Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

وقد حظي هذا العمل بدعم من مجلس البحوث الأوروبي ، وهو المشروع 677313 الذي منحته المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO, 723.016.003) ، والممول من وزاره التعليم والثقافة والعلوم (الجاذبية برامج, 024.001.035 & 024.003.013), برنامج العلوم الحدود البشرية منحه RGP0032/2015, المجلس الأوروبي للبحوث في اطار الاتحاد الأوروبي الأفق 2020 برنامج البحوث والابتكار منحه 723106, ومنحه مؤسسه العلوم الوطنية السويسرية 200021_182019.

ويعلن صاحبا البلاغ انهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

وقد تم تقديم جهاز ميكروفلويدريك متعدد الطبقات يستند إلى PDMS ، وقد تم إثبات قدرته علي الحفاظ علي ردود فعل IVTT لفترات طويلة من الزمن. وعلي الرغم من ان هذه التكنولوجيا مناسبه تماما لهذا المثال المحدد ، فانه يمكن تصور استخدامها في العديد من التطبيقات الأخرى. السيطرة اضافيه علي تدفق السوائل-يقترن مع القدرة علي تجديد باستمرار الكواشف رد الفعل في حين أزاله (by) المنتجات-مثاليه لردود الفعل التوليف المستمر ، والتحقيق في مختلف السلوكيات الحيوية ، وفي وقت واحد التوصيل من الاختلافات متعددة من رد فعل واحد.
وعلي الرغم من عمليه التصنيع المباشرة نسبيا للاجهزه القائمة علي PDMS ، فان استخدامها يتطلب اعدادا واسعا من الاجهزه. وتشمل صفائف الصمامات ، ومنظمو الضغط ، ومضخات الضغط ، والحاضنات ، ووحدات التبريد ، والانتقال من التصنيع إلى الاستخدام ليس ابتدائيا ، ويتطلب استثمارا أوليا كبيرا. الاضافه إلى ذلك ، فان القدرة علي أقامه وتنفيذ تجارب ناجحه باستمرار مع هذه الاجهزه تتطلب استثمارا كبيرا في الوقت ؛ نقطه التي تهدف هذه المخطوطة إلى معالجتها. ومع ذلك ، مره واحده في المكان ، يمكن تعديل الاعداد بأكمله لمجموعه من الأغراض. وعلاوة علي ذلك ، فان اعداد الاجهزه يضم العديد من العناصر النمطية ، ويمكن توسيع كل منها للسماح باستخدام تصاميم الاجهزه الصغيرة الأكثر تعقيدا. الاضافه إلى ذلك ، فان التصميم المعياري يتيح استبدال مكونات الاجهزه ببدائل تعمل بشكل مماثل ، بحيث لا يقتصر المستخدمون علي الاعداد المحدد الموصوف هنا48،49.
يمكن ان يؤدي التباين بين الاجهزه الفردية ، وفي الظروف الخارجية (مثل تقلبات الضغط) إلى عدم الدقة عند اجراء التجارب باستخدام هذه الاجهزه. لمعالجه هذه المشكلة ، يجب اجراء معايره النظام قبل كل تجربه ، وتوفير نسبه تحديث فريدة لكل من المفاعلات. بينما تعالج المعايرة الاختلافات بين الجهاز والتجربة ، فهي عمليه تستغرق وقتا طويلا ولا تشوبها شائبه. لن تتدفق السوائل مع الفضول المختلفة مع نفس المعدل عند التعرض للضغط متطابقة ، وعلي هذا النحو أداء المعايرة مع الكواشف متعددة قد لا تسفر عن معدلات تحديثمتطابقة. ويخفف هذا التاثير من خلال الاستفادة من ثلاث قنوات التحكم بيريستالتيكالي ضخ الكواشف في الجهاز ميكروفلويديك ، بدلا من تنظيم التدفق عن طريق متفاوتة الضغط المقدمة فقط. كملاذ أخير في الحالات التي يكون فيها التفاوت في اللزوجة كبيرا جدا ، يمكن تطبيق نسبه التحديث الفريدة لكل كاشف فردي عن طريق اجراء تجارب معايره متعددة.
ان استخدام المضخة التمعجيه لحقن الكواشف في جهاز ميكروفلويدريك يخفف من اثار استخدام المحاليل مع الفضول المتفاوت ، ولكنه يخلق أيضا مشكله ثانويه. باستخدام خطوات منفصلة لضخ السوائل في الجهاز ميكروفلويديك ، يعني ان حل الحقن في مفاعل واحد ، محدوده بحجم حقن عند أداء دوره مضخة واحده. ضمن بحثنا هذه القيمة-تحديد خلال المعايرة-يساوي تقريبا 1 ٪ ، مشيرا إلى ان دوره مضخة واحده التفكك تقريبا 1 ٪ من حجم المفاعل (حوالي 0.1 nL). علي هذا النحو ، وتشريد 30 ٪ من حجم المفاعل يتطلب تنفيذ 30 دورات مضخة ، مع 23 دورات مضخة من الحل رد فعل ivtt المضافة ، وفقط 7 دورات مضخة من الحمض النووي أو المياه نقاء المضافة. وعلي الرغم من ان البروتوكولات التجريبية البديلة كافيه لبحثنا ، فقد تواجه مشاكل عند محاولة أضافه اعداد أكبر من الكواشف الفريدة ، أو استخدام جزءاقل من التحديث ، أو أضافه كميات أصغر من كاشف واحد إلى مفاعل. في مثل هذه الحالات ، يمكن تكييف تصميم جهاز ميكروفلويدريك لتوفير المفاعلات مع حجم أكبر. ويرد مثال علي ذلك في نيدرهولتماير وآخرون36.
وبشكل حاسم ، فان الجهاز المبين في هذه المخطوطة يسمح باستمرار ردود الفعل لفترات طويلة مما يؤدي إلى معدلات النسخ والترجمة الثابتة للدولة. عن طريق حقن الكواشف الجديدة بشكل دوري في المفاعلات-وأزاله ردود الفعل (من قبل) المنتجات-ردود الفعل المستدامة ويمكن رصد السلوكيات الديناميكية المعقدة. وبهذه الطريقة ، تم إنشاء منصة ان-إلى حد ما-يقلد البيئة الخلوية. وعلاوة علي ذلك ، تمكن هذه المنصة استكشاف ديناميات النظام ، من خلال تكييف الفترة بين الحقن وتكوين محدد من الحقن. ونتيجة لذلك ، فان هذه الاجهزه المجهرية متعددة الطبقات هي أداه قويه لتوصيف وتحسين الشبكات الاصطناعية الجديدة التي تعرض السلوك الديناميكي المعقد.

الخلايا قادره علي الشعور والاستجابة لبيئتهم باستخدام الشبكات التنظيمية الديناميكية المعقدة1,2. ويستخدم مجال البيولوجيا التركيبية معرفتنا بالمكونات الطبيعية التي تتالف منها هذه الشبكات لهندسه النظم البيولوجية التي يمكن ان توسع وظائف الخلايا3،4. وعلي العكس من ذلك ، فمن الممكن أيضا لتعزيز فهمنا للشبكات الطبيعية التي تحكم الحياة عن طريق تصميم نظائرها الاصطناعية مبسطه من الدوائر الموجودة أو عن طريق الهندسة الاماميه النظم البيولوجية التي تظهر السلوكيات التي تحدث بشكل طبيعي. ويتم القيام بالهندسة الهندسية لهذه النظم البيولوجية من أسفل إلى اعلي حيث يتم تصميم الدوائر الوراثية الجديدة أو مسارات الإشارات بطريقه عقلانيه ، وذلك باستخدام الأجزاء المحددة جيدا5و6. والجمع بين التصميم العقلاني للشبكات وتصميم النظم ذات الصلة بيولوجيا يمكن من التوصيف المتعمق للنظم التنظيمية البيولوجية ودراستها بمستويات مختلفه من التجريد7.
وكانت الاعمال الرائدة في Elowitz و Leibler8 و غاردنر وآخرون9 أول من يبرهن علي الإدخال الناجح للشبكات الوراثية التركيبية في المضيفين الخلويين. وفي العقد التالي ، واصل العديد من الباحثين البناء علي هذه النجاحات الاوليه علي الرغم من ظهور العديد من القيود المتعلقة بإدخال الدوائر الاصطناعية في الزنزانات7و10و11 ،12. ومن الناحية المثالية ، ينبغي ان يحدث إدخال الدوائر الاصطناعية في المضيفين الخلوية في الأزياء وحدات. للأسف ، فان تعقيد البيئة الخلوية يجعل هذا صعبا بشكل خاص ، مع وظيفة العديد من الأجزاء والشبكات التي تعتمد علي السياق العالي12،13،14. ونتيجة لذلك ، غالبا ما تواجه الشبكات تفاعلات غير مرغوب فيها مع إدخال مكونات المضيف الاصليه التي يمكن ان تؤثر علي وظيفة الدائرة الاصطناعية. المثل ، فان مكونات الشبكة الخارجية يمكن ان تمنع العمليات المضيفة ، وتتنافس علي الموارد المشتركة داخل المضيف ، وتؤثر علي حركيه النمو15،16،17. التالي ، من أجل التصميم العقلاني والتنبؤ بسلوك الشبكات التركيبية في بيئة الجسم الحيوي ، يتطلب نموذج شامل لجميع الديناميكيات الخاصة بالمضيف والدائرة18.
ومن البدائل القابلة للاستمرار لاستخدام المضيفين الخلويين لتوصيف الشبكات التركيبية تطبيق تكنولوجيات النسخ والترجمة في المختبرات (IVTT). تعمل كاختبار للشبكات الاصطناعية ، ويتم تنفيذ ردود الفعل في الحلول التي تشمل جميع المكونات المطلوبة لتمكين التعبير الجيني19،20،21. وبهذه الطريقة ، يتم إنشاء بيئة ذات صله بيولوجيا ، وان كانت مصطنعه ، يمكن من خلالها اختبار الشبكات التركيبية22،23،24،25،26، 27و28. والميزة الرئيسية لاستخدام حلول IVTT هي القدرة علي أداء ردود الفعل في ظل ظروف محدده من قبل المستخدم ، معالباحثين قادرينعلي ضبط التركيب الدقيق لكل رد فعل 2. وعلاوة علي ذلك ، يتيح النهج الخالي من الخلايا اجراء اختبارات عاليه الانتاجيه للشبكات التركيبية ، لأنه يزيل الحاجة إلى تنفيذ خطوات لاستنساخ الخلايا تستغرق وقتا طويلا. ونتيجة لذلك ، فان مده الدورات المتعاقبة للتصميم والبناء والاختبار تنخفض بشكل كبير29,30,31,32. ويمكن تسريع دوره التصميم باستخدام تقنيات الاستنساخ الخالية من الخلايا مثل جمعيه جيبسون لاجراء هندسه سريعة للشبكات الجديدة ، وعن طريق بناء الشبكات من قوالب الحمض النووي الخطية التي-علي عكس البلازميدات المطلوبة في اختبار الجسم المجري- يمكن تضخيمها عبر تفاعلات البلمره المتسلسلة (PCR)33،34.
ردود الفعل دفعه هي ابسط طريقه التي يمكن ان تؤديها ردود فعل IVTT ، والتي تتطلب سفينة رد فعل واحد حيث يتم الجمع بين جميع مكونات التفاعل35. ردود الفعل هذه كافيه للتعبير عن البروتين واختبار الدوائر الاساسيه حتى الآن تثبت غير كافيه عند محاولة دراسة السلوك الديناميكي طويل الأجل للشبكة. علي مدي رد فعل الدفعات ، والمواد الكاشفة اما المنضب أو الخضوع للتدهور مما ادي إلى انخفاض مستمر في معدلات النسخ والترجمة. وعلاوة علي ذلك ، ونتيجة لردود الفعل التقدم المنتجات تتراكم التي يمكن ان تتداخل مع-أو تمنع تماما-الأداء الصحيح للشبكة. وفي نهاية المطاف ، فان استخدام المفاعلات الدفعيه يحد من السلوك الدينامي الذي يمكن ملاحظته ، مع التنظيم السلبي الذي يشكل تحديا خاصا لتنفيذ5،36.
براعة من أنظمه ivtt تمكن من الطرق البديلة المتعددة التي يمكن ان يؤديها ردود فعل ivtt لفترات طويلة ، بدءا من التدفق المستمر إلى الطرق القائمة علي القطيرات ، فضلا عن نهج غسيل الكلي ابسط2،30، 37،38،39،40. تطبيق الاجهزه ميكروفلويديك يوفر للمستخدمين زيادة السيطرة علي ردود فعلهم في حين زيادة الانتاجيه وتقليل التكاليف35،41،42، مع كل نهج محدد وجود لها المزايا الخاصة. استخدام التدفق المستمر يمكن بسهوله الأمثل لزيادة غله التعبير ومع ذلك ، فان عدم القدرة علي أزاله المنتجات رد فعل محدده بشكل فعال يجعل دراسة السلوك الديناميكي غير تافه39. وفي حين ان استخدام النظم الصغرى القائمة علي القطيرات يسمح بفحص عالي الانتاجيه للشبكات الجديدة ، فان صعوبة تزويد الكواشف الجديدة بنتائج التفاعل في القطرات التي تشبه ردود فعل الدفعات الصغيرة الحجم43. المفاعلات القائمة علي غسيل الكلي تسمح بإدخال الكواشف الطازجة ، فضلا عن أزاله بعض منتجات رد الفعل ومع ذلك ، تتراكم جزيئات RNA والبروتينات الكبيرة داخل المفاعل ، كونها كبيره جدا لنشرها من خلال المسام الغشاء. وعلاوة علي ذلك ، مطلوب كميات كبيره من الكواشف للحفاظ علي ردود الفعل هذه لفترات طويلة30،44. في 2013, مايركل et al. قدم جهاز ميكروفلويدريك متعدد الطبقات المصممة خصيصا لاجراء ردود فعلivtt لفتراتطويلة 36,45. استخدام الاجهزه ميكروفلويديك متعددة الطبقات يسمح السيطرة المباشرة علي تدفق السوائل ، مما يسمح لأعاده توجيه التدفق ، فضلا عن عزل السوائل في مناطق محدده من الجهاز46،47. ويمكن لهذه المناطق المعزولة ان تعمل كغرف رد فعل مستقله علي نطاق نانوليتر حيث يمكن تنفيذ ردود فعل IVTT. علي مدي رد فعل IVTT واحد ، وتستخدم الحقن الدورية من الكواشف الطازجة في المفاعل لتجديد مكونات IVTT وقوالب الحمض النووي. وفي الوقت نفسه ، فان حجما متساويا من محلول رد الفعل القديم هو النازحين ، وأزاله منتجات التفاعل. وبهذه الطريقة ، يتم الحفاظ علي بيئة خارج التوازن حيث تبقي معدلات النسخ القاعدي والترجمة في حاله ثابته ، وأطاله عمر تفاعلات IVTT والسماح بحدوث سلوكيات ديناميكية غنيه. من خلال تطبيق هذا النهج ، والباحثون قادرون علي التحقيق في معدلات الحركية من العمليات الفردية التي تحدث داخل دائره معينه ، والمساعدة في الهندسة الاماميه للشبكات الوراثية الجديدة. فعلي سبيل المثال ، قامت نيدرهولتماير وآخرون بتنفيذ هذا النهج لتوصيف مختلف عناصر مذبذب الحلقة الجينية ، وتحديد معدلات الحركية منها36. وفي دراسات أخرى ، أظهرت الشركة ان المعدلات الحركية لعامل سيغما 28 (σ28) المحددة في ظروف الدفعات غير كافيه لوصف سلوك المذبذب المستند إلى28σ ، وان أضافه البيانات المستندة إلى التدفق تحسين التنبؤات نموذج من سلوك الشبكة22.
الهدف من هذه المخطوطة هو تقديم بروتوكول كامل لتصنيع الاجهزه الصغيرة متعددة الطبقات القادرة علي أداء ردود فعل IVTT طويلة الأجل. الاضافه إلى ذلك ، فان هذه المخطوطة تصف جميع الاجهزه والبرمجيات اللازمة لتنفيذ ردود الفعل الطويلة IVTT. يتم تحقيق الجهاز ميكروفلويديك-اللازمة للسيطرة علي تدفق السوائل في ذلك-باستخدام سلسله من الصمامات الهوائية التي تتصل مباشره إلى الاجهزه ميكروفلويديك عبر أطوال الأنابيب. في المقابل ، يتم التحكم في الصمامات الهوائية عبر واجهه تحكم افتراضيه مبنيه خصيصا. يتم تحقيق تدفق السوائل داخل الاجهزه ميكروفلويدريك باستخدام الضغط المستمر الذي يوفره نظام تنظيم الضغط المتاحة تجاريا. وعاده ما يتم اجراء التفاعلات IVTT بين 29 درجه مئوية و 37 درجه مئوية ويتم استخدام حاضنه المجهر لتنظيم درجه الحرارة اثناء ردود الفعل. ومع ذلك ، فان وظيفة خليط IVTT تتحلل تدريجيا عند تخزينها فوق 4 درجه مئوية. وعلي هذا النحو ، ستتوسع هذه المخطوطة علي نظام التبريد الذي يتم استخدامه لتهدئه الخليط من الرقاقة قبل الحقن في الجهاز الميكروفلوريك. وفي الختام ، تقدم هذه المخطوطة لمحه شامله عن الإجراءات المطلوبة للنجاح في تنفيذ ردود الفعل المطولة لل IVTT باستخدام مفاعل تدفق ميكروفلويديك ، بحيث يتمكن الباحثون الآخرون من تكرار هذه التكنولوجيا مع النسبية سهوله.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

وأصبحت القيود المفروضة علي البيولوجيا التركيبية القائمة علي الخلايا واضحة بشكل متزايد ، حيث يهدف الباحثون إلى تطوير دوائر تنظيميه جينيه تركيبيه أكبر وأكثر تعقيدا. وتحليل الشبكات التنظيمية الجينية التركيبية في الجسم الحي يستغرق وقتا طويلا ويعاني من نقص السيطرة البيئية ، مع تفاعل المكونات الاصطناعية الخارجية مع العمليات المضيفة مما يؤدي إلى سلوك غير مرغوب فيه. وللتغلب علي هذه القضايا ، أصبح توصيف الدوائر الجديدة الخالي من الخلايا أكثر انتشارا. في المختبر النسخ والترجمة (IVTT) مخاليط تسمح لتنظيم البيئة التجريبية ويمكن ان تكون الأمثل لكل نظام فريد من نوعه. البروتوكولات المعروضة هنا بالتفصيل تصنيع جهاز ميكروفلويدريك متعدد الطبقات التي يمكن استخدامها للحفاظ علي ردود الفعل IVTT لمدد طويلة. وعلي النقيض من ردود فعل الدفعات ، حيث تستنفد الموارد علي مر الزمن ، وتتراكم المنتجات (بواسطة) ، فان استخدام الاجهزه الصغريه يسمح بتجديد الموارد فضلا عن أزاله منتجات التفاعل. وبهذه الطريقة ، تحاكي البيئة الخلوية بالحفاظ علي بيئة خارجه عن التوازن يمكن فيها التحقيق في السلوك الدينامي للدوائر الجينية علي مدي فترات طويلة من الزمن. لاستغلال كامل الجهاز ميكروفلويديك متعدد الطبقات ، وقد تم دمج الاجهزه والبرمجيات لاتمته ردود الفعل ivtt. من خلال الجمع بين ردود الفعل ivtt مع منصة ميكروفلويديك المعروضة هنا, يصبح من الممكن لتحليل شامل السلوكيات الشبكة المعقدة, تعزيز فهمنا للأليات التي تنظم العمليات الخلوية.

Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

يتم وصف عمليه تصنيع الجهاز القائم علي pdms ، متعدد الطبقات ، ميكروفلويديك الذي يسمح في النسخ الأنبوبي والترجمة (ivtt) ردود الفعل علي القيام به علي مدي فترات طويلة. وعلاوة علي ذلك ، يتم توفير نظره عامه شامله عن الاجهزه والبرمجيات اللازمة لاتمته والحفاظ علي ردود الفعل هذه لمدد طويلة.

منصة ميكروفلويدريك متعددة الطبقات لتوصيل التعبير الجيني الخالي من الخلايا لفترات طويلة

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

تحسين الشبكات الجينية التركيبية إلى حد كبير باستخدام نظم التعبير الجيني خالية من الخلايا. يصف بروتوكولنا عملية تصنيع مفاعل التدفق الدقيق متعدد الطبقات ويظهر أنه يمكن استخدام مثل هذا الجهاز للتعبير الخالي من الخلايا لفترة طويلة من GFP. إن تعبيرات البروتين الخالية من الخلايا بالاقتران مع مفاعلات التدفق الدقيق الفلورية توفر منصة طلائعية سريعة لتصميم الأجهزة البيولوجية الاصطناعية.هذا الإعداد بأكمله هو تنوعا للغاية ويمكن تكييفها لايقاط أي التفاعلات الكيميائية أو الكيميائية الحيوية التي تتطلب مستويات عالية من السيطرة. إن ضمان استقرار حل التفاعل الخالي من الخلايا أمر بالغ الأهمية ويصعب تحقيقه. تأكد من التركيز على توفير التبريد الكافي والاستفادة من الأنابيب المحددة في هذا البروتوكول.يتطلب تصنيع وإعداد المنصة التجريبية اتصال العديد من المكونات الفردية ، وهي عملية يمكن أن يكون من الصعب متابعتها بدون أدوات بصرية. للبدء، اتبع على طول في بروتوكول النص المصاحب لتصنيع الجهاز microfluidic وإعداد التحكم بالهواء المضغوط وتنظيم ضغط التدفق التي سيتم استخدامها للسيطرة على الصمامات الحاسمة لهذا الجهاز. لإعداد التبريد خارج رقاقة، تبدأ عن طريق اللف طول أنابيب PTFE على الوجه البارد لعنصر بلتيير وتأمين لفائف مع الشريط.تأكد من أن أحد طرفي أنابيب PTFE متصل بخزانات نظام التحكم في ضغط طبقة التدفق وأن الطرف الآخر لا يبرز أكثر من سنتيمتر واحد من سطح بلتيير. بعد ذلك إدراج طول 5-10 سم من أنابيب PEEK في نهاية جاحظ من أنابيب PTFE. تطبيق كمية كافية من المجمع الحراري على الوجه الساخن لعنصر بلتيير ووضعها على لوحة باردة من كتلة المياه.تأكد من أن الأنابيب، عنصر بلتيير، وكتلة التبريد على اتصال مباشر مع بعضها البعض في جميع الأوقات. بعد ذلك ربط عنصر بلتيير إلى وحدة تحكم درجة الحرارة باستخدام موصل حافلة تسلسلي بحيث يمكن تنظيم الجهد المقدمة إلى بلتيير. ثم، وضع بشكل آمن ثيرمستور على سطح بلتيير وربط إخراجها إلى وحدة تحكم درجة الحرارة.بعد تشغيل برودة المياه، والتكيف مع الجهد الموردة إلى بلتيير حتى تكون درجة الحرارة مستقرة عند أربع درجات مئوية. لكل قناة تحكم الجهاز microfluidic قطع طول أنابيب القياسية التي هي متر واحد طويل. في نهاية واحدة، إدراج دبوس من 23 مقياس، واحد كعب لور نصف بوصة وفي الطرف الآخر إدراج الصلب المقاوم للصدأ ربط دبوس.قم بتوصيل كعب Luer بموصل نايلون شائك بطول 3/32 بوصة وأدخل بارب الموصل في طول أنابيب البولي يوريثين. ثم أدخل هذا الأنبوب البولي يوريثين مباشرة في واحد من الصمامات اللولبية. المقبل إرفاق قياس 23 نصف بوصة كعب لور إلى حقنة وإدراج هذا في قطعة طولها ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات من أنابيب القياسية.وضع الطرف المفتوح من هذا الأنابيب في خزان من المياه النقية جدا وملء حقنة مع المياه النقية جدا. ترقيم كل قناة تحكم للجهاز microfluidic كما هو موضح هنا. بالنسبة للقنوات من أربعة إلى 29، ابحث عن الأنابيب المقابلة وأدخل الدبوس المعدني في الطرف المفتوح من الأنابيب المرفقة بالمحاقن.ثم حقن المياه في أنابيب قناة التحكم حتى نصف طول تم شغلها. المقبل، قطع أنابيب من الحقنة وإدراج دبوس موصل الفولاذ المقاوم للصدأ في ثقب المقابلة للجهاز microfluidic. كرر هذه الخطوة لكافة قنوات التحكم.الآن، استخدم واجهة التحكم لفتح جميع الصمامات اللولبية. وهذا سوف يضغط على السائل داخل قناة التحكم الأنابيب مما اضطره إلى الجهاز microfluidic وإغلاق جميع الصمامات القائمة على الغشاء داخل الجهاز. لكل من الكواشف غير المكرونة قطع طول متر من أنابيب القياسية لربط منفذ الخزان إلى مداخل الجهاز microfluidic.اتخاذ أحد طرفي الأنابيب وإدراج هذا في الخزان ضمان أن أنابيب تصل إلى قاعدة الخزان. وينبغي تشديد منفذ أنابيب الخزان بحيث يتحقق ختم محكم. ثم، إدراج دبوس اتصال غير القابل للصدأ في نهاية مفتوحة من الأنابيب.المقبل، إرفاق 23 قياس نصف بوصة كعب لور إلى نهاية حقنة ملليلتر واحد. إضافة طول قصير من أنابيب القياسية إلى كعب الروتين Luer. وضع نهاية الأنابيب في الحل الكاشف المطلوب وملء حقنة مع الكاشف.ثم أدخل دبوس موصل الفولاذ المقاوم للصدأ في أنابيب البولي يوريثين المتصلة بالمحاقن وملء الأنابيب مع الكاشف. وعند استخدام أحجام رد فعل صغيرة، فإن الكاشف لن يدخل الخزان، وسيكون الأنبوب نفسه بمثابة الخزان. عند الانتهاء، قم بفصل الحقنة وأدخل دبوس الموصل في إحدى فتحات مدخل طبقة التدفق في الجهاز microfluidic.ثم تطبيق الضغط على كل من الخزانات باستخدام برنامج منظم الضغط لإجبار الكواشف في الجهاز microfluidic. تأكد من أن برودة المياه وعناصر بلتيير قد تم تشغيلها مع درجة حرارة سطح مجموعة بلتيير إلى أربع درجات مئوية. قم بتركيب إعداد التبريد على مقربة من الجهاز microfluidic قدر الإمكان لتقليل حجم الصوت غير المُبَدَّد بين بلتيير ومدخل الجهاز.ثم توصيل واحد حقنة ملليلتر واحد إلى 23 قياس نصف بوصة كعب لور مع طول قصير من الأنابيب القياسية تعلق على نهاية. رسم في أن يبرد الكاشف لملء الحقنة. المقبل ربط الأنابيب PEEK إلى حقنة عبر أنابيب الضامة وتطبيق الضغط المستمر على حقنة مما اضطر الكاشف من خلال أنابيب PEEK وإلى أنابيب PTFE.وأخيراً قطع الأنبوب PEEK من الحقنة وأدخلها مباشرة إلى مدخل قناة التدفق للجهاز microfluidic. عندما يتم تطبيق الضغط، سيتم فرض الكاشف المبرد في الجهاز microfluidic. ضمان جهاز microfluidic آمنة على مرحلة المجهر مع كل التحكم وتدفق أنابيب طبقة المرفقة وإغلاق أي فتحات على الحاضنة.تعيين المقبل درجة الحرارة المحيطة من الحاضنة إلى 29 درجة مئوية. ثم تأكد من أن نظام التبريد قد تم تشغيله ويتم تعيينه إلى أربع درجات مئوية قبل بدء التجربة. تحقق من أن الضغوط المطبقة على منظم ضغط قناة التدفق تم تعيينها إلى 800 ملليبار وباستخدام البرنامج، قم بتعيين ضغط الإخراج لكل قناة تدفق فردية إلى ما بين 20 و 100 ملليبار.تحقق من أن الضغوط المطبقة على صمامات اللولبية قناة التحكم هي شريط واحد للقنوات من خلال 8 و 3 بار للقنوات من 9 إلى 29. بعد ذلك، أغلق منفذ الجهاز عن طريق الضغط على القناة 29 وفي نفس الوقت قم بتحجيم قنوات التحكم من خلال ثلاثة و15 إلى 28. ثم depressurize بشكل انتقائي قنوات التحكم في multixer للسماح لمثبط واحد مختارة للتدفق إلى الجهاز.استخدام المجهر لمراقبة إزالة الهواء والتأكد من أن جميع الكواشف تتدفق بشكل صحيح دون إدخال فقاعات الهواء. باستخدام حزمة البرامج المقدمة، قم بإعداد حقول البيانات المتعلقة بعملية المعايرة كما هو موضح في بروتوكول النص المرفق. تحديد حجم السائل بعد ذلك من كل مفاعل خلال خطوة تدفق واحدة من خلال تنفيذ بروتوكول المعايرة.اتبع الخطوات التي يقدمها برنامج التحكم لإكمال تحليل تجربة المعايرة وتحديد نسبة التحديث لكل مفاعل حلقي في الجهاز microfluidic. وأخيراً، قم بتعيين القيم المطلوبة للتجربة المطلوبة ضمن واجهة التحكم الظاهرية. قم ببدء تشغيل البروتوكول التجريبي عن طريق الضغط على زر إجراء التجربة في واجهة التحكم.خلال تجربة المعايرة تمتلئ المفاعلات بفلوروفور الذي يتم تسجيل شدته بعد كل تخفيف. ويكشف الانخفاض في كثافة الفلوريسين لكل تخفيف عن حجم حلقة المفاعل التي تم إزاحتها للعدد المحدد من خطوات التدفق. ويُـبَيَّن أن وحدة التخزين هذه هي نسبة التحديث.يتم عرض متوسط نسبة التحديث والانحراف المعياري لكل خطوة تخفيف باللون الأحمر. سبعة من ثمانية مفاعلات تظهر سلوك مماثل جدا، ولكن مفاعل واحد يظهر تقلبات بعد دورة التخفيف السابعة. وهذا يبرز الحاجة إلى نسب تحديث فريدة لكل مفاعل من المفاعلات.وكان النص المطول في المختبر ورد فعل الترجمة المعروضة هنا 30٪ من حجم المفاعل تشريد كل 14.6 دقيقة. مفاعلين من الجهاز microfluidic حيث تستخدم كفراغات. جميع المفاعلات الأخرى تتألف 75 ٪ في النسخ في المختبر وترجمة رد فعل الحل و 25 ٪ إما من المياه النقية جدا أو 2.5 نانوموللار قوالب الحمض النووي الخطي الترميز للتعبير عن بروتين deGFP.في جميع المفاعلات الأربعة التي أضيفت فيها الحمض النووي، كان هناك تعبير واضح عن deGFP. أحد المفاعلات يعرض إشارة فلورانس أقل. وقد يكون السبب في ذلك هو التفاوت في التدفق الذي يؤدي إلى انخفاض الحمض النووي الذي يدخل المفاعل أو بسبب الاختلافات في أبعاد المفاعل.بعد 14 ساعة، وشوهدت زيادة مفاجئة في إشارة المفاعلات التي تحتوي على الحمض النووي. يحدث هذا بسبب فقاعة الهواء التي تدخل طبقة تدفق الجهاز microfluidic. عند استئناف التدفق، تعود التجربة إلى كثافتها الفلورية السابقة.حلول التفاعل خالية من الخلايا عرضة للتدهور مع مرور الوقت ما لم يتم تبريدها بما فيه الكفاية، وجعل عملية التبريد الموصوفة في هذا البروتوكول ذات أهمية حاسمة. نظرا لتعدد استخدام المنصة، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من التفاعلات الكيميائية الحيوية والكيميائية بطريقة دقيقة وخاضعة للرقابة. وقد أدى تطبيق مفاعلات التدفق الدقيق إلى تسريع دورات اختبار بناء التصميم المتعاقبة للدوائر الجينية المزدوجة الناشئة عن الممارسات الناشئة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

منصة ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس العدلات من الدم غير المجهزة الجامعة

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

رقاقة متعدد الجهاز - A منصة ميكروفلويديك لفترة طويلة Coculture متعدد الأنسجة

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

متعدد خطوة الطباعة التصويرية متغير الطول لمحكم بصمام متعدد الأجهزة ميكروفلويديك

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

منصة ميكروفلويديك مع تعدد كشف الالكترونية لتتبع المكانية من الجسيمات

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Performance-testing Platform for a Conduction Micropump with an FR-4 Copper-clad Electrode Plate

أداء اختبار منهاج ميكروبومب توصيل مع صفيحة قطب يرتدون النحاس FR-4

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

التصوير مورفولوجيا الجذر الشعر شتلات نبات في منصة موائع جزيئية طبقتين

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

منصة موائع جزيئية "التصوير الطولي" في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

الخلية الحرة "استخدام تعبير البروتين" "سرعة نمو بكتيريا" الضمة ناتريجينس

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...