Name: designing automated, high-throughput, continuous cell growth experiments using evolver
Uploaded: 2019-05-19T14:30:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER at JoVE.com

Sistemin tasarımında yardım için B. Stafford 'a ve sistemin inşasına yardımcı olmak için H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. pipe ve A. Cavale 'ye teşekkür ederiz. Elektronik tasarım tesisi (EDF), mühendislik ürün Yenilik Merkezi (EPıC) ve yazılım & uygulama Inovasyon Laboratuvarı (yelken), Boston Üniversitesi 'nde bulunan Hariri Bilişim Enstitüsü 'nde hizmet verebileceğini kabul ediyoruz. Bu iş bir NSF karıyer Ödülü (MCB-1350949 için A.S.K.) tarafından destekleniyordu ve DARPA HR0011-15-C-0091 ve HR0011-18-2-0014 (A.S.K.) verir. A.S.K. Ayrıca NıH yönetmen yeni yenilik Ödülü (1DP2Aı131083-01), DARPA genç fakülte Ödülü (D16AP00142) ve bilgisayar (CCF-1522074) NSF Expeditions gelen fon kabul eder.

1. medya, şişeler ve Inoculum hazırlamak
Not: Bu protokol, kullanıcıların eVOLVER sistemini önceden kalibre ettiğini ve önceki çalışma16' da açıklanan akıllı kol yapılandırmasını kullandığını varsayar. Akıllı kollu kolayca yeniden tasarlanmış veya değiştirilmiş, ancak birim ve kontrol parametrelerinin kurulum ayrıntılarını alternatif yapılandırmaları için farklı olabilir.
<ol><li>Deneyden bir gün önce, S. cerevisiae BY4741 referans gerinim ve varyant suşlarının YPD medyasında (Maya peptone Dextrose) 30 °c ' de, en az 300 rpm olarak ayarlanmış bir sallayarak kuluçta 2 ml gece sıvı kültürleri hazırlayın</li>
	<li>Steril YPD ortamını, tüplerle donatılmış temiz, otoklavlı şişelere aktarın. Alternatif olarak, medya doğrudan tüplerle önceden donatılmış şişelerde Otoklavlanmış olabilir. Not: Şişeler kapağın içine bir delik delme ve yerine güvenli konnektörler ile boru çalışan boru ile uygun. Bkz. malzeme tablosu.</li>
	<li>Her şişeye karıştırın Bar ekleyin ve bir şişe kapağı üzerinde akma ve "effluks" Pipetler ile donatılmış vida. Görsel muayene ile tüm bileşenlerin temiz olduğundan emin olun.</li>
	<li>Bir otoklavlanabilir raf içinde yer şişeleri, folyo ile kapak, ve bir yerçekimi veya vakum döngüsü üzerinde otoklav 20-dakika sterilizasyon adım.</li>
</ol>2. deney kurma
<ol><li>Üç büyük bubi içinde,% 10 çamaşır suyu, 200 mL% 10 çamaşır suyu ve 300 mL% 70 etanol 500 mL hazırlayın.</li>
	<li>EVOLVER cihazda anahtarlarını kullanarak, eVOLVER 5 V güç kaynağını açın, 5 s bekleyin, sonra 12 V güç kaynağını açın.</li>
	<li>Aynı ortam şişesinden birkaç şişe çalıştırıyorsanız, birden fazla ortam giriş satırını tüp ayırıcıyla bağlayın. Özel boru ayırıcılar Luer bileşenleri ile inşa edilebilir.</li>
	<li>İlk çamaşır suyu Beaker medya giriş hatları ve ikinci çamaşır suyu Beaker medya "effluks" hatları Submerge. Ortam giriş çizgilerinin aşağı uç ucunu "effluks" hatları ile ikinci bir kabı içine yerleştirin. Atık hatları atık karçocuk içine yerleştirin.</li>
	<li>Deneme sırasında oluşturulan atık sterilize edecek büyük boş atık carboy içine çamaşır suyu 1-2 L ekleyin. Atıkların doğru şekilde bertaraf edilmesini sağlamak için bir güvenlik koordinatörü ile görüşün.</li>
	<li>EVOLVER üzerinde dokunmatik ekran kullanarak, kurulum bölümüne gidin ve% 10 çamaşır suyu ile sıvı hatları doldurmak için 20 s için tüm pompalar çalıştırın. Çalışırken, tüm çizgilerin doldurulduğu ve pompaların normal şekilde çalıştığını görsel incelemeden emin olun. Çamaşır suyu sterilize etmek için en az 30 dakika için çizgiler oturmak izin verin.</li>
	<li>Çizgiler artık subbirleştirilmiş olana kadar dokunmatik ekran uygulamasını kullanarak tekrar pompalar çalıştırın, mümkün olduğunca çamaşır suyu dışarı kadar almak için çizgiler üzerinden hava itmek.</li>
	<li>Etanol kabı ortam giriş hatları yerleştirin ve yukarıda olduğu gibi tekrar, etanol ile çizgiler doldurma ve hava ile yıkama. Not: Etanol hızla öldürür gibi, sterilizasyon için 30 dakika beklemek gerek yoktur.</li>
	<li>Luer konnektörleri ile medya şişeleri medya giriş hatları iliştirin ve medya tamamen hatları üzerinden çalışır kadar pompalar çalıştırmak, herhangi bir kalıntı etanol dışarı yıkanıyor.</li>
	<li>Kısmen eVOLVER akıllı kollu içine sterilize şişeleri eklemek ve çizgiler üzerinde renk kodlama göre, uygun pozisyonlara hatları kanca. Kısa akması saman giriş hatları ekleyerek başlayın ve sonra uzun "effluks" saman için atık hatları. Dikkat: Gevşek bağlantılar veya yanlış yönlendirilmiş satırlar için kontrol etmek önemlidir. Bunu yapmak için başarısızlık neden olur ve büyük olasılıkla akıllı kol zarar verir.</li>
	<li>10 s artışlarla tüm pompaları çalıştırın medya ile şişeleri doldurmak için. Görsel muayene "effluks" pompalarından emin olmak, taşmaları önlemek için "effluks" pipetler aracılığıyla medyayı verimli bir şekilde kaldırmaktadır. Eğer "effluks" pipetler verimli şekilde çalışmıyorsa, fluidik hat bağlantılarını ve peristaltik pompası inceleyin. Parçaları gerektiği gibi düzeltin veya değiştirin.</li>
	<li>Tam olarak akıllı kol tarafından kaplı kadar aşağı itme şişeleri.</li>
	<li>İnteraktif kurulum sayfasındaki eVOLVER dokunmatik ekranını kullanarak deneysel parametrelerin başlangıç koşullarını ayarlayın. Tüm şişeler için, sıcaklığı 30 °C ' ye ayarlayın ve 10 ' a kadar karıştırın. Tüm şişeleri seçmek için dokunmatik ekrana bir parmak sürükleyerek bir kerede tüm şişeler için yapılabilir.</li>
</ol>3. eVOLVER yazılımı ve programlama Algoritmik Kültür rutinleri yapılandırma
<ol><li>Bir bilgisayardaki eVOLVER panosunda deneme Yöneticisi sayfasına gidin. Deneme gezgin panelinde temel deneyi veya mevcut bir denemeyi başlangıç noktası olarak seçin ve yeni Klonla 'yı tıklatın. Not: Diğer gruplardaki denemeleri, deneysel tanımın deneme yöneticisine kaydedildiği repo 'ya GitHub bağlantısını yapıştırarak kullanmak mümkündür.</li>
	<li>Denemenin çalıştırılacak deneme adını ve eVOLVER aygıtını belirtin. Sayfadaki bu alanları değiştirerek istenen kalibrasyon ayarlarının seçildiğinden emin olun.</li>
	<li>Deneysel koşulları ayarlamak için şişe seçici ve parametre Tanım bölmeleri kullanın. Örneğin, şişeler için 0-4 sıcaklığını 30 °C ' ye ayarlamak için, şişe seçicisindeki şişeleri seçin, parametre tanımını 30 olarak ayarlayın ve set'e tıklayın. Her şişe için bir üst ve alt eşik ayarlamak için bu OD için tekrarlayın.</li>
	<li>Deneysel parametre tanımları tamamlandıktan sonra, Kaydet 'i tıklatarak deneyi kaydedin ve çalıştırmak için Başlat 'ı tıklatın.</li>
</ol>4. gerçek zamanlı olarak deney ve Izleme başlatma
<ol><li>Deneme devam ettikten sonra, interaktif panoda gerçek zamanlı veri paneline gidin. Her şişe için, OD değerlerinin sıfır olarak tuttukları ve sıcaklıkların grafiklerde gezinerek programlanmış seviyelere doğru veya ilerlemesini kontrol edin.</li>
	<li>İnokulumunu hazırlamak için, gece kültürlerinin od ölçmek, 25 ml bir şişe hacmi varsayarak istenilen kat seyreltme hesaplamak ve örnekleme portu aracılığıyla şişeleri içine inokulumunu hacmi hesaplanan pipet. Örneğin, gerekli bir başlangıç OD yaklaşık 0,05 bir kültür şişe içinde OD 2,0 olan gece kültürlerinden ulaşmak için, 625 μL hücrelerin her şişeye eklenmesi gerekir.</li>
	<li>OD grafiklerinin uygun şekilde güncellendiğini görmek için Pano üzerindeki grafikleri kontrol edin. İstenen başlangıç OD yakın bir artış grafiklerde görülmelidir.</li>
	<li>Panoda ilgili grafiklerde gezinerek deneme boyunca farklı veri türlerini (OD, sıcaklık, büyüme oranı, nesiller ve medya tüketimi gibi) izleyin. Bu değerler, Kullanıcı tarafından deneysel kararlar bildirebilir (örneğin zamanlama zaman noktaları) veya otomatik geribildirim gerçekleştirmek için işlevlerde bile kullanılır.</li>
	<li>Ortam şişeleri orta deney değiştirmek için, pompa olayların oluşmasını önlemek için deneme Yöneticisi panelinde deneme duraklatın. Hızlı bir şekilde boş şişeden medya çizgisini sökün ve yeni şişeye bağlayın. Kirlenme önlemek için Boru uçları dokunmadan kaçının. Deneyi deneme yöneticisinde devam ettirin.</li>
</ol>5. eVOLVER şişeler dan örnekleme Maya hücreleri
<ol><li>Protein sentezi inhibe ve akış sitometri analizi için Maya hücrelerini düzeltmek için bir sikloheksimit çözüm hazırlayın. 15 ml konik tüpte 12 ml PBS ve 12 μL, 20 mg/ml sikloheksimit ve 5 s için Vortex ekleyin.</li>
	<li>Çok kanallı bir pipet kullanarak, kısım 100 μL, her bir 96-kuyu yuvarlak alt plakasının her bir kuyusu içine.</li>
	<li>Işığı engellemek ve gerekli olana kadar 4 °C ' de tutmak için plakası alüminyum folyo içinde sarın.</li>
	<li>Numune almak için, uzun uzunluk 200 μL ipuçları kullanılarak şişe kapağındaki örnekleme portu üzerinden pipet takın.</li>
	<li>Pipet 100 μL 'yi bir şişeden, sabitleme plakasında bir kuyu haline getirerek, 2-3x 'yi yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırarak folyo içinde iyileşir ve plakası 4 °C ' ye geri döner.</li>
</ol>6. deney kırmak ve temizlemek
<ol><li>Hazırlamak 1 L% 10 çamaşır suyu ve 2 500 mL dı su çözümleri büyük Beakers.</li>
	<li>Deneme Yöneticisi panelinde Stop komutunu göndererek deneyi durdurun. Veriler hala bulut özellikli veritabanında saklanır ve yine de daha sonra panonun gerçek zamanlı veri panelinde görüntülenebilir veya çevrimdışı analiz için indirilir.</li>
	<li>Akıllı kollu şişeleri çıkarın ve sonraki adımlarda taşmaları önlemek için bir otoklav raf yerleştirin.</li>
	<li>Medya şişelerinden medya giriş çizgilerini sökün ve onları% 10 çamaşır suyuna yerleştirin. Hatları ve şişeleri sterilize etmek için kurulum gibi eVOLVER kullanıcı arayüzünden pompalar çalıştırın.</li>
	<li>Dı suyunda şişeleri ve daldırın satırlarından hatları ayırın. İlk dı su ile sistem dışında tüm çamaşır suyu temizlemek için pompa çalıştırın, sonra hava ile.</li>
	<li>İlk 12 V güç kaynağını kapatmak, 5 s bekleyen ve sonra 5 V güç kaynağını kapatarak eVOLVER kapatın.</li>
	<li>10% çamaşır suyu, sonra da dı su ile durulayın bar ve kapaklar karıştırın emmek. Onlar aracılığıyla dı su çalıştırarak her kapağın akını ve "effluks" piponları durulayın emin olun. Film duvarlara oluşmuştur Eğer test tüp fırça kullanarak şişeleri Scrub.</li>
	<li>Atıkları uygun şekilde bertaraf edin ve atık kapları iyice durulayın. Dikkat: Atık kaplar% 10 çamaşır suyu, sterilize hücre kültürü atık ve etanol iz miktarlarının bir karışımı içerecektir. Uygun kullanım ve bertaraf için bir güvenlik koordinatörüne danışın.</li>
</ol>7. kesirli nüfusun akış sitometri analizini kullanarak Fitness ölçümü
<ol><li>Uygun floresan kanal ve dedektörler16ile donatılmış bir akış sitometresi kullanarak Bölüm 5 toplanan örnekleri analiz edin.</li>
	<li>En az 10.000 örnek başına olayları ve ileriye ve yan dağılım verileri kullanarak bozulmamış hücreler için kapı edinin.</li>
	<li>Her bir popülasyonun kesirli dağılımını belirlemek için uygun floresan kanalına (örn. GFP) dayalı kapı.</li>
	<li>Bir bilgisayarda, "dışa aktar" düğmesini tıklatarak verileri deneme Yöneticisi sayfasından istediğiniz konuma kaydedin.</li>
	<li>EVOLVER veri dosyalarından her şişe için her zaman noktası tarafından tamamlanan nesillerin sayısını belirleyin. EVOLVER kodunda, nesiller ilk olarak her bir seyreltme olayı arasındaki OD verilerini segmentlere ayırarak hesaplanır, sonra her segment, büyüme hızı <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq1.jpg"> 16olan her segment için formun temel bir üstel ile sığar. Bir zaman dilimindeki nesillerin sayısı aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq2v2.jpg">
</li>
	<li>Etiket ve etiketlenmemiş nüfusların günlük oranını, akış sitometri verilerinden üretim sayısında, yukarıdaki hesaplamalardan alınan zaman örneklerinin alındığı anda çizin. Doğrusal bölgeyi tanımlayın ve eğimi aşağıdaki denkleme göre sığdırın. Bu eğim genellikle rekabetçi Fitness18,19olarak tanımlanır. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59652/59652eq3v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+Bacterial+Cultures.">The Growth of Bacterial Cultures.</a> Annual Review of Microbiology. , (1949).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria.">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 36 (12), 708-719 (1950).</li><li>Bull, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renaissance+of+continuous+culture+in+the+post-genomics+age.">The renaissance of continuous culture in the post-genomics age.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 37 (10), 993-1021 (2010).</li><li>Gresham, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enduring+utility+of+continuous+culturing+in+experimental+evolution.">The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution.</a> Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).</li><li>Lang, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+genetic+hitchhiking+and+clonal+interference+in+forty+evolving+yeast+populations.">Pervasive genetic hitchhiking and clonal interference in forty evolving yeast populations.</a> Nature. 500 (7464), 571-574 (2013).</li><li>Maddamsetti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation,+Clonal+Interference,+and+Frequency-Dependent+Interactions+in+a+Long-Term+Evolution+Experiment+with+Escherichia+coli.">Adaptation, Clonal Interference, and Frequency-Dependent Interactions in a Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli.</a> Genetics. 200 (2), 619-631 (2015).</li><li>Ishii, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+High-Throughput+Analyses+Monitor+the+Response+of+E.+coli+to+Perturbations.">Multiple High-Throughput Analyses Monitor the Response of E. coli to Perturbations.</a> Science. 316 (5824), 593-597 (2007).</li><li>Brauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+Growth+Rate,+Cell+Cycle,+Stress+Response,+and+Metabolic+Activity+in+Yeast.">Coordination of Growth Rate, Cell Cycle, Stress Response, and Metabolic Activity in Yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li><li>Moser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+performance+under+conditions+relevant+for+industrial+bioreactors.">Genetic circuit performance under conditions relevant for industrial bioreactors.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (11), 555-564 (2012).</li><li>Kao, K. C., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+clonal+interference+during+adaptive+evolution+in+asexual+populations+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1499-1504 (2008).</li><li>Toprak, E., Veres, A., Michel, J. -. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+paths+to+antibiotic+resistance+under+dynamically+sustained+drug+selection.">Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection.</a> Nature Genetics. 44 (1), 101-105 (2011).</li><li>Hope, E. A., Amorosi, C. J., Miller, A. W., Dang, K., Heil, C. S., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Evolution+Reveals+Favored+Adaptive+Routes+to+Cell+Aggregation+in+Yeast.">Experimental Evolution Reveals Favored Adaptive Routes to Cell Aggregation in Yeast.</a> Genetics. 206 (2), 1153-1167 (2017).</li><li>Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Use+of+Multiplexed+Chemostat+Arrays.">Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), 2-7 (2013).</li><li>Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost,+customizable+turbidostat+for+use+in+synthetic+circuit+characterization.">A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (1), 32-38 (2015).</li><li>Toprak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+morbidostat:+an+automated+continuous-culture+device+for+studying+bacterial+drug+resistance+under+dynamically+sustained+drug+inhibition.">Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition.</a> Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).</li><li>Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise,+automated+control+of+conditions+for+high-throughput+growth+of+yeast+and+bacteria+with+eVOLVER.">Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).</li><li>Bondi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+scalability+and+their+impact+on+performance.">Characteristics of scalability and their impact on performance.</a> Proceedings of the Second International Workshop on Software and Performance - WOSP &#8217;00. , 195-203 (2000).</li><li>Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Chemostats+in+Microbial+Systems+Biology.">The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50168 (2013).</li><li>Sanchez, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+paralog+divergence+modulates+genome+evolution+across+yeast+species.">Differential paralog divergence modulates genome evolution across yeast species.</a> PLOS Genetics. 13 (2), e1006585 (2017).</li><li>Gibney, P. A., Lu, C., Caudy, A. A., Hess, D. C., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+metabolic+and+signaling+genes+are+required+for+heat-shock+survival+and+have+little+overlap+with+the+heat-induced+genes.">Yeast metabolic and signaling genes are required for heat-shock survival and have little overlap with the heat-induced genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), E4393-E4402 (2013).</li><li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418 (6896), 387-391 (2002).</li><li>Piper, M. D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+oligonucleotide+microarray+transcriptome+analyses.+An+interlaboratory+comparison+using+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Reproducibility of oligonucleotide microarray transcriptome analyses. An interlaboratory comparison using chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (40), 37001-37008 (2002).</li><li>Badarinarayana, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays.">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature Biotechnology. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li><li>Dai, J., Hyland, E. M., Yuan, D. S., Huang, H., Bader, J. S., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Nucleosome+Function:+A+Highly+Versatile.">Probing Nucleosome Function: A Highly Versatile.</a> Library of Synthetic Histone H3 and H4. 134 (6), 1066-1078 (2008).</li><li>McGeachy, A. M., Meacham, Z. A., Ingolia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Accessible+Continuous-Culture+Turbidostat+for+Pooled+Analysis+of+Complex+Libraries.">An Accessible Continuous-Culture Turbidostat for Pooled Analysis of Complex Libraries.</a> bioRxiv. , 450536 (2018).</li><li>Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+the+continuous+directed+evolution+of+biomolecules.">A system for the continuous directed evolution of biomolecules.</a> Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).</li><li>Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+selection+and+stringency+modulation+in+phage-assisted+continuous+evolution.">Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 216-222 (2014).</li><li>Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+optogenetic+feedback+control+for+precise+and+robust+regulation+of+gene+expression+and+cell+growth.">Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth.</a> Nature Communications. 7 (May), 12546 (2016).</li><li>Wenger, J. W., Piotrowski, J., Nagarajan, S., Chiotti, K., Sherlock, G., Rosenzweig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hunger+Artists:+Yeast+Adapted+to+Carbon+Limitation+Show+Trade-Offs+under+Carbon+Sufficiency.">Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency.</a> PLoS Genetics. 7 (8), e1002202 (2011).</li><li>Yona, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+duplication+is+a+transient+evolutionary+solution+to+stress.">Chromosomal duplication is a transient evolutionary solution to stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 21010-21015 (2012).</li><li>Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Britton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+stable,+reproducible+microbial+communities+from+different+fecal+donors+using+minibioreactor+arrays+(MBRAs).">Cultivation of stable, reproducible microbial communities from different fecal donors using minibioreactor arrays (MBRAs).</a> Microbiome. 3, 42 (2015).</li><li>Goldford, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+simplicity+in+microbial+community+assembly.">Emergent simplicity in microbial community assembly.</a> Science. 361 (6401), 469-474 (2018).</li><li>Lagier, J. -. C., Dubourg, G., Million, M., Cadoret, F., Fournier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+the+human+microbiota+and+culturomics.">Culturing the human microbiota and culturomics.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (September), 540-550 (2018).</li><li>Fukami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+Contingency+in+Community+Assembly:+Integrating+Niches,+Species+Pools,+and+Priority+Effects.">Historical Contingency in Community Assembly: Integrating Niches, Species Pools, and Priority Effects.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 46 (1), 1-23 (2015).</li><li>Friedman, J., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+systems+biology:+The+dynamics+of+interacting+populations.">Ecological systems biology: The dynamics of interacting populations.</a> Current Opinion in Systems Biology. 1, 114-121 (2017).</li><li>Crook, N., Abatemarco, J., Sun, J., Wagner, J. M., Schmitz, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+continuous+evolution+of+genes+and+pathways+in+yeast.">In vivo continuous evolution of genes and pathways in yeast.</a> Nature Communications. 7, 13051 (2016).</li><li>Ravikumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+Continuous+Evolution+of+Genes+at+Mutation+Rates+above+Genomic+Error+Thresholds.">Scalable, Continuous Evolution of Genes at Mutation Rates above Genomic Error Thresholds.</a> Cell. 175, (2018).</li></ol>

Yazarlar, Brandon G. Wong ve Ahmad S. Khalil, bu makalede kullanılan eVOLVER platformu geliştiren Fynch Bioscience Inc., kurucularından vardır.

Büyüme seçimi biyoloji vazgeçilmez bir araçtır, geniş oluşturmak ve hücresel nüfus arasındaki fenotipi farklılıkları karakterize etmek için kullanılır. Toplu kültürler büyüme seçimi sınırlı bir şekilde izin verirken, sürekli kültür teknikleri önemli ölçüde bu deneylerin kontrol ve öngörülebilirlik derecesini genişletmek, form ve seçim dinamikleri oluşturmak için üzerinde hassas düzenleme uygulayarak tekrarlanabilen, nicel sonuçlar22. Sürekli kültür, yüksek çeşitlilik kitaplıkları için20,23,24,25ve deneysel olarak sofistike adaptif rejimler uygulamak için seçimi titizlikle kontrol etmek için kullanıldı ve Yönetmen evrim11,12,26,27. Sürekli kültür, kompleks genetik sistemleri daha iyi anlamak ve mühendislik biyoprodüksiyon suşları optimize etmek için bir dizi niceli kontrollü koşullarda hücrelerin kesin karakterizasyonu sağlar9,14 , 28oldu.
Ancak, sürekli kültür için evrensel bir protokol yoktur, seçici koşullarda ince değişiklikler biyolojik sonuçlarında dramatik değişikliklere yol açabilir gibi4,29,30. Deneyler seçim rejimi arasında seçim yapmak ve buna göre deneysel protokoller ve ekipman uyum mümkün olmalıdır. Kontrol parametreleri arasında bir seçim sunmanın yanı sıra, bu tür sistemler, karmaşık olarak etkileşime giren girişleri deşifre etmek için gerekli olan yüksek paralel deneylerde aynı anda çeşitli parametreleri yönetmek için yeterince sofistike olacaktır biyolojik sistemler (örn. epistasis). eVOLVER, kullanıcıların oldukça uzmanlaşmış çevresel niş belirtmek için kültür koşulları ve fluidik fonksiyonlar arasında keyfi program geribildirim denetimi sağlayarak bu sorunu giderir.
Geçerli kurulumun sınırlamalarını aşmak ve kontrol parametrelerini genişletmek veya değiştirmek için akıllı kol, yeni sensörler veya aktüatörler eklemek için kolayca yeniden tasarlanabilirdi. Ayrıca, şişe hacmini azaltmak, sürekli kültürde önemli olabilecek medya harcamalarını azaltacaktır. Mevcut tasarım sıcaklık, kültür ajitasyon, ışık indüksiyon, bulanıklık ve Fluidics ölçüm ve kontrol izin verirken, diğer parametreler dıştan şişe örnekleme tarafından ölçülmelidir. Güncel çalışmalar, Lusiferaz yoluyla enzimatik aktivitesi izleme ve çözünmüş oksijen ve pH 'yı doğrudan Evolver kültürlerinde düzenleyen yeteneğini içerir. Ayrıca, bu çalışma gösterilmiyor iken, Evolver yeni millifluidic çoğullama cihazları ile arayüz olabilir16 büyük ölçekli entegrasyon ilkeleri üzerinde beraberlik (elektronik kaynaklanan ve mikrofluidics tarafından benimsenen) amacıyla pahalı olmayan daha karmaşık fluidik elleçleme (örn. Multiplexed fluidik girişler, şişe-şişe transferleri). Bu Wetware modülleri, otomatikleştirilmiş fluidik rutinlerde farklı vanalar kombinasyonlarını programlayarak kullanıcıların akışkanlar yönlendirmesine olanak tanıyan laboratuvarda tamamen tasarlanıp imal edilebilir. Bu, kullanıcıların geleneksel olarak sürekli kültürde kullanılan sert fluidik tasarımları üstesinden gelmelerine izin verir, aynı zamanda daha az sayıda pahalı kontrol elemanı (örn. Peristaltik pompalar) ile fluidik yetenekleri yüksek verim için ölçeklendirebilir. Son olarak, bu millifluidics ve DıY bileşenleri kullanacak bir autosampling platformu dahil etmek umuduyla, daha uzun ve örnekleme kültürlerinin hantal olacağını daha büyük deneyler sırasında manuel etkileşim sınırlaması üstesinden.
Platformdaki fiziksel değişikliklere ek olarak, Web tabanlı yazılım, kullanıcıların özel eVOLVER komut dosyalarını yazmalarına, düzenlemesine ve paylaşmasına izin vererek, tam otomatik, geri bildirim özellikli kültür programları (örn. turbidostat) oluşturarak yeni özgürlük derecelerini açar. Kullanıcılar programlı olarak aynı seçim şeması üzerinde ince varyasyonlar parametre aralıkları arasında süpürme veya karmaşık seçim düzenleri herhangi bir sayıda belirtmek için yeni kombinasyonları denetim algoritmaları bağlayın. Ayrıca, kültürlerin gerçek zamanlı olarak kolayca izlenmesi yeteneği, deneylerin gerçekleştirildiği yolu dönüştürür. Gerçek zamanlı izleme ile, kullanıcılar 1) çalışır arasında tutarlılık, biyoüretim uygulamaları ve yüksek verimlilik denemeleri için kritik bir özellik kontrol ve 2) gerektiğinde denemeler sırasında müdahale, sergileyen zorlu suşları gidermek için düşük büyüme veya biyofilm oluşumu veya kullanıcı hatalarını teşhis etmek (örneğin, kontaminasyon). Son olarak, birden çok veri akışları ile toplanan ve gerçek zamanlı olarak her bir kültür için yorumlanan eVOLVER yeni akış analizi için makine öğrenme yaklaşımlarını kolaylaştırabilir veri, yüksek yoğunlukta oluşturur.
Fitness karakterizasyonu, Kütüphane seçimi ve laboratuar evrimine yönelik kullanımlarının ötesinde, entegre fluidikler ile eVOLVER 'de uygulama için olgunlaşmış olarak ilgili alanların bir sayısını görebilirsiniz. Mikrobiyom örnekleri ile Evolver deneyler kontrollü ortamlarda,32, Kültüromik teknikleri33kullanarak Mikrobiyota kompozisyon keşfetmek, veya dinamik türler için türleri karışım tahlil toplum istikrar olabilir kolonizasyon veya istila34,35ekolojik dinamiklerini sorgulama. Biyomoleküllerin sürekli yönlendirilmiş evrim için çok sayıda yöntem kolayca de26,36,37, büyük ölçüde erişilebilirlik ve bu sistemlerin verimi artan cihazda uygulanabilir. Dinamik, yüksek verim doğası içinde medya kompozisyon, sıcaklık ve suşları gibi büyüyen koşulları optimize yeteneği endüstriyel biomanufacturing uygulamaları için optimizasyon çabaları yardımcı olabilir9. Biz daha fazla dikey entegre eVOLVER mikroskopi ve akış sitometri gibi diğer analiz teknikleri ile kapalı bir döngü moda, büyüme ve hem tek hücre ve nüfus hücresel kültürlerin analizi için tam otomatik bir sistem sağlayan Düzey. Dahası, akıllı Sleeve bazı donanım modifikasyonları ile gemi sızdırmazlık ve gaz içeriği kontrol gibi, eVOLVER potansiyel hücre türleri, süspansiyon memeli hücreler gibi daha geniş bir yelpazede büyümesini desteklemek için adapte edilebilir. Ayrıca, tüm çerçeveyi anaerobik hücre kültürü için bir anaerobik odasına yerleştirmek de mümkündür. İleriye bakarak, bizim yazılım çerçevesi merkezi bir bulut altyapısına oluşturmak ve bu kullanıcıların kolayca yapılandırmak, analiz ve fiziksel laboratuvarında mevcut olmasına gerek kalmadan uzaktan verileri paylaşmak için izin inanıyorum hedefliyoruz. Veri küratörü olarak işleyen bulut altyapısı, deneyler boyunca büyük ölçekli meta analizlere de kendini ödünç verir. Biz eVOLVER ve bu gelecekteki gelişmeler büyük ölçüde sürekli kültürde Otomasyon ve yenilik kolaylaştırarak olası büyüme seçim deneylerinin kapsamını genişletmek olacağını tahmin ediyoruz.

Sürekli hücre kültürü teknikleri, ilk geliştirilen yaklaşık 70 yıl önce1,2, yeni bir canlanma zevk var3,4. Bu faktörlerin bir konfluence kaynaklanmaktadır. İlk olarak, yüksek verimlilik-omics teknikleri, hangi okumak ve genotip5,6çok sayıda üretmek mümkün kılan gelişimi, kolaylaştırmak Deneysel teknikler için bir eşlik talebi yarattı iyi kontrollü hücre büyümesi ve fenotipleme. Bu amaçla, sürekli kültür, acil genomik ilerlemeler için güçlü bir deneysel yaklaşımı temsil eder. Tam kontrollü (ve dinamik) çevre koşullarında hücresel nüfus üzerinde büyüme seçimleri/deneyleri kolaylaştırarak, sürekli kültürü fenotipleri için titiz bir şekilde harita için bir yol sağlar7,8, niciliksel olarak tasarlanan suşları ve organizmaları9olarak karakterize edin ve laboratuar evrim çalışmalarında adaptif genetik değişiklikleri10,11,12.
İkinci olarak, ilave üretim ve açık kaynak donanım ve yazılım elemanları gibi erişilebilir prototipleme tekniklerinin son ortaya çıkması, kullanıcıların daha geniş bir yelpazeyi tasarım ve sürekli kültür sistemlerinin kendi maliyet etkin formlarını oluşturmak için sağladı doğrudan laboratuvarda. Tüm bunlar, chemostat13, turbidostat14veya MORBIDOSTAT15gibi sürekli kültür işlevlerini gerçekleştiren heyecan verici bir dizi yapmak-it-yourself (DIY) aygıtlarına yol açtı. Ne yazık ki, belirli (niş) sorunları hangi onlar tasarlanmış, bu geçici çözümler genellikle verimi ve/veya deneysel tasarım karmaşıklığı ölçek yeteneği eksikliği ele başarılı olsa.
EVOLVER sistemi, sürekli kültürün büyüyen deneysel ihtiyaçlarını karşılayacak ve acil genomik tekniklerin hızı ve ölçeği16 (Şekil 1a) ile eşleşen tek bir platform oluşturma amacı ile tasarlanmıştır. eVOLVER 'ın tasarımı, standart ayak izleri, modüler bileşenler ve açık kaynak tasarım ilkeleri dahil olmak üzere17diğer disiplinlerden yüksek oranda ölçeklenebilir teknolojilerin temel aldığı ortak ilkeleri uygular. Böylece, yeni niş uygulamalar için çözümler sistemde büyük değişiklikler olmadan tasarlanmış olabilir. Son derece modüler ve açık kaynaklı Wetware, donanım, elektronik ve Web tabanlı yazılım oluşur, eVOLVER maliyet-etkin ve kolayca yeniden yapılandırılmış ilk otomatik sürekli kültür sistemi neredeyse her türlü yürütmek için yüksek verimlilik büyüme deneyi. Bireysel kültürlerin kontrol edilmesi için gerekli tüm sensörler ve aktüatörlerin bulunduğu modüler ve programlanabilir akıllı kollu ile eVOLVER, her iki verimlilik ve kültür koşullarının bireysel kontrolünü ölçeklendirmeyi sağlar. Ayrıca, Web tabanlı bir platform olarak, eVOLVER gerçek zamanlı olarak uzak bilgisayarlar ile veri ve bilgi değişimi, bireysel kültürler ve otomatik kültür perturbations yüzlerce eşzamanlı izleme keyfi tanımlı kontrol yoluyla izin Algoritma.
Önceki çalışma16' da Evolver 'in güçlü performansı, yüzlerce saatlik operasyon boyunca uzun vadeli deneyler ve E. coli ve s. cerevisiae 'den çeşitli organizmaları yetiştirmek için yeteneklerini ortaya koymuştur. Mikrop. Farklı büyüme seçim deneyleri bir dizi, hangi programlı olarak tanımlanmış çok boyutlu seçim degradeler bireysel kültür koşulları bir dizi boyunca uygulanan ve ortaya çıkan hücresel Fitness manzaralar yapıldı Quantified. Burada, amaç, eVOLVER kullanıcılarının tasarım ve bu tür deneyler için sistemi nasıl kullananlar hakkında bir açıklama sunlamasıdır. Açıklayıcı bir örnek olarak, S. cerevisiae mutantların Fitness manzarayı sıcaklıktan ve osrotik stresden oluşan iki boyutlu çevresel gradyan arasında ölçülme yöntemleri sunulmaktadır. Protokol her iki programlı olarak, her 16 paralel sürekli kültürler için özelleştirilmiş bulanıklık ve sıcaklık kontrol rutinleri ayarlamak için yazılımı kullanarak, bu deneme için eVOLVER çerçevesi yapılandırma yoluyla kullanıcılar kılavuzları ve fiziksel olarak, farklı tuz konsantrasyonları Medias uygun rota için Akışkanlar düzeni aracılığıyla. Bu protokol, eVOLVER 'in çeşitli çalışmalar ve disiplinler için çok çeşitli otomatik sürekli kültür denemeleri yürütmek üzere yapılandırılması için genel bir dereceli Puanlama anahtarı olarak hizmet vermelidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Gallon Plastic Hedpack with cap</td>
			<td>Midwest Brewing and Winemaking Supplies</td>
			<td>45-56Y8-E2FR</td>
			<td>For waste collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-D(+)-Glucose</td>
			<td>Chem-Impex</td>
			<td>00805</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Autosampler</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine population fractions via single cell fluoresence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0118-07-0</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2648250</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8&#34; Tube ID, 250&#176;F Maximum Temperature</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>5121K731</td>
			<td>For media input branching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50371500</td>
			<td>For Sterilization of fluidic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom eVOLVER vial lid</td>
			<td>FynchBio</td>
			<td></td>
			<td>Lid has ports for sampling and fluidic input/output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10018301</td>
			<td>For flow cytometry sampling plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A405P-4</td>
			<td>For sterilization of fluidic lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eVOLVER Unit</td>
			<td>FynchBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-420</td>
			<td>For vial sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-57</td>
			<td>Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB8002000</td>
			<td>Must be fitted with tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8&#34; ID, 1/4&#34; OD</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51135K73</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Mini</td>
			<td>Apple</td>
			<td></td>
			<td>For running the experiment/collecting data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP243820</td>
			<td>For flow cytometry sampling plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K141</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K144</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K291</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32&#34; Barbed Tube ID, Polypropylene</td>
			<td>McMaster- Carr</td>
			<td>51525K294</td>
			<td>For media bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-4910-04</td>
			<td>Culture vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fsher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>For measuring OD600 of overnight cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400</td>
			<td>Chemglass</td>
			<td>CG-4902-08</td>
			<td>Culture vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>For YPD Medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

designing automated, high-throughput, continuous cell growth experiments using evolver

Sürekli kültür yöntemleri, hücrelerin niceli kontrollü çevresel koşullarda yetiştirilmesine olanak sağlar ve böylece Fitness fenotiplerini ölçmek ve genotiplerin seçime göre nasıl şekillendirileceğini anlayışımızı iyileştirmek için geniş ölçüde yararlıdır. Kapsamlı son çabaları geliştirmek ve niş sürekli kültür cihazları uygulamak için hücre kültürü kontrolü yeni formları gerçekleştirme yararları ortaya koydu. Bu, uzun vadeli deneysel evrimin genom çapında Kütüphane seçimleri ve sentetik gen devresi karakterizasyonu ile değişen çalışmalar için özel seçim basınçları ve artan verim tanımlama içerir. EVOLVER platformu son zamanlarda bu büyüyen talebi karşılamak için geliştirilmiştir: ölçeklenebilirlik, esneklik ve otomasyon yüksek derecede bir sürekli kültür platformu. eVOLVER (yeniden)-yapılandırılabilir ve yüksek verimlilik veya çok boyutlu büyüme seçim deneyleri birçok farklı türde gerçekleştirmek için minimal çaba ile ölçeklendirilebilir tek bir Standartlama platformu sağlar. Burada, bir protokol eVOLVER çerçevesi kullanıcıları özel, büyük ölçekli sürekli büyüme deneyi yapmak için sistem yapılandırma için bir açıklama sağlamak için sunulmuştur. Özellikle, protokol, sistem nasıl iki seçim basıncı-sıcaklık ve Osmolarite-birçok Evolver şişeleri genelinde Saccharomyces cerevisiae mutantlar Fitness manzaralar ölçmek için Multiplex için program kılavuzları kullanıcılar ince Çözünürlük. Cihazın, açık kaynak Web tabanlı yazılımı aracılığıyla ve fiziksel olarak, fluidik ve donanım mizanpajları düzenleyerek hem programlı olarak nasıl yapılandırıldığını gösteriyoruz. Fiziksel olarak cihazı kurma, kültür rutinini programlama, internet üzerinden gerçek zamanlı deneyle izleme ve etkileşime girme, sonraki çevrimdışı analiz için şişe örnekleme ve deney sonrası veri analizinin Analizi ayrıntılı bir süreçtir. Bu, çeşitli disiplinlerde araştırmacılar için bir başlangıç noktası olarak çalışma ve biyolojik sistemleri işlemek için kendi karmaşık ve yüksek verimlilik hücre büyüme denemeleri tasarımında eVOLVER uygulamak için hizmet etmelidir.

Burada açıklanan protokol, sıcaklık ve tuzluluk iki boyutlu stres gradyan arasında S. cerevisiae genetik türevleri için fitness haritaları oluşturmak için kullanılmıştır. Özellikle, her varyant gerinim için, bir floresan etiketli referans gerilme (S. cerevisiae gerinim BY4741 entegre bir kurucu mneongreen muhabiri) karşı ikili rekabet denemeleri yapmak için Evolver kullanılan 16 farklı Bu gerilimlerin kombinasyonları (Şekil 1). Varyantlar için, her biri stres koşulu eksenlerine duyarlı olarak öngörülen iki nakavt suşları seçilmiştir: yüksek sıcaklıklarda20 ve Δpbs2 Fitness kusurlarına sahip olduğu bildirilmiştir δprx1 yüksek tuz konsantrasyonları21. Bir kontrol varyantı olarak, referans gerilime benzer şekilde gerçekleştirilmesi beklenen, etiketlenmemiş bir vahşi tip BY4741 gerinim kullanılmıştır. Toplam olarak, bu 3 72-saat rekabet deneyler üç eVOLVER (16-şişe) cihazlar tüm tek bir bilgisayardan çalıştırmak arasında 48 şişeler aynı anda gerçekleştirildi.
EVOLVER interaktif Pano, her deneme sırasında oluşturulan büyük miktarda veri gezinmek için kullanılır (Şekil 2a). Tek bir eVOLVER cihazının 16 şişeleri arasında temsili OD izleri Şekil 2B'de gösterilir. Her iz, seyreltme tetiklemek ve kültürleri dar bir yoğunluk aralığında korumak için OD üzerinde geribildirim kullanan turbidostat kontrol algoritmasından karakteristik bir testere diş deseni görüntüler (Bu durumda 0.2-0.3). OD ve sıcaklık verileri sürekli olarak ölçülür, bulut özellikli veritabanına akışlı ve eVOLVER interaktif panoda gerçek zamanlı olarak güncellenir. Sürekli akış verilerinden, yüksek sıralı metrikler (örn. büyüme oranı, birikimli nesiller) panoda hesaplanabilir ve çizilebilir (Şekil 2C) ve hatta farklı seçim şemaları (örneğin, morbidostat) geri bildirim parametreleri olarak kullanılır.
Fitness haritaları oluşturmak için, referans geriliminin hem akış sitometri ölçümleri hem de eVOLVER büyüme verilerini birleştirerek varyant gerginliği outcompetes oranını ölçüyoruz. Özellikle, nüfus fraksiyonları her timepoint örneğinden akış sitometri verilerini kullanarak referans gerinim üzerinde varyant gerinim günlük oranı olarak hesaplanır. Her kültür ve zaman noktası için, geçen nesillerin sayısı, her seyreltme döneminde eVOLVER büyüme oranı verilerinden interpolasyonlu edilir. Günlük oranlarını nesillere karşı çizmek, koşullar arasındaki nitel farklar ortaya çıkmaya başlar (Şekil 3A). Fitness hesaplamak için, bir eğim her Plot18,19, bir nicel Fitness değeri (hem işaret ve oranı ile), varyant gerinim referans gerinim karşı nasıl yarışır açıklayan doğrusal kısmı ile uygundur ( Şekil 3B). Bu deneyde, negatif Fitness değerleri varyant gerinim referans gerinim tarafından outcompeted olduğunu gösterir. Tüm fitness hesaplamalarından ısı haritaları oluşturmak iki boyutlu Fitness peyzaj görselleştirme izin verir, suşlar ve koşullar arasında performans ince nicel farklılıkları açığa (Şekil 3c).
Fitness heatmaps, biz her varyant gerinim farklı şekillerde tezahür Fitness kusurları sergiler bakın. Δprx1 , öncelikle yüksek sıcaklıklara duyarlıdır, ancak tuz gerilimi, Fitness kusurunu artıran bir katkı efekti gibi görünür. Bunun tersine, Δpbs2 , sıcaklık ekseni boyunca minimal farklar ile yüksek tuz konsantrasyonlarına yanıt olarak öncelikle Fitness kusurları gösterir. Bu sonuçlar, özellikle birden fazla çevresel stresler, katkı, sinerjik veya epistatik etkileri olabilir etkileşimleri deşifre için yüksek çözünürlüklü seçim deneylerinin yardımcı programını vurgulayın.
Son olarak, bazı durumlarda, özellikle ciddi stres koşulları için, Fitness hesaplamaları abartılı veya eğrilmiş sonuçlara yol açabilir dikkat etmek önemlidir. Örneğin, Δpbs2 , referans gerilimine göre 39 °c/1 M NaCl koşulunda dik bir pozitif eğim göstermek için görünür (Şekil 3A). Bu, vahşi tür verilerinde yansıtılır ve bu durumda bu belirli metrik yardımcı programı sınırlar her iki suşların kötü büyüme atfedilir. Nesil yetersiz sayısı 1), eğim bağlantısı ile müdahale zaman noktalarının zayıf ayrımı ve 2) gecikme aşamasından kaynaklanan Stokastik etkilere karşı duyarlılık oluşur. Bu çalışmada bunu seçmediğiniz sırada, eVOLVER tarafından deney sırasında toplanan gerçek zamanlı büyüme verileri, deneyi uzatmak ve bu durum için ek timepoints toplamak için küçük bir çaba ile karar vermek için kullanılmış olabilir. Takip deneylerinde, doygunluk oluşmadan önce doğrusal bölgenin uzunluğunu uzatmak için başlangıç oranları da modüe edilebilir.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3.jpg"> Şekil 1: eVOLVER çerçevesi ve deneysel tasarım genel bakış. (A) Evolver, kültür koşullarının çok parametreli kontrolüne izin veren otomatik, sürekli bir kültür platformudur. Platform, kültür koşullarını kontrol etmek için sensörler ve aktüatörler, kültürlerin içinde ve dışında akan medya ve atık için peristaltik pompa dizisi, cihaz ile manuel etkileşim için bir dokunmatik ekran ve bir bilgisayar olan akıllı kollu, oluşur platformdaki verilerin akışa aldığı bulut altyapısıyla etkileşimde bulunmak için kullanılır. (B) Evolver birden çok şekilde yapılandırılabilir: fiziksel olarak, hücre ve medya girişleri ve program aracılığıyla akıllı kollu kültür şişe modülleri kontrol algoritmaları ayarlayarak. Bu çok boyutlu seçim/çevresel degradeler yüksek çözünürlükte program için kullanılabilir, belirlenen zaman noktalarında fiziksel olarak toplanan hücrelerden oluşan çıkışlar ve kültür verilerinin gerçek zamanlı akışı ile. (C) bir iki boyutlu seçim gradyan arasında büyüme Fitness deneyi yapmak Için Evolver yapılandırma, sıcaklık ve ozostik stres oluşur. Evolver kültür şişeleri bir referans ve varyant Maya gerinim eşit oranlarda ile seribaşı edildi. Bir turbidostat rutin tanımlanmış bir OD penceresinde (OD 0.2-0.3) üstel faz tüm kültürler korumak için programlanmıştır. Sıcaklık ve medya koşulları, iki bağımsız stres degradeleri oluşturmak için akıllı kol dizisi boyunca değişebilir. Temel medya, bakteriyel kontaminasyona karşı önlem olarak YPD (% 2 glikoz) + 100 μg/ml karbenikilin + 25 μg/ml kloramfenikol 'dan oluşmuştur. Medya bileşimleri, 0 M, 0,6 m, 0,8 M veya 1,0 M 'ye ek NaCl ekleyerek çeşitlendirilmiş. şişe sıcaklıkları dört değerden birine programlanmıştır: 30 °C, 35 °C, 37 °C, veya 39 °C. (D) üç test koşulundan kültür od ve nüfus fraksiyonları için ham çıktı örnekleri. Yarışma deneyi 72 h, 24 saat ve daha sonra her 12 saat deneme sonucuna kadar örnekleme için tutulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig1v3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig2.jpg"> Şekil 2: eVOLVER gerçek zamanlı veri analizi panosu. (A) Evolver verileri, bulut tabanlı yazılım aracılığıyla interaktif bir panoya gerçek zamanlı olarak işlenir ve akışa verilir. Pano aracılığıyla, kullanıcılar tanımlayabilir ve bağlı bir eVOLVER üzerinde kendi kültür rutinleri başlatmak, tüm eVOLVER birimleri arasında şu anda çalışan denemeler monitör ve tek bir şişe veya gerekirse şişeleri set el ile deneysel koşullar değişebilir. (B) tüm deney süresi boyunca test edilen koşulların matrisinde her şişe için od izleri. İzlemeler, deneylerin istenilen şekilde çalıştığını ve daha fazla analiz için kullanılan Post-deney olmasını sağlamak için gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir. (C) büyüme oranları ve hücre nesiller deney ilerlemesini izlemek için sınek üzerinde od izleri hesaplanabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59652/59652fig3.jpg"> Şekil 3: Fitness yüzeylerinin inşası. (A) hücre popülasyon fraksiyonları doğal log (varyant strain/referans strain) hücreler nesil karşı çizilen. Renk, tuz konsantrasyonlarını ayırt ederken seçimin sıcaklığını gösterir. (B) varyantın göreli Fitness değerini referans gerilmesine göre ölçmek için, bir fitness ölçümü, hücre nüfus kesinin nesiller boyunca değiştiğini gösteren oranlardan türetilir. Bu metrik, en az üç nokta kullanarak hücresel kesir grafiklerinde doğrusal bölgeden hesaplanır. (C) Bağıl Fitness ölçümleri, çevresel stres degradelerinin üzerinde bir fitness yüzeyi oluşturmak için bir heatmap 'de görüntülenir. Vahşi tip ve Δpbs2 için sağ üst köşe koşulu (39 °c/1.0 M NaCl), kültürlerin yetersiz nesillerden geçtiğini (bkz. temsilci sonuçları) kullanarak bu analizlere dahil edilmez. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59652/59652fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER at JoVE.com

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

EVOLVER çerçevesi yüksek çözünürlüklü ve deneysel parametreler üzerinde dinamik kontrol ile yüksek verimlilik sürekli mikrobiyal kültür sağlar. Bu protokol, kullanıcıların birçok bireysel kültürde otomatik kontrolü programlama, ölçme, toplama ve deneysel verilerle gerçek zamanlı etkileşime girme konusunda rehberlik ederek karmaşık bir fitness deneyi yapmak için sistemin nasıl uygulanacağını gösterir.

EVOLVER kullanarak otomatik, yüksek verimlilik, sürekli hücre büyüme denemeleri tasarlama

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

eVOLVER araştırmacılara deneysel özgürlük, birden fazla parametre üzerinde otomatik geribildirim ile kendi kültür büyüme deneylerini tanımlama ve ihtiyaç duydukları boyuta ölçeklendirme olanağı sağlar. eVOLVER diğer cihazlara göre daha esnektir. Kullanıcılar, her kültür için sensörleri tutan akıllı kılıfları değiştirerek Python'daki yazılımları ve donanımı kolayca özelleştirebilir.Sistem ilk bakışta birden çok bileşen ve bağlantıyla karmaşık görünebilir. Görsel bir kılavuz, ilk kez kullanıcıların kendi denemelerini çalıştırmakonusunda daha fazla güven sağlar. Uygun kurulum çok önemlidir.Her bileşenin ne yaptığını anladığınızdan emin olun. Böylece çalıştıklarını doğrulayabilirsiniz. Her şeyin doğru yönlendirildiğından ve sıkıca bağlandığından emin olun.Bakteri ve mayanın farklı koşullarda aerobik culturing için tasarlanmış iken, eVOLVER de anaerobik fermantasyon için değiştirilmiş olabilir veya süspansiyon memeli hücreleri korumak için. Bu video, eVOLVER platformlarını kullanarak yüksek iş hacmi sürekli kültür deneyinin nasıl kurulacağını, baş harfe çevrileceğini ve çalıştırılabildiğini gösterecektir. Deneyden bir gün önce, el yazmasına göre medya, şişe ve inoculum hazırlayın.Üç büyük gaga,% 10 çamaşır suyu ve% 70 etanol bir beaker iki gagahazırlayın. EVOLVER cihazındaki anahtarları kullanarak, eVOLVER üzerindeki beş voltluk güç kaynağını açın, beş saniye bekleyin, sonra 12 voltluk güç kaynağını açın. Aynı ortam şişesinden birden fazla şişe çalıştırıyorsanız, birden çok ortam giriş hattını boru bölücüleriyle bağlayın.Özel boru ayırıcılar alt bileşenlerle inşa edilebilir. İlk çamaşır suyu kabındaki medya giriş çizgilerini ve ikinci çamaşır suyu kabındaki media eflux çizgilerini batırın. Medya giriş hatlarının alt uçlarını eflux hatlarıyla ikinci kabına bağlayın.Atık hatlarını atık bakıcısına yerleştirin. Deney sırasında üretilen atıksterilize etmek için atık carboy içine çamaşır suyu bir ila iki litre ekleyin. eVOLVER'deki dokunmatik ekranı kullanarak, kurulum bölümüne gidin ve sıvı hatlarını %10 çamaşır suyu yla doldurmak için tüm pompaları 20 saniye çalıştırın.Çamaşır suyunun sterilize etmek için en az 30 dakika kuyrukta oturmasını bekleyin. Hatlar artık su altında kalana kadar dokunmatik ekranı kullanarak pompaları tekrar çalıştırın, mümkün olduğunca fazla çamaşır suyu almak için çizgiler üzerinden hava iterek. Ortam giriş satırlarını etanol kabına yerleştirin, hatları etanolle doldurun, havayla yıkayın.Daha sonra, ortam giriş çizgilerini alt konektörlerle ortam şişelerine takın ve ortam artık etanol leri dışarı atayana kadar pompaları çalıştırın. Kısmen eVOLVER akıllı kollu içine sterilize şişeler eklemek ve renk kodlama göre uzun eflux strawq için kısa akını saman ve atık hatları giriş hatları kanca. EVOLVER dokunmatik ekranında tüm pompaları 10 saniyelik artışlarla çalıştırarak şişeleri ortamla doldurun.Görsel muayene ile eflux pompaların taşmaları önlemek için eflux pipetler aracılığıyla medyayı verimli bir şekilde ortadan kaldırdığından emin olun. Daha sonra, tamamen akıllı kol tarafından kaplanmış kadar aşağı şişeleri itin. eVOLVER dokunmatik ekran etkileşimli kurulum sayfasında, bir parmağınızı dokunmatik ekran boyunca sürükleyin veya tüm şişeleri seçmek ve sıcaklığın başlangıç koşullarını 30 derece ye ayarlamak ve 10 dereceye kadar karıştırın için Tümü Seç düğmesine basın.Bilgisayarda, denemenin çalıştırılacılan eVOLVER cihazını belirtin. İstediğin kalibrasyon ayarlarının seçildiğinden emin olun. eVOLVER panosunu açın ve Deney Yöneticisi sayfasına gidin.Başlangıç noktası olarak Deneme Gezgini panelindeki Temel denemeyi veya varolan bir denemeyi seçin ve Clone'u tıklatın. Deneme Düzenleyicisi sayfasına gidin. Sıcaklığı 30 santigrat dereceye ayarlamak ve deneysel tasarıma göre her şişe için bir üst ve alt OD eşiği ayarlamak için Şişe Seçici ve Parametre Tanımı panellerini kullanın.Kaydet'i tıklatarak denemeyi kaydedin. Ardından Deney Yöneticisi sayfasına geri dönmek için oku tıklatın ve çalıştırmak için Oynat düğmesini tıklatın. Deneme başlatıldıktan sonra etkileşimli panodaki Gerçek Zamanlı Veri paneline gidin.Her şişe için, OD değerlerinin sıfırda tutup tutmadığını kontrol edin. Sıcaklıkların 30 santigrat dereceye doğru olup olmadığını veya ilerlediğini kontrol etmek için sıcaklık grafiklerine göz atın. Inokül hazırlamak için, ilk gece kültürleri OD ölçmek ve 25 mililitre bir şişe hacmi ve yaklaşık 0,05 istenilen başlangıç OD varsayarak gece kültürleri için istenen tam seyreltme hesaplamak.Örnekleme portu aracılığıyla, pipet inoculum veya inocula karışımı hesaplanan hacmi. OD'nin 0,05'e yükseldiğini görmek için panodaki grafikleri kontrol edin. Deney devam ederken hücre büyümesi ve şişe koşulları gerçek zamanlı olarak izlenebilir ve herhangi bir sorun oluşursa araştırmacının müdahale etmesine olanak sağlar.eVOLVER, kültür koşullarının çoklu parametre kontrolüne olanak tanıyan otomatik bir sürekli kültür platformudur. EVOLVER büyüme hızı verilerinden enterpolasyona tabi nesillere karşı log oranları çizildiğinde yabani tip, ısıya duyarlı ve tuza duyarlı gruplar arasında nitel farklılıklar gösterilmiştir. Renk seçim sıcaklığını gösterirken tireler tuz konsantrasyonlarını ayırt eder.En az üç nokta kullanarak her çizimin doğrusal kısmına sığan bir eğim, varyant geriliminin referans zorlanmasına karşı nasıl rekabet ettiğini açıklayan nicel bir uygunluk değeri verir. Negatif fitness değerleri, varyant zorlanmasının referans zorlanmadan daha fazla olduğunu gösterir. Her zaman tüm pompalar verimli çalışıyor ve sıvı hatları herhangi bir tıkanıklık ları temiz olup olmadığını kontrol edin.Taşma bir deneyi mahvedebilir ve akıllı kollara zarar verebilir. EVOLVER'den alınan numuneler daha sonra deney sonucunda genomik değişiklikleri kontrol etmek için sıralanabilir. Bu bilgiler yeni suşlar veya sistemler tasarlamak için kullanılabilir.Laboratuvar evrimi veya kütüphane seçimini kullanan araştırmacılar için, her eVOLVER deneyinde benzersiz seçim baskıları uygulamak kolaydır. Geri bildirim kontrolü ve dinamik ortamlar artık çok erişilebilir. Atık bakıcı bir deneyden sonra az miktarda çamaşır suyu ve etanol içerecektir.Atıkların doğru şekilde bertaraf edilmesi için laboratuvar güvenlik koordinatörünüze danışın.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Sıcaklık duyarlı Öldürücü Mutants Yüksek Verim robotik Destekli İzolasyonu içinde<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Yüksek yağlı diyet beslenme ve yüksek işlem hacmi Triacylglyceride tahlil Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Sinerjik uyuşturucu kombinasyonları örtüşme2 yöntemi tarafından yüksek üretilen iş tanımlaması

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...