq1.jpg"> till varje segment, vilket ger r, tillväxt takten16. Antalet generationer under en tids period beräknas sedan med hjälp av följande formel: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq2v2.jpg">
</li>
	<li>Plotta logg-förhållandet för de märkta och omärkta populationerna från flödescytometri data vs generation nummer från ovanstående beräkningar vid tidpunkten proverna togs. Identifiera den linjära regionen och montera lutningen enligt följande ekvation. Denna lutning definieras vanligen som konkurrens kraftiga Fitness18,19. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq3v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+Bacterial+Cultures.">The Growth of Bacterial Cultures.</a> Annual Review of Microbiology. , (1949).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria.">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 36 (12), 708-719 (1950).</li><li>Bull, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renaissance+of+continuous+culture+in+the+post-genomics+age.">The renaissance of continuous culture in the post-genomics age.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 37 (10), 993-1021 (2010).</li><li>Gresham, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enduring+utility+of+continuous+culturing+in+experimental+evolution.">The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution.</a> Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).</li><li>Lang, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+genetic+hitchhiking+and+clonal+interference+in+forty+evolving+yeast+populations.">Pervasive genetic hitchhiking and clonal interference in forty evolving yeast populations.</a> Nature. 500 (7464), 571-574 (2013).</li><li>Maddamsetti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation,+Clonal+Interference,+and+Frequency-Dependent+Interactions+in+a+Long-Term+Evolution+Experiment+with+Escherichia+coli.">Adaptation, Clonal Interference, and Frequency-Dependent Interactions in a Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli.</a> Genetics. 200 (2), 619-631 (2015).</li><li>Ishii, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+High-Throughput+Analyses+Monitor+the+Response+of+E.+coli+to+Perturbations.">Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations.</a> Science. 316 (5824), 593-597 (2007).</li><li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+Growth+Rate,+Cell+Cycle,+Stress+Response,+and+Metabolic+Activity+in+Yeast.">Coordination of Growth Rate, Cell Cycle, Stress Response, and Metabolic Activity in Yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li><li>Moser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+performance+under+conditions+relevant+for+industrial+bioreactors.">Genetic circuit performance under conditions relevant for industrial bioreactors.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (11), 555-564 (2012).</li><li>Kao, K. C., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+clonal+interference+during+adaptive+evolution+in+asexual+populations+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1499-1504 (2008).</li><li>Toprak, E., Veres, A., Michel, J. -. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+paths+to+antibiotic+resistance+under+dynamically+sustained+drug+selection.">Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection.</a> Nature Genetics. 44 (1), 101-105 (2011).</li><li>Hope, E. A., Amorosi, C. J., Miller, A. W., Dang, K., Heil, C. S., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Evolution+Reveals+Favored+Adaptive+Routes+to+Cell+Aggregation+in+Yeast.">Experimental Evolution Reveals Favored Adaptive Routes to Cell Aggregation in Yeast.</a> Genetics. 206 (2), 1153-1167 (2017).</li><li>Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Use+of+Multiplexed+Chemostat+Arrays.">Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), 2-7 (2013).</li><li>Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost,+customizable+turbidostat+for+use+in+synthetic+circuit+characterization.">A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (1), 32-38 (2015).</li><li>Toprak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+morbidostat:+an+automated+continuous-culture+device+for+studying+bacterial+drug+resistance+under+dynamically+sustained+drug+inhibition.">Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition.</a> Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).</li><li>Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise,+automated+control+of+conditions+for+high-throughput+growth+of+yeast+and+bacteria+with+eVOLVER.">Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).</li><li>Bondi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+scalability+and+their+impact+on+performance.">Characteristics of scalability and their impact on performance.</a> Proceedings of the Second International Workshop on Software and Performance - WOSP &#8217;00. , 195-203 (2000).</li><li>Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Chemostats+in+Microbial+Systems+Biology.">The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50168 (2013).</li><li>Sanchez, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+paralog+divergence+modulates+genome+evolution+across+yeast+species.">Differential paralog divergence modulates genome evolution across yeast species.</a> PLOS Genetics. 13 (2), e1006585 (2017).</li><li>Gibney, P. A., Lu, C., Caudy, A. A., Hess, D. C., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+metabolic+and+signaling+genes+are+required+for+heat-shock+survival+and+have+little+overlap+with+the+heat-induced+genes.">Yeast metabolic and signaling genes are required for heat-shock survival and have little overlap with the heat-induced genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), E4393-E4402 (2013).</li><li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418 (6896), 387-391 (2002).</li><li>Piper, M. D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+oligonucleotide+microarray+transcriptome+analyses.+An+interlaboratory+comparison+using+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Reproducibility of oligonucleotide microarray transcriptome analyses. An interlaboratory comparison using chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (40), 37001-37008 (2002).</li><li>Badarinarayana, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays.">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature Biotechnology. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li><li>Dai, J., Hyland, E. M., Yuan, D. S., Huang, H., Bader, J. S., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Nucleosome+Function:+A+Highly+Versatile.">Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile.</a> Library of Synthetic Histone H3 and H4. 134 (6), 1066-1078 (2008).</li><li>McGeachy, A. M., Meacham, Z. A., Ingolia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Accessible+Continuous-Culture+Turbidostat+for+Pooled+Analysis+of+Complex+Libraries.">An Accessible Continuous-Culture Turbidostat for Pooled Analysis of Complex Libraries.</a> bioRxiv. , 450536 (2018).</li><li>Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+the+continuous+directed+evolution+of+biomolecules.">A system for the continuous directed evolution of biomolecules.</a> Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).</li><li>Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+and+stringency+modulation+in+phage-assisted+continuous+evolution.">Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 216-222 (2014).</li><li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth.">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7 (May), 12546 (2016).</li><li>Wenger, J. W., Piotrowski, J., Nagarajan, S., Chiotti, K., Sherlock, G., Rosenzweig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hunger+Artists:+Yeast+Adapted+to+Carbon+Limitation+Show+Trade-Offs+under+Carbon+Sufficiency.">Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency.</a> PLoS Genetics. 7 (8), e1002202 (2011).</li><li>Yona, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+duplication+is+a+transient+evolutionary+solution+to+stress.">Chromosomal duplication is a transient evolutionary solution to stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 21010-21015 (2012).</li><li>Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+stable,+reproducible+microbial+communities+from+different+fecal+donors+using+minibioreactor+arrays+(MBRAs).">Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs).</a> Microbiome. 3, 42 (2015).</li><li>Goldford, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+simplicity+in+microbial+community+assembly.">Emergent simplicity in microbial community assembly.</a> Science. 361 (6401), 469-474 (2018).</li><li>Lagier, J. -. C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+the+human+microbiota+and+culturomics.">Culturing the human microbiota and culturomics.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).</li><li>Fukami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+Contingency+in+Community+Assembly:+Integrating+Niches,+Species+Pools,+and+Priority+Effects.">Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).</li><li>Friedman, J., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+systems+biology:+The+dynamics+of+interacting+populations.">Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations.</a> Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).</li><li>Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. M., Schmitz, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+continuous+evolution+of+genes+and+pathways+in+yeast.">In vivo continuous evolution of genes and pathways in yeast.</a> Nature Communications. 7, 13051 (2016).</li><li>Ravikumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+Continuous+Evolution+of+Genes+at+Mutation+Rates+above+Genomic+Error+Thresholds.">Scalable, Continuous Evolution of Genes at Mutation Rates above Genomic Error Thresholds.</a> Cell. 175, (2018).</li></ol>

Författarna, Brandon G. Wong och Ahmad S. Khalil, är grundare av Fynch Bioscience Inc., som utvecklar eVOLVER plattform som används i denna artikel.

Tillväxt val är ett oumbärligt verktyg i biologi, används i stor utsträckning för att generera och karakterisera fenotypisk skillnader mellan cellulära populationer. Medan parti kulturer tillåter tillväxt urval på ett begränsat sätt, kontinuerlig kultur tekniker dramatiskt utöka graden av kontroll och förutsägbarhet av dessa experiment, genom att utöva exakt reglering över formen och dynamiken i urvalet för att generera repeterbara, kvantitativa resultat22. Kontinuerlig kultur har använts för att rigoröst kontrol lera urvalet för bibliotek med hög mångfald20,23,24,25och för att implementera sofistikerade adaptiva regimer i experimentella och riktad evolution11,12,26,27. Kontinuerlig kultur möjliggör också exakt karakterisering av celler över en mängd kvantifierbara kontrollerade betingelser för att bättre förstå komplexa genetiska system och optimera konstruerade bio produktions stammar9,14 , och 28.
Det finns dock inget universellt protokoll för kontinuerlig kultur, eftersom subtila förändringar av de selektiva förhållandena kan leda till dramatiska förändringar i biologiska utfall4,29,30. Experimenterarna måste kunna välja mellan urvals system och anpassa experimentella protokoll och utrustning därefter. Förutom att erbjuda ett val mellan kontroll parametrar, skulle sådana system helst vara sofistikerade nog att självständigt hantera flera parametrar samtidigt i mycket parallella experiment som behövs för att tolka interagerande indata i komplexa biologiska system (t. ex. epistas). eVOLVER löser denna utmaning genom att möjliggöra för användare att godtyckligt program mera återkoppling mellan odlings förhållanden och fluidiska funktioner för att specificera högt specialiserade miljö nischer.
För att övervinna begränsningarna i den aktuella installationen och för att expandera eller ändra styr parametrarna kan smart Sleeve enkelt omformas för att lägga till nya sensorer eller ställdon. Dessutom skulle minska Flask volymen minska Media utgifter, vilket kan vara betydande i kontinuerlig kultur. Medan den nuvarande konstruktionen tillåter mätning och kontroll av temperatur, kultur agitation, ljus induktion, grumlighet och fluidik, måste andra parametrar mätas externt genom provtagning från injektions flaskorna. Nuvarande arbete innefattar att införliva förmågan att övervaka enzymatisk aktivitet via luciferas och reglera upplöst syre och pH direkt i evolver kulturer. Dessutom, även om det inte visas i detta arbete, eVOLVER kan samverka med nya millifluidic multiplexing enheter16 som drar på principerna om storskalig integration (som härrör från elektronik och antas av mikrofluidik) för att Billigt att möjliggöra mer komplex fluidic hantering (t. ex. Multiplexed fluidic ingångar, injektions flaska-till-flaska överföringar). Dessa wetware moduler kan utformas och tillverkas helt i labbet, så att användarna kan dirigera vätskor genom att program mässigt aktivera olika kombinationer av ventiler i automatiserade fluidic rutiner. Detta gör det möjligt för användare att övervinna de stela fluidic mönster traditionellt används i kontinuerlig kultur, men också att skala fluidic kapacitet till hög genom strömning med ett mindre antal kostsamma kontroll element (t. ex. Peristaltiska pumpar). Slutligen, vi hoppas att införliva en autosampling plattform som kommer att använda dessa millifluidik och DIY komponenter, övervinna begränsningen av manuell interaktion under längre och större experiment där provtagning kulturer skulle vara besvärligt.
Förutom fysiska modifieringar av plattformen öppnar den webbaserade program varan nya frihets grader genom att tillåta användare att skriva, redigera och dela anpassade eVOLVER-skript, generera helt automatiserade, feedbackaktiverade kultur program (t. ex. turbidostat). Användare kan program mässigt svepa över parameter intervall i subtila variationer på samma urvals schema eller ansluta kontrollalgoritmer i nya kombinationer för att ange valfritt antal sofistikerade urvals scheman. Dessutom förändrar förmågan att enkelt övervaka kulturer i real tid det sätt på vilket experiment utförs. Med övervakning i real tid kan användare 1) kontrol lera konsekvens mellan körningar, en kritisk funktion för bioproduktionsprogram och experiment med hög genom strömning och 2) ingripa vid behov vid experiment för att felsöka utmanande stammar som uppvisar eller Biofilm bildning, eller diagnostisera användar fel (t. ex. kontaminering). Slutligen, med flera data strömmar som samlas in och tolkas i real tid för varje enskild kultur, genererar eVOLVER en hög täthet av data, vilket kan under lätta maskin inlärning metoder för nya nedströms analys.
Bortom visat användnings områden för fitness karakterisering, bibliotek urval, och laboratorie utveckling, vi ser ett antal relaterade områden som mogna för genomförande i eVOLVER med integrerade fluidik. evolver experiment med mikrobiome prover kan assay gemenskap stabilitet i kontrollerade miljöer31,32, utforska bakterieflora sammansättning med hjälp av culturomics tekniker33, eller dynamiskt blanda arter till förhöra ekologisk dynamik av kolonisering eller invasion34,35. Många metoder för kontinuerlig riktad utveckling av bio molekyler kan enkelt implementeras på enheten samt26,36,37, kraftigt öka tillgängligheten och genom strömningen av dessa system. Förmågan att optimera odlings förhållanden såsom Media sammansättning, temperatur och stammar i en dynamisk, hög genom strömning natur kan hjälpa i optimering ansträngningar för industriella biomanufacturing applikationer9. Vi ytterligare föreställa vertikalt integrera eVOLVER med andra analys tekniker såsom Mikroskopi och flödescytometri i en sluten slinga mode, vilket ger ett helt automatiserat system för tillväxt och analys av cellulära kulturer på både enstaka cell och population Nivåer. Dessutom, med vissa hård vara modifieringar till smart Sleeve såsom tätning av fartyget och kontrol lera gas innehåll, eVOLVER skulle kunna anpassas för att stödja tillväxten av ett bredare spektrum av cell typer, såsom SUS pension däggdjurs celler. Det är också möjligt att placera hela ramen i en anaerob kammare för anaerob cell kultur. Ser fram emot, strävar vi efter att bygga vår program vara ram till en centraliserad moln infrastruktur och tror att detta skulle tillåta användare att enkelt konfigurera, analysera och dela sina data på distans utan att behöva fysiskt vara närvarande i labbet. Moln infrastrukturen fungerar som datainkurator och lämpar sig också för storskaliga metaanalyser i experiment. Vi räknar med att eVOLVER och dessa framtida framsteg kommer att kraftigt utvidga räckvidden för möjliga tillväxt urvals experiment genom att under lätta automatisering och innovation i kontinuerlig kultur.

Kontinuerlig cell odlings teknik, utvecklades först nästan 70 år sedan1,2, njuter av en nyligen väckelse3,4. Detta beror på en sammanflödet av faktorer. För det första har utvecklingen av teknik med hög genom strömning-omik, som har gjort det möjligt att läsa upp och generera ett stort antal genotyper5,6, skapat en samtidig efter frågan på experimentella tekniker som underlättar välkontrollerad cell tillväxt och fenotypning. För detta ändamål är kontinuerlig kultur en kraftfull experimentell metod för att kapitalisera på framväxande genomiska framsteg. Genom att under lätta tillväxt val/experiment på cell populationer i noggrant kontrollerade (och dynamiska) miljö förhållanden, ger kontinuerlig kultur ett sätt att rigoröst kartlägga genotyper till fenotyper7,8, kvantitativt karakterisera konstruerade stammar och organismer9, och spåra adaptiva genetiska förändringar i laboratoriet evolution studier10,11,12.
För det andra, den senaste tidens framväxten av tillgängliga prototyper tekniker, såsom additiv tillverkning och öppen källkod hård vara och program vara element, har möjliggjort en bredare uppsättning användare att utforma och bygga sina egna kostnads effektiva former av kontinuerliga kultur system direkt i laboratoriet. Allt detta har lett till ett spännande utbud av gör-det-själv (DIY) enheter som utför kontinuerlig kultur funktioner, såsom chemostat13, turbidostat14, eller morbidostat15. Tyvärr, men framgångs rika i att ta itu med specifika (nisch) problem som de utformades, dessa ad hoc-lösningar saknar i allmänhet förmågan att skala i genomflöde och/eller experimentell design komplexitet.
Den evolver systemet utformades med målet att skapa en enda plattform som kan tillgodose de växande experimentella behoven av kontinuerlig kultur och matcha hastigheten och skalan av framväxande genomisk tekniker16 (figur 1a). eVOLVER ' s design implementerar vanliga grundämnen som ligger bakom mycket skalbara teknologier från andra discipliner17, inklusive standardiserade fot avtryck, modulära komponenter och design principer med öppen källkod. Således kan lösningar för nya nisch applikationer utformas utan större modifieringar av systemet. Består av mycket modulära och öppen källkod wetware, hård vara, elektronik och webbaserad program vara, eVOLVER är den första automatiserade kontinuerliga kultur system som kan vara kostnads effektivt och lätt omkonfigurerad för att utföra praktiskt taget alla typer av tillväxt experiment med hög genom strömning. Genom modulära och programmerbara smart ärm som hus alla sensorer och ställdon som behövs för att styra enskilda kulturer, eVOLVER unikt möjliggör skalning av både genom strömning och individuell kontroll av kultur förhållanden. Dessutom, som en webbaserad plattform, utbyter eVOLVER data och information med fjärrdatorer i real tid, vilket tillåter samtidig övervakning av hundratals enskilda kulturer och automatiserade kultur störningar genom godtyckligt definierad kontroll Algoritmer.
I tidigare arbete16, evolver robusta prestanda visades i långsiktiga experiment under hundratals timmars drift, och dess förmåga att odla olika organismer, från E. coli och s. cerevisiae till odomesticerade Mikrober. En rad olika experiment för tillväxt urval utfördes, där program mässigt definierade flerdimensionella vals gradienter tillämpades på en rad olika kultur förhållanden och det resulterande cellulära Fitness landskap var Kvantifierade. Här, målet är att ge eVOLVER användare med en beskrivning av hur man använder systemet för att utforma och dessa typer av experiment. Som ett belysande exempel, metoder kvantifiera Fitness landskapet i S. cerevisiae mutanter över en tvådimensionell miljö gradient består av temperatur och osmotisk stress presenteras. Protokollet vägleder användare genom att konfigurera evolver ramverket för detta experiment både program mässigt, i att använda program varan för att ställa anpassade grumlighet och temperatur kontroll rutiner för var och en av 16 parallella kontinuerliga kulturer, och fysiskt, genom flödes teknik layout för att på lämpligt sätt dirigera medier med olika saltkoncentrationer. Detta protokoll bör fungera som ett allmänt kriterium för att konfigurera eVOLVER att utföra en mängd olika automatiserade kontinuerliga kultur experiment för olika studier och discipliner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Gallon Plastic Hedpack with cap</td>
			<td>Midwest Brewing and Winemaking Supplies</td>
			<td>45-56Y8-E2FR</td>
			<td>For waste collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-D(+)-Glucose</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>00805</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Autosampler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine population fractions via single cell fluoresence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118-07-0</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8&#34; Tube ID, 250&#176;F Maximum Temperature</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>5121K731</td>
			<td>For media input branching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50371500</td>
			<td>For Sterilization of fluidic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom eVOLVER vial lid</td>
			<td>FynchBio</td>
			<td></td>
			<td>Lid has ports for sampling and fluidic input/output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10018301</td>
			<td>For flow cytometry sampling plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For sterilization of fluidic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eVOLVER Unit</td>
			<td>FynchBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-420</td>
			<td>For vial sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-57</td>
			<td>Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB8002000</td>
			<td>Must be fitted with tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8&#34; ID, 1/4&#34; OD</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51135K73</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Mini</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>For running the experiment/collecting data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP243820</td>
			<td>For flow cytometry sampling plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K141</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K144</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K291</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K294</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-4910-04</td>
			<td>Culture vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fsher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring OD600 of overnight cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-4902-08</td>
			<td>Culture vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing automated, high-throughput, continuous cell growth experiments using evolver

Kontinuerliga odlings metoder gör det möjligt att odla celler under kvantitativt kontrollerade miljö förhållanden och är därför i stort sett användbara för att mäta konditionen fenotyper och förbättra förståelsen av hur genotyper formas genom urval. Omfattande senaste insatserna för att utveckla och tillämpa nisch kontinuerlig kultur enheter har avslöjat fördelarna med att genomföra nya former av cell kultur kontroll. Detta inkluderar att definiera anpassade urvals tryck och öka genom strömningen för studier som sträcker sig från långsiktig experimentell evolution till genomtäckande biblioteks val och syntetiska genkretsinkaraktärisering. EVOLVER-plattformen har nyligen utvecklats för att möta denna växande efter frågan: en kontinuerlig kultur plattform med en hög grad av skalbarhet, flexibilitet och automatisering. eVOLVER ger en enda standardisering plattform som kan (Re)-konfigurerad och skalas med minimal ansträngning för att utföra många olika typer av hög genom strömning eller flerdimensionella tillväxt urvals experiment. Här presenteras ett protokoll för att ge användare av eVOLVER ram en beskrivning för att konfigurera systemet att genomföra en anpassad, storskalig kontinuerlig tillväxt experiment. Specifikt, protokollet vägleder användare om hur man programmerar systemet till multiplex två val tryck-temperatur och osmolaritet-över många eVOLVER flaskor för att kvantifiera Fitness landskap av Saccharomyces cerevisiae mutanter på fina Upplösning. Vi visar hur enheten kan konfigureras både programmatiskt, genom sin öppen källkod webbaserade program vara, och fysiskt, genom att arrangera fluidic och hårdvarulayouter. Processen för att fysiskt ställa in enheten, programmering av kulturen rutin, övervakning och interagera med experimentet i real tid över Internet, provtagning flaskor för efterföljande offline analys, och efter experiment data analys är detaljerade. Detta bör fungera som en utgångs punkt för forskare inom olika discipliner att tillämpa eVOLVER i utformningen av sina egna komplexa och hög genom strömning cell tillväxt experiment för att studera och manipulera biologiska system.

Protokollet som beskrivs här användes för att konstruera Fitness kartor för genetiska varianter av S. cerevisiae över en tvådimensionell stress lutning av temperatur och salthalt. Specifikt för varje variant stam, vi använde eVOLVER att genomföra Pairwise konkurrens experiment mot en fluorescently-märkt referens stam (S. cerevisiae stam BY4741 med en integrerad konstitutiv mNeonGreen reporter) i 16 olika kombinationer av dessa spänningar (figur 1). För varianter valdes två knockoutstammar som var och en förutspådde vara känsliga för en av spännings villkors axlarna: Δprx1 som har rapporter ATS ha konditioneringsdefekter i höga temperaturer20 och δpbs2 med konditioneringsdefekter vid höga saltkoncentrationer21. Som kontrollvariant användes en omärkt Wild-Type BY4741-stam, som förväntades prestera på samma sätt som referens stammen. Sammanlagt genomfördes dessa 3 72-timmars konkurrens experiment samtidigt i 48 injektions flaskor över tre eVOLVER (16-vial) enheter alla körs från en enda dator.
Den interaktiva instrument panelen eVOLVER används för att navigera den stora mängden data som genereras under varje experiment (bild 2a). Representativa OD-spår över alla 16 injektions flaskor med en enda eVOLVER-enhet visas i figur 2b. Varje spår visar en karakteristisk sawtooth mönster från turbidostat kontrollalgoritm, som använder feedback på OD för att utlösa utspädningar och bibehålla kulturer i ett smalt densitet område (0,2-0,3 i detta fall). OD-och temperatur data mäts kontinuerligt, strömmas till den molnbaserade databasen och uppdateras i real tid i den interaktiva instrument panelen eVOLVER. Från kontinuerligt strömmande data, högre ordning mått (t. ex. tillväxt takt, kumulativa generationer) kan beräknas och ritas i instrument brädan (figur 2C) och även användas som feedback parametrar i olika urvals system (t. ex., morbidostat).
För att generera Fitness kartor, mäter vi den hastighet med vilken referens stammen överträffar variant stammen genom att införliva både flödescytometri mätningar och eVOLVER tillväxt data. Specifikt beräknas populations fraktioner som log-kvoten av variant stam över referens stam med hjälp av flödescytometri data från varje tidpunkten prov. För varje kultur-och tids punkt interpoleras det förflutna antalet generationer från data för eVOLVER-tillväxtens under varje utspädnings period. De kvalitativa skillnaderna mellan förhållandena börjar växa fram (figur 3a) för att plotta logg förhållandena mot generationerna. För att beräkna Konditionen är en lutning lämplig genom den linjära delen av varje tomt18,19, vilket ger ett kvantitativt tränings värde (med både tecken och hastighet) som beskriver hur variantstammen konkurrerar mot referens stammen ( Figur 3B). I detta experiment indikerar negativa konditions värden att variantstammen är utkonkurrerade av referens stammen. Konstruera heatmaps från alla Fitness beräkningar tillåter visualisering av den tvådimensionella Fitness landskap, avslöjar subtila kvantitativa skillnader i prestanda mellan stammar och förhållanden (figur 3c).
Från Fitness heatmaps, ser vi att varje variant stam uppvisar Fitness defekter som manifesteras på olika sätt. Δprx1 är främst känslig för höga temperaturer, men salt stress verkar ha en additiv effekt, vilket ökar konditiondefekten. Omvänt visar Δpbs2 konditiondefekter främst som svar på höga saltkoncentrationer, med minimala skillnader längs temperatur axeln. Dessa resultat belysa nyttan av hög upplöst urvals experiment särskilt för dechiffrera interaktioner av flera miljömässiga stressfaktorer, som kan ha additiva, synergistiska eller epistatiska effekter.
Slutligen, det är viktigt att notera att i vissa fall, särskilt för svåra stress förhållanden, kan Fitness beräkningar leda till överdrivna eller skeva resultat. Till exempel verkar Δpbs2 Visa en brant positiv lutning i förhållandet 39 ° c/1 M NaCl i förhållande till referens stammen (figur 3a). Detta tillskrivs dålig tillväxt av båda stammarna, vilket återspeglas i vilda typ data och begränsar nyttan av detta särskilda mått i detta tillstånd. Ett otillräckligt antal generationer resulterar i 1) dålig separation av tidpunkter som stör lutning montering, och 2) känslighet för stokastiska effekter som härrör från fördröjning fas. Även om vi inte valde att göra det i denna studie, real tid tillväxt data som samlats in av evolver under experimentet kunde ha använts för att informera beslutet att förlänga experimentet och samla in ytterligare tidpunkter för detta villkor med liten ansträngning. I uppföljnings experiment kan utgångs kvoterna också modulateras för att förlänga den linjära regionens längd innan mättnaden inträffar.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3.jpg"> Figur 1: översikt över eVOLVER-ramverket och experimentell design. (A) evolver är en automatiserad, kontinuerlig kultur plattform som möjliggör flerparameterkontroll av odlings förhållanden. Plattformen består av Smart ärm, som innehåller sensorer och manöver Don för att kontrol lera odlings förhållanden, en peristaltisk pump för strömmande media och avfall in och ut ur kulturerna, en pekskärm för interaktion manuellt med enheten och en dator används för att interagera med moln infrastrukturen där data från plattformen strömmas. (B) evolver kan konfigureras på flera sätt: fysiskt, genom cell-och media ingångar, och program mässigt genom att justera algoritmer som styr smart Sleeve kultur vial moduler. Detta kan användas för att program mera flerdimensionellt urval/miljö lutningar vid hög upplösning, med utgångar som består av fysiskt insamlade celler vid definierade tidpunkter och real tids streaming av kultur data. (C) Konfigurera evolver att genomföra en tillväxt Fitness experiment över en tvådimensionell urval gradient, bestående av temperatur och osmotisk stress. eVOLVER kultur flaskor seedade med lika proportioner av en referens och variant jäst stam. En turbidostat rutin var programmerad för att bibehålla alla kulturer i exponentiell fas i en definierad OD fönster (OD 0,2-0,3). Temperatur och media förhållanden varierade över smart Sleeve matris för att bilda två oberoende spänning gradienter. Basmedia bestod av YPD (2% glukos) + 100 μg/mL carbenicillin + 25 μg/mL kloramfenikol som en försiktighets åtgärd mot bakteriell kontaminering. Media kompositioner varierade genom att lägga till kompletterande NaCl till 0 M, 0,6 M, 0,8 M, eller 1,0 M. injektions flaskans temperatur programmerades till ett av fyra värden: 30 ° c, 35 ° c, 37 ° c eller 39 ° c. D) exempel på rå produktion för kultur OD och befolknings fraktioner från tre testade förhållanden. Tävlingen experiment upprätthölls för 72 h, provtagning vid 24 h och därefter var 12 h fram till slutförandet av experimentet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig2.jpg"> Figur 2: eVOLVER instrument panel för data analys i real tid. (A) evolver data bearbetas och strömmas i real tid via molnbaserad program vara till en interaktiv instrument panel. Genom instrument panelen, användare kan definiera och initiera sina egna kultur rutiner på en ansluten eVOLVER, övervaka närvarande kör experiment över alla eVOLVER enheter, och variera experimentella förhållanden manuellt på en enskild injektions flaska eller uppsättning av flaskor om det behövs. (B) od-spår för varje injektions flaska över matrisen med testade betingelser under hela försöks perioden. Spår kan ses i real tid för att säkerställa experimentet körs som önskas och används efter experiment för ytterligare analys. Ctillväxt takt och cell generationer kan beräknas från OD-spår i farten för att spåra experiment framsteg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig3.jpg"> Figur 3: Konstruktion av konditions ytor. (A) cell population fraktioner naturlig Stock (variant stam/referens stam) plottas mot cell generationer. Färg anger temperaturen på markeringen medan streck skiljer saltkoncentrationer. (B) för att kvantifiera den relativa konditionen för varianten till referens stammen härleds ett konditions mått från den hastighet med vilken den cellulära befolknings fraktionen förändras över generationer. Detta mått beräknas från det linjära området av de cellulära fraktions områdena med hjälp av minst tre punkter. (C) den relativa Fitness mät värden visas i en heatmap att konstruera en fitness yta över miljö belastningen gradienter. Det övre högra hörnet (39 ° c/1,0 M NaCl) för vild typ och Δpbs2 ingår inte i denna analys eftersom kulturerna gick igenom otillräckliga generationer (se representativa resultat). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER at JoVE.com

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Den eVOLVER ramverk möjliggör hög genom strömning kontinuerlig mikrobiell kultur med hög upplösning och dynamisk kontroll över experimentella parametrar. Detta protokoll visar hur man kan tillämpa systemet för att genomföra en komplicerad Fitness experiment, vägleda användare på programmering automatiserad kontroll över många enskilda kulturer, mäta, samla in och interagera med experimentella data i real tid.

Designa automatiserade, hög genom strömning, kontinuerlig cell tillväxt experiment med eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

eVOLVER ger forskare experimentell frihet, möjlighet att definiera sina egna odlingsexperiment med automatiserad feedback på flera parametrar och skala den till vilken storlek de än behöver. eVOLVER är mer flexibelt än andra enheter. Användare kan enkelt anpassa programvara i Python samt hårdvaran, genom att modifiera de smarta ärmarna som håller sensorer för varje kultur.Systemet kan visas komplicerat vid första anblicken med flera komponenter och anslutningar. En visuell guide ger första gången användare mer förtroende för att köra experiment på egen hand. Korrekt setup är kritisk.Var noga med att förstå vad varje komponent gör. Så du kan bekräfta att de fungerar. Se till att allt dras korrekt och är tätt anslutet.EVOLVER är utformat för aerob odling av bakterier och jäst under varierande förhållanden, men kan också modifieras för anaerob jäsning eller för att bibehålla däggdjursceller i suspension. Den här videon kommer att visa hur du Ã¶sprogram Ã¶tser, initierar och Ã¶nder ett Ã¶tst med hjälp av eVOLVER-plattformen med eVOLVER-plattformen. Dagen före experimentet, förbereda media, injektionsflaska, och inokulat enligt manuskriptet.I tre stora bägare, förbered två bägare på 10%blekmedel och en bägare på 70%etanol. Använd omkopplarna på eVOLVER-enheten, sätt på fem volts strömförsörjning på eVOLVER, vänta i fem sekunder och slå sedan på 12 volts strömförsörjning. Om du kör flera injektionsflaska från samma mediaflaska, anslut flera mediainmatningslinjer med slangdelare.Anpassade slangdelare kan konstrueras med lägre komponenter. Dränka mediaingången i den första blekbägaren och mediaefluxlinjerna i den andra blekbägaren. Anslut nedströmsänden på mediaindatalinjerna till den andra bägaren med efluxlinjerna.Placera avfallsledningar i en sopbilspojke. Lägg till en till två liter blekmedel i avfallet carboy att sterilisera avfall som genereras under experimentet. Med hjälp av pekskärmen på eVOLVER navigerar du till inställningssektionen och kör alla pumpar i 20 sekunder för att fylla vätskelinjerna med 10 %blekmedel.Låt blekmedel sitta i linjerna i minst 30 minuter för att sterilisera. Kör pumparna igen med hjälp av pekskärmen tills linjerna inte längre är nedsänkt, trycka luft genom linjerna för att få så mycket av blekmedel ut som möjligt. Placera media ingångslinjer i etanolbägaren, fyll linjerna med etanol, spola dem med luft.Fäst sedan media inmatningslinjer till media flaskor med de nedre kontakterna och kör pumparna tills media helt går igenom linjerna spola ut någon kvarvarande etanol. Lägg delvis in steriliserade injektionsflaska i eVOLVER smarta hylsor och koppla upp ingångslinjerna till det korta tillströmningsstrået och avfallslinjerna till den långa eflux-halmkvmningen enligt färgkodningen. Justera på eVOLVER-pekskärmen för att köra alla pumpar i steg om 10 sekunder för att fylla injektionsflaskan med media.Se till genom visuell inspektion, eflux pumpar effektivt bort media genom eflux sugrör för att förhindra överflöden. Tryck sedan ner injektionsflaskan tills den är helt innesluten av den smarta hylsan. Dra ett finger över pekskärmen eller tryck på knappen Välj alla på eVOLVER-pekskärmen och ställ in de initiala temperaturförhållandena vid 30 grader Celsius och omrörning till 10.På en dator anger du eVOLVER-enheten som experimentet ska köras på. Var noga med att önskade kalibreringsinställningar har valts. Öppna eVOLVER-instrumentpanelen och navigera till sidan Experimenthanteraren.Välj Basexperimentet på experimentnas navigatorpanel eller ett befintligt experiment som utgångspunkt och klicka på Klona. Navigera till sidan Experimentredigeraren. Använd panelerna Vial Selector och Parameter Definition för att justera temperaturen till 30 grader Celsius och ställ in en övre och nedre tröskel av OD för varje injektionsflaska enligt den experimentella konstruktionen.Spara experimentet genom att klicka på Spara. Klicka sedan på pilen för att gå tillbaka till sidan Experimenthanteraren och klicka på knappen Spela upp för att köra. När experimentet är på gång navigerar du till panelen Realtidsdata i den interaktiva instrumentpanelen.För varje injektionsflaska, kontrollera att OD-värden håller vid noll. Bläddra igenom temperaturdiagrammen för att kontrollera att temperaturen är på eller går mot 30 grader Celsius. För att förbereda inokulat, först mäta OD av natten kulturer och beräkna önskad full utspädning för övernattning kulturer antar en injektionsflaska volym på 25 milliliter och en önskad start OD på ca 0,05.Genom provtagningsporten pipettera den beräknade volymen av inokulat eller blandning av inokula. Kontrollera graferna på instrumentpanelen för att se att OD ökar till 0,05. Celltillväxt och injektionsflaska villkor kan övervakas i realtid som experimentet pågår, så att forskaren att ingripa om några problem uppstår.eVOLVER är en automatiserad kontinuerlig odlingsplattform som möjliggör multiparameterkontroll av odlingsförhållandena. Kvalitativa skillnader visades mellan de vilda typ, temperaturkänsliga och saltkänsliga grupperna när log-nyckeltalen ritades mot generationer interpolerade från eVOLVER-tillväxthastighetsdata. Färg anger temperaturen för markering, medan streck skiljer saltkoncentrationer.En lutning som passar genom den linjära delen av varje tomt med hjälp av minst tre punkter, ger ett kvantitativt konditionsvärde som beskriver hur variantstammen konkurrerar mot referensstammen. Negativa konditionsvärden indikerar att variantstammen konkurreras ut av referensstammen. Kontrollera alltid att alla pumpar går effektivt och att vätskeledningar är fria från eventuella träskor.Ett överflöd kan förstöra ett experiment och potentiellt skada de smarta ärmarna. Prover tagna från eVOLVER kan därefter sekvenserade för att kontrollera om det finns genomiska förändringar till följd av experimentet. Denna information kan användas för att konstruera nya stammar eller system.För forskare som använder lab evolution eller biblioteksval är det enkelt att använda unika urvalstryck i varje eVOLVER-experiment. Återkopplingskontroll och dynamiska miljöer är nu mycket tillgängliga också. Den avfallskarbbiss kommer att innehålla små mängder blekmedel och etanol efter ett experiment.Konsultera din labbsäkerhetskoordinator för korrekt förfogande av avfall.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

En Robotic plattform för hög kapacitet Protoplast Isolering och Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

Störningar av cirkulerande miRNAs i Irritable Bowel Syndrome detekteras med hjälp av en Multiplex hög kapacitet Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Hög genomströmning Robotsvetsad Assisted Isolering av temperaturkänslig dödliga mutanter i<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Med hjälp av en fluorescerande PCR-kapillärgelelektrofores Technique att genotypa CRISPR / Cas9-medierad Knockout mutanter i en hög kapacitet Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet utfodring och hög genomströmning Triacylglyceride test på Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation av infödda kromatin Immunoprecipitation sekvensering bibliotek för Nucleosome densitet analys

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolering och hög genomströmning sekvensering bibliotek konstruktion för herbarieexemplar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Hög genomströmning identifiering av synergistisk läkemedelskombinationer med överlappning2 Metod

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enda molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analys i spirande jäst vegetativ tillväxt och meios

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...