Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

这项工作得到了欧洲研究理事会、ERC（BioCircuit项目）的支持，这是荷兰科学研究组织提供的NWO-VIDI赠款（NWO，723.016.003），来自教育、文化和科学部的资助（Gravity计划， 024.001.035 和 024.003.013）， 人类前沿科学计划资助 RGP0032/2015， 欧盟 Horizon 2020 研究和创新计划下的欧洲研究理事会 资助 723106， 以及瑞士国家科学基金会赠款200021_182019.

提交人宣称，他们没有相互竞争的经济利益。

介绍了一种基于PDMS的多层微流体装置，并证明了其长期维持IVTT反应的能力。尽管该技术非常适合此特定示例，但可以想象，该技术可用于许多其他应用。对流体流动的额外控制 - 与持续补充反应试剂，同时去除（按）产品的能力 - 是连续合成反应、调查各种动态行为和同时单一反应的多种变异的传导。
尽管基于 PDMS 的设备的制造过程相对简单，但使用它需要大量的硬件设置。包括阀门阵列、压力调节器、压力泵、孵化器和冷却单元，从制造到使用的过渡不是基本阶段，需要大量的初始投资。此外，能否持续设置和成功使用这些器件进行实验，需要大量的时间投入;本手稿旨在解决的一点。但是，一旦就位，整个设置可以修改为一系列的目的。此外，硬件设置包括许多模块化元件，每个模块都可以扩展，以便采用更复杂的微流体器件设计。此外，模块化设计允许通过功能类似的替代方案替换硬件组件，这样用户不仅限于此处描述的特定设置48，49。
单个设备之间以及外部条件（如压力波动）中的可变性可能导致使用这些设备执行实验时不准确。为了解决这个问题，应在每次实验之前对系统进行校准，为每个反应器提供唯一的刷新率。虽然校准解决了设备到设备以及实验到实验的变化，但它是一个耗时的过程，并非完美无缺。当暴露于相同的压力时，粘度不同的流体不会以相同的速率流动，因此使用多个试剂进行校准可能不会产生相同的刷新率。通过使用三个控制通道将试剂蠕动泵入微流体装置，而不是仅通过改变提供的压力来调节流量，可以减轻这种效应。在粘度差异非常大的情况下，作为最后手段，可以通过执行多个校准实验，为每个试剂实现独特的刷新率。
使用蠕动泵将试剂注入微流体装置，会削弱使用粘度不同的溶液的影响，但它也造成了次要问题。使用离散步骤将流体泵入微流体装置，意味着注入到单个反应器的分辨率受执行单个泵循环时注入的体积的限制。在我们的研究中，这个值（在校准期间确定）大约等于1%，表明单个泵循环会取代大约1%的反应堆体积（约0.1 nL）。因此，取代30%的反应堆体积需要执行30个泵循环，23个泵周期的IVTT反应溶液被添加，只有7个泵周期的DNA或超纯水被添加。虽然我们的研究已经足够了，但当尝试添加大量独特的试剂、使用较低的刷新分数或向反应器中添加更小的单个试剂体积时，其他实验协议可能会遇到问题。在这种情况下，微流体装置设计可以调整，以提供更大的体积反应器。尼德霍尔特迈尔等人36日报道了这一例子。
至关重要的是，本手稿中概述的装置允许反应持续很长时间，从而产生稳态转录和翻译率。通过定期将新试剂注入反应器，并去除反应（按产品），反应是持续的，可以监测复杂的动态行为。通过这种方式，创建了一个平台，在一定程度上模仿了蜂窝环境。此外，该平台通过调整注射之间的周期和喷射的具体组成，能够探索系统动力学。因此，这些多层微流体器件是显示复杂动态行为的新型合成网络的特征和优化的有力工具。

细胞能够使用复杂的动态调节网络1，2来感知和响应其环境。合成生物学领域利用我们对包括这些网络的自然存在的成分的知识来设计生物系统，这些生物系统可以扩展细胞3，4的功能。相反，通过设计现有电路的简化合成类似物，或者通过具有自然发生行为的前瞻性工程生物系统，还可以进一步理解管理生命的自然网络。这种生物系统的解构工程以自下而上的方式进行，其中新的基因电路或信号通路以合理的方式设计，使用定义明确的部分5，6。将网络的合理设计与生物相关系统的设计相结合，可以对具有不同抽象层次的生物调控系统进行深入的表征和研究。
Elowitz和Leibler8和Gardner等人9的开创性工作首次证明了合成基因网络在细胞宿主中的成功引入。在接下来的十年里，尽管在细胞7、10、11中引入合成电路方面出现了一些限制，但许多研究人员仍然继续在这些初步成功的基础上再接再厉。 ， 12.理想情况下，将合成电路引入蜂窝主机应采用模块化方式。不幸的是，蜂窝环境的复杂性使得这一点特别具有挑战性，许多部分和网络的功能高度依赖于上下文12，13，14。因此，网络经常遇到与本机主机组件的不需要的交互，这可能会影响合成电路的功能。同样，外源网络的组件可以抑制主机进程，在主机内争夺共享资源，并影响增长动力学 15、16、17 。因此，为了合理设计和预测合成网络在体环境中的行为，需要一个综合模型，所有主机和电路特定的动力学。
使用蜂窝主机对合成网络进行表征的一种可行的替代方法是应用体外转录和翻译 （IVTT） 技术。作为合成网络的试验台，反应在包含实现基因表达19、20、21所需的所有成分的溶液中进行。以这种方式，一个生物相关，虽然是人工的环境，其中合成网络可以测试22，23，24，25，26， 27，28.使用IVTT解决方案的一个主要优点是在用户指定的条件下执行反应的能力，研究人员能够调整每个反应的准确组成2。此外，无细胞方法支持合成网络的高通量测试，因为它无需执行耗时的细胞克隆步骤。因此，连续设计-建造-测试周期的持续时间显著缩短29，30，31，32。利用无细胞克隆技术（如吉布森组件）快速设计新型网络，以及利用线性DNA模板构建网络，从而进一步加快设计周期，这与体内测试所需的质粒不同——可通过聚合酶链反应（PCR）33、34进行扩增。
批量反应是执行IVTT反应的最简单方法，需要一个单一反应容器，其中所有反应成分结合35。这种反应足以用于蛋白质表达和基本电路测试，但在试图研究网络的长期动态行为时证明是不够的。在批量反应过程中，试剂要么耗尽，要么降解，导致转录率和转化率持续下降。此外，随着反应的不断进步，副产品会干扰或完全抑制网络的正常运行。最终，使用批量反应器限制了可以观察到的动态行为，而消极的调节对于实施5，36尤其具有挑战性。
IVTT系统的多功能性使多种替代方法可以执行长时间的IVTT反应，从连续流到滴基方法，以及更简单的透析方法2，30，37，38，39，40.微流体器件的应用为用户提供了对反应的增强控制，同时提高了吞吐量，将成本降至最低 35、41、42，每种特定方法都有其自身优势。连续流的使用可以很容易地优化，提高表达产量，然而，无法有效地去除特定的反应产物，使动态行为的研究不平凡39。虽然采用基于液滴的微流体系统允许对新型网络进行高通量筛选，但难以向反应提供新鲜试剂，导致液滴类似于小体积批量反应43。透析基反应器允许引入新的试剂以及去除一些反应产物，然而，RNA分子和较大的蛋白质在反应器内积累，太大，无法扩散到膜孔。此外，需要大量的试剂来维持这些反应的时间为30，44。2013年，Maerkl等人展示了一种多层微流体装置，专门用于进行长时间的IVTT反应36，45。使用多层微流体装置可以直接控制流体流动，允许在设备46、47的特定区域重定向和隔离流体。这些隔离区域可以作为独立的纳米升级反应室，其中IVTT反应可以进行。在单个IVTT反应过程中，使用定期注入新试剂到反应器中补充IVTT成分和DNA模板。同时，将相同体积的旧反应溶液置换，去除反应产物。通过这种方式，保持一个不平衡的环境，使基底转录和翻译速率保持稳定状态，延长IVTT反应的寿命，并允许发生丰富的动态行为。通过应用这种方法，研究人员能够研究特定电路内发生的单个过程的动能速率，从而有助于新基因网络的前瞻性工程。例如，尼德霍尔特迈尔等人用这种方法来描述遗传环振荡器的各种元素，确定其动能速率36。在进一步的研究中，Yelleswarapu等人表明，在批处理条件下确定的西格玛因子28（±28）的动力学速率不足以描述基于±28的振荡器的行为，并且添加基于流量的数据改进了网络行为的模型预测22。
本手稿的目的是为能够执行长期 IVTT 反应的多层微流体器件的制造提供完整的方案。此外，本手稿将描述执行长时间 IVTT 反应所需的所有硬件和软件。微流体装置的驱动 - 控制流体流动所必需的 - 是通过使用一系列气动阀实现的，这些气动阀通过管道长度直接连接到微流体装置。反过来，气动阀通过定制的虚拟控制接口进行控制。微流体装置内的流体流动是使用市售的压力调节系统提供的连续压力实现的。IVTT反应通常在29°C至37°C之间进行，显微镜培养箱用于调节反应过程中的温度。然而，当储存在4°C以上时，IVTT混合物的功能会逐渐退化。因此，本手稿将扩展用于在注入微流体装置之前用于冷却 IVTT 混合物的离片冷却系统。最后，本手稿全面概述了使用微流体流反应器成功执行长期 IVTT 反应所需的程序，以便其他研究人员能够相对地复制该技术缓解。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

随着研究人员致力于开发更大、更复杂的合成遗传调控回路，基于细胞的合成生物学的局限性正变得越来越明显。对体内合成遗传调控网络的分析非常耗时，而且缺乏环境控制，外源合成成分与宿主过程相互作用，导致不良行为。为了克服这些问题，新型电路的无细胞表征正变得越来越普遍。体外转录和翻译（IVTT）混合物允许调节实验环境，并可针对每个独特的系统进行优化。此处介绍的协议详细介绍了多层微流体器件的制造，该装置可用于长时间维持IVTT反应。与批次反应不同，在资源随时间而耗尽和（副产品）产品积累的情况下，微流体装置的使用允许补充资源并去除反应产物。通过这种方式，通过维持一个不平衡的环境来模拟细胞环境，在这种环境中，可以长期研究基因回路的动态行为。为了充分利用多层微流体器件，集成了硬件和软件，使IVTT反应自动化。通过将IVTT反应与此处介绍的微流体平台相结合，可以全面分析复杂的网络行为，从而加深我们对调节细胞过程机制的理解。

为了证明多层微流体平台对IVTT实验进行的有效性，所述设置用于表达deGFP蛋白。实验在市售的30种IVTT反应混合物中进行，包括所有必要的转录和翻译成分，辅以反应基质和DNA模板。实验在29°C的温度下进行;一种温度，对蛋白质的IVTT表达最最佳。
微流体装置拥有9个独特的入口，其中4个在实验中被利用。第一种含有商业上获得的IVTT反应混合物。IVTT反应混合物容纳成功表达蛋白质所需的所有组分，然而，在加载到微流体装置之前，将纯化的GamS添加到反应混合物中，最终浓度为1.3μM。在进行实验时，添加 GamS 蛋白有助于最大限度地减少线性 DNA 物种的降解。关键是，IVTT混合物被注射到聚四氟乙烯（PTFE）管中，盘绕到表面温度为4°C的Peltier元件上，在将溶液注入微流体装置之前冷却溶液;防止反应溶液在使用前降解。微孔聚醚酮（PEEK）管用于连接PTFE管，使佩尔蒂埃元件表面与微流体装置，减少IVTT反应混合物的体积不冷却。插入器件的第二个溶液包含在浓度为10 nM的浓度为10 nM的deGFP的线性DNA模板编码 - 溶解在超纯水中。第三种溶液，超纯水，在实验过程中具有多种用途。主要使用超纯水来确保所有反应器的置换体积相等，作为控制反应中DNA的替代品。此外，在设备校准期间，还使用超纯水稀释荧光，并在试剂之间切换时冲洗设备的死体积。插入器件的最终解决方案是执行初始设备校准所需的纯化 FITC-dextran 溶液 （25 μM）。DNA、水和荧光溶液被注射到管中（0.02"ID，0.06"OD），随后可以插入微流体装置的一个流入通道，根据协议第4.2节。因此，这些溶液被储存在29°C的整个实验。
微流体器件的控制通道的驱动是通过自定义控制软件实现的，其中每个控制通道都可以单独激活。长时间的 IVTT 反应的执行无法通过此手动过程实现，并且需要使用包含在控制软件中的自动协议。在为实验准备微流体装置时，可以使用类似的自动化协议来执行许多有用的过程：用新的试剂冲洗器件的死体积，在环形反应器内混合试剂，以及加载新的试剂进入反应器，同时取代电流溶液的同等体积。此外，还有两个复杂的过程：设备校准的传导，以及长期无细胞蛋白表达的执行。上述所有流程都可以轻松从主界面执行，同时还可以配置多个参数以改变特定过程设置，如流入通道、流入量和混合持续时间。
由于微流体设备制造过程中的压力波动和缺陷，单个喷射循环中置换的流体体积可能因设备而异。因此，在进行IVTT实验之前，确定每个注入周期的移位反应器体积（刷新分数）。此校准要求用荧光参考溶液填充所有八个反应器。在这种情况下，使用了纯化的FITC-dextran溶液（25μM）。随后，用超纯水稀释了10次。通过测量每个反应器的荧光每稀释循环的降低，确定了单个喷射周期中置换的流体量。在控制软件中，此值（刷新比率）被记录在IVTT实验期间使用。至关重要的是，为了考虑到整个装置的流速变化以及各个反应器体积的差异，确定并存储每个单独的反应器的刷新比率。使用构成控制软件一部分的"执行校准"程序自动执行反应器的填充和稀释顺序。校准实验的结果如图8所示。
最复杂的预编程过程执行一个长时间的IVTT实验，允许用户启动实验，然后允许它无人值守地运行，直到完成。在整个实验中，1号和5号反应堆被用作空白，在稀释过程中只向反应堆中添加水。反应器2和6用作负控制，只含有IVTT反应溶液和超纯水。其余反应器（3、4、7和8）含有IVTT反应溶液和2.5 nM的deGFP基因线性DNA编码。反应堆的初始化是通过在用超纯水置换25%的反应堆体积之前，用IVTT反应溶液完全填充所有反应堆（不包括1和5）来实现的。此后，开始定期向反应器中注入试剂。实验结果表明，每14.7分钟向反应器注入一次新的试剂，每个稀释周期中，30%的反应堆体积被置换。每次注射的组成是，75%的注射液包括新鲜的IVTT溶液，而其余25%由DNA或超纯水组成。每次注入新的试剂后，反应器被连续混合，然后用显微镜记录每个反应器的荧光图像。随后，该反应被允许连续运行68个周期，导致实验持续时间为16.5小时。图9给出了这个实验的结果。
在进行长时间的IVTT实验时，有两个主要原因导致反应失败;将空气引入微流体装置或降低IVTT反应溶液。微流体装置内空气的发生通常是流入溶液中存在小气泡的直接结果，这些气泡随后被注入微流体装置。进入设备后，空气的存在会抑制流体的正常流动，从而不再周期性地刷新反应，导致反应器环内形成批量反应。在某些情况下，通过试剂的反复冲洗，空气会慢慢从设备中去除，之后反应会按预期继续（如图9所示）。在其他情况下，空气仍然被困住，只能通过中止实验并随后对微流体装置的流层施加连续（高压）来清除，类似于协议第 5.1 节中描述的灌装过程。在我们的实验中，细胞流沙度储存在PEFE管中，冷却至4°C的Peltier元素上。这两种措施都有助于限制IVTT反应溶液随时间的降解，惰性PTFE管确保油管和反应溶液之间的有限相互作用，而低温则保留了功能（生物）分子执行 IVTT 所需的组件。如果反应溶液的降解发生 - 由于反应溶液和存储环境之间的冷却不足或不希望的相互作用 - 那么，这将在实验上表现为蛋白质的逐渐减少表达随着时间的推移。一旦降解，IVTT反应溶液就无法恢复，应准备新的实验。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig1.jpg"> 图 1.执行连续 IVTT 反应所需的硬件设置。A） 硬件设置的原理图。B） 本手稿中使用的设置照片。实施用于连续 IVTT 反应的多层微流体装置需要广泛的硬件设置来调节流量压力、激活控制通道、热和冷反应以及试剂、存储流体和在设备期间成像实验。实验在30°C的温度下进行，这是通过将显微镜放在设定在此温度的培养箱内实现的。为了防止IVTT反应溶液的变质，它储存在PTFE管中，盘绕在Peltier元素的冷面上。Peltier 元件的温度设置为 4°C，使用水冷却器和水块来保持此温度。不需要冷却的试剂储存在显微镜培养箱外的液体储液罐中。恒定压力通过计算机控制的压力调节器施加到这些储液罐上。通过这种方式，流体通过储液罐的出口管被强制，该出口管直接连接到微流体装置的流入通道。微流体装置的每个控制通道都连接到气动阀。整个阀门阵列处于恒定压力之下。打开阀门，允许将气动阀连接到微流体装置的控制通道的油管内的流体加压，从而打开和关闭微流体装置内的 PDMS 膜。气动阀通过用户界面打开和关闭，该用户界面命令现场总线控制器（未显示）打开和关闭特定的气动阀。图改编自耶勒斯瓦拉普等人22。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig2.jpg"> 图 2.气动阀设置和控制通道连接概述。显示一个 8 阀阵列，该阵列与安装在阀 1、2 和 3 上的三个控制通道连接。压缩空气可通过 1/4" 管材供应到阀阵列。对于控制通道的驱动，使用两个压力：1 bar 用于低压控制通道（1、2 和 3）和 3 bar 用于较高压力控制通道（9 到 30，此处未显示）。管子可以充满超纯水，并使用不锈钢连接器销插入控制通道入口之一。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig3.jpg"> 图 3.商业流量压力调节器和储层系统的概述。市售压力调节器用于将流体注入多层微流体装置的流层。将压力控制器连接到计算机允许调节用于执行流体喷射的压力。试剂可储存在与压力调节器直接相连的储液罐中。向储液罐施加压力会通过出油管迫使液体流出储液罐。此出口管可使用不锈钢连接器销直接连接到微流体装置的流体入口之一。如果试剂体积无法到达储液罐，则出口管充当试剂的储液罐。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig4.jpg"> 图 4.用于冷却反应试剂的冷却系统概述。（左）隔离冷却设置和（右）冷却设置放置在显微镜内并连接到微流体装置。在注射到微流体装置之前，Peltier 元素用于冷却 IVTT 反应溶液。试剂储存在PTFE管中，盘绕在Peltier元件的冷面上。一段 PEEK 管用于将冷却的流体转移到微流体设备，具有较小的内部直径 （0.005"），可最大限度地减少试剂体积不再冷却。除了盘绕的PTFE管外，还放置了热敏电阻，允许在Peltier元件表面进行实时温度监测。施加到 Peltier 的电压被设置为 Peltier 的表面温度保持在 0 °C 和 4 °C 之间。为了去除 Peltier 元素产生的多余热量，Peltier 的热面被放置在水冷却块上，并添加无硅散热器润滑脂，确保两个面之间的最佳传热。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig5.jpg"> 图 5.微流体装置设计概述。用于连续IVTT反应的微流体流反应器由8个反应环组成，每个环的体积为10.7 nL。九个入口允许九种独特的反应溶液流入设备。24 个控制通道调节设备内的流体流动。控制通道 9 到 14 形成多路复用器。这些控制通道应始终加压，以抑制流体流入设备。两个控制通道的减压同时允许单个试剂流入。控制通道 15、16 和 17 用于以受控方式将试剂 Perpera 泵入设备。控制通道18至25，每个控制装置内8个反应器之一的进气。控制通道26可以关闭冲洗通道，从而迫使流体进入反应器。控制通道27有助于对反应器进行均匀填充。控制通道 28 和 29 分别调节环形反应器插座和唯一的装置插座。最后，控制通道1、2和3用于在环形反应器内蠕动泵送液体，从而混合试剂。这种微流体装置和图的设计均采用奈德霍尔特迈尔等人29。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig6.jpg"> 图 6.微流体装置内的膜基阀。 A） 微流体装置内的流道。在后台可以看到两个控制通道。这些通道没有加压，因此阀门是打开的（流体可以流动）。B） 与流层通道相交的两个控制通道已加压，关闭阀门（即流体流动受阻）。控制通道加压后，分离流层通道和控制层通道的薄 PDMS 膜向上偏转（控制层位于流层下方），从而关闭流层通道。流层通道的舍入对于确保偏转膜完全关闭流道至关重要。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig7.jpg"> 图 7.用于控制微流体设备的用户界面。在整个研究中，一个自定义控制接口用于控制微流体器件内的流体流动。该接口允许用户单独激活每个控制通道（编号为 1-3 和 9-29），或执行复杂的协议，从而冲洗和加载试剂、校准微流体设备以及执行实验。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig8.jpg"> 图8。校准实验的结果。在校准实验期间，反应器充满荧光（25 μM FITC-Dextran），之后记录荧光强度。随后，一系列稀释，其中一组进流步骤（15）用于将超纯水注入反应堆。每次稀释后，将试剂混合，并测量荧光。稀释的荧光强度降低，表明为设定的流入步数而置换的反应器环的体积;一个称为刷新比的值.A）所有八个反应器的平均强度和标准偏差以红色显示，单个强度痕迹以灰色显示。B） 每个稀释步骤的平均刷新比率和标准偏差以红色显示。每个反应器的单独刷新比率显示为灰色。可以看出，8个反应堆中有7个表现出非常相似的行为，然而一个反应堆在第七次稀释周期后显示刷新率的波动。这突出表明，每个反应器都需要独特的刷新比率，而不是使用平均刷新率将试剂注入反应器。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59655/59655fig9.jpg"> 图 9.表达deGFP蛋白的IVTT实验结果。长时间的IVTT反应开始，使30%的反应堆体积每14.6分钟被移位。反应在终止前可以运行超过16小时。微流体装置的两个反应器被用作空白，在整个实验过程中，只有超纯水通过反应堆（反应器1和5）。所有其他反应器包括75%的IVTT反应溶液和25%的超纯水（反应器2和6）或2.5 nM线性DNA模板编码表达deGFP（反应器3，4，7和8）。在添加DNA的所有四个反应器中，都有明显的deGFP表达。四个反应器中有三个提供类似的荧光强度，一个反应器显示较低的荧光信号。这可能是由于流量差异导致进入反应堆的DNA较少，或者由于反应堆尺寸的变化。14小时后，含有DNA的反应堆信号突然增加。这是由气泡进入微流体装置的流动层引起的，大概来自其中一个流入溶液。微流体装置中的空气捕获会显著限制流体通过通道的流动，因此，在空气通过之前，不得向反应器中添加或去除新的试剂。恢复流动后，实验将恢复到以前的荧光强度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/59655fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
补充文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59655/Supplemental_Files.zip" target="_blank">请点击此处下载这些文件。</a>

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A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

介绍了基于PDMS的多层微流体装置的制造过程，该装置允许长时间进行体外转录和翻译（IVTT）反应。此外，还全面概述了自动化和维护这些反应所需的硬件和软件，

用于长期无细胞基因表达传导的多层微流体平台

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

利用无细胞基因表达系统，对合成基因网络进行原型设计得到了极大的改进。我们的协议描述了多层微流体流反应器的制造过程，并表明这种装置可用于GP的长期无细胞表达。无细胞蛋白表达与微流体流反应器相结合，为合成生物器件的设计提供了快速原型平台。整个设置用途广泛，可适用于任何需要高控制水平的生化或化学反应的传导。确保无细胞反应溶液的稳定性至关重要，而且难以实现。请务必专注于提供足够的冷却，并利用本协议中指定的管道。制造和准备实验平台需要连接许多单独的组件，如果没有视觉辅助，这个过程可能很难遵循。首先，按照随附的文本协议来制造微流体装置，并设置气动控制和流量压力调节，用于控制对该器件至关重要的阀门。要设置离片冷却，首先将 PTFE 管的长度盘绕到 Peltier 元件的冷面上，然后用胶带固定线圈。确保 PTFE 油管的一端连接到流层压力控制系统的储液罐，另一端从 Peltier 表面伸出不超过一厘米。接下来，将 5 到 10 厘米长的 PEEK 油管插入 PTFE 油管的突出端。将足够量的热化合物涂抹在Peltier元件的热面上，并将其放在水块的冷板上。确保油管、Peltier 元件和冷却块一直直接接触。接下来，使用串行总线连接器将 Peltier 元件连接到温度控制器，以便调节提供给 Peltier 的电压。然后，安全地将热敏电阻放在 Peltier 表面上，并将其输出连接到温度控制器。打开水冷却器后，调整提供给 Peltier 的电压，直到温度稳定在 4 摄氏度。对于微流体装置的每个控制通道，可切割一米长的标准管的长度。在一端，插入 23 仪表的销，一个半英寸 Luer 存根，另一端插入不锈钢连接销。将 Luer 存根连接到一个公 Luer 3/32 英寸带状尼龙连接器，并将连接器的刺插入聚氨酯管的长度。然后将聚氨酯管直接插入其中一个电磁阀中。接下来，将一个 23 仪表半英寸 Luer 存根连接到注射器上，并将其插入一个 3 到 4 厘米长的标准管中。将管子的开端放入超纯水储液罐中，并加注超纯水。对微流体装置的每个控制通道进行编号，如下所示。对于通道四至 29，找到相应的管子，并将金属销插入连接到注射器的管子的开端。然后将水注入控制通道管，直到一半的长度被填满。接下来，断开管子与注射器的连接，将不锈钢连接器销插入微流体装置的相应孔中。对所有控制通道重复此步骤。现在，使用控制接口打开所有电磁阀。这将对控制通道管内的液体加压，迫使其进入微流体装置，并关闭设备内所有基于膜的阀门。对于每个未冷却的试剂，可切割一米长的标准管，将储液罐出口连接到微流体装置入口。采取管的一端，并将其插入储液罐，确保油管到达储液罐底部。应拧紧储油管出口，以便实现密封密封。然后，将不锈钢连接销插入管的开端。接下来，将 23 仪表半英寸 Luer 存根连接到一毫升注射器的端。向 Luer 存根添加一小段标准油管。将管端放入所需的试剂溶液中，然后用试剂填充注射器。然后将不锈钢连接器销插入连接到注射器的聚氨酯管中，然后用试剂填充管材。当使用小反应量时，试剂不会进入储液罐，管本身将充当储液罐。完成后，断开注射器，并将连接器销插入微流体装置的一个流层入口孔中。然后使用压力调节器软件对每个储液罐施加压力，以强制将试剂插入微流体装置。确保水冷却器和 Peltier 元件在 Peltier 的表面温度设置为 4 摄氏度时已打开。将冷却装置安装到尽可能靠近微流体装置的附近，以最大限度地减少 Peltier 和设备入口之间的不冷却体积。然后将一毫升注射器连接到 23 表半英寸 Luer 存根，其端端有一条短长度的标准管。在要冷却的试剂中绘制以填充注射器。接下来，通过连接管将 PEEK 管连接到注射器，并持续向注射器施加压力，迫使注射器通过 PEEK 管进入 PTFE 管。最后断开PEEK管与注射器的连接，将其直接插入微流体装置的流通道入口。施加压力时，冷却的试剂将被强制进入微流体装置。确保微流体装置在显微镜舞台上安全，并连接所有控制和流动层管，并关闭培养箱上的任何开口。接下来，将孵化器的环境温度设置为 29 摄氏度。然后确保冷却系统已打开，并在开始实验之前设置为 4 摄氏度。检查施加在流量通道压力调节器上的压力是否设置为 800 毫巴，并使用软件将每个流量通道的输出压力设置为 20 至 100 毫巴之间。检查施加在控制通道电磁阀上的压力是通道 1 到 8 的一个 bar，通道 9 到 29 的三条。接下来，通过给通道29加压，同时通过3和15到28对控制通道进行减压，关闭设备的出口。然后有选择地减压多路复用器的控制通道，使单个选定的试剂流入设备。使用显微镜监测空气的去除，然后确保所有试剂正确流动，而不会产生气泡。使用提供的软件包，设置与校准过程相关的数据字段，如随附的文本协议中所述。随后，通过执行校准协议，确定在单个流入步骤中从每个反应器中置换的流体体积。按照控制软件提供的步骤完成校准实验的分析，并确定微流体器件中每个环反应器的刷新率。最后，在虚拟控制接口中为所需的实验设置所需的值。按下控制界面中执行实验按钮，启动实验方案。在校准实验中，反应器中充满荧光团，其强度在每次稀释后记录。每个稀释的荧光强度降低，显示为设定数量的流入步长而置换的反应堆环的体积。此卷表示刷新比率。每个稀释步骤的平均刷新率和标准偏差以红色显示。八个反应堆中的七个表现出非常相似的行为，但是一个反应堆在第七次稀释周期后表现出波动。这突出表明，每个反应堆都需要独特的刷新比率。此处显示的长时间的体外记录和翻译反应每 14.6 分钟有 30% 的反应堆体积被置换。微流体装置的两个反应器，用作空白。所有其他反应器包括75%的体外转录和转化反应溶液和25%的超纯水或2.5纳米摩尔线性DNA模板编码，用于表达deGFP蛋白。在添加DNA的所有四个反应器中，都有清晰的脱氧核糖核酸表达。一个反应器显示较低的荧光信号。这可能是由于流量差异导致进入反应堆的DNA减少或由于反应器尺寸的变化。14小时后，含有DNA的反应堆信号突然增加。这是由进入微流体装置流层的气泡引起的。恢复流量后，实验将回到先前的荧光强度。无细胞反应解决方案会随着时间的推移而退化，除非它们经过充分冷却，否则使本协议中描述的冷却过程变得至关重要。由于平台的多功能性，可以精确且可控地进行各种生化和化学反应。微流体流反应器的应用加速了双基因电路原型设计的连续构建测试周期。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

利用微流控平台的高通量蛋白质表达发生器

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

科研

生物工程

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

电池挤压作为一种强大的，微流控细胞内传送平台

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

微流体平台从未经加工的全血测定中性粒细胞趋

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

多器官芯片 - 一种微流体平台的长期多组织共培养

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

多级可变高度的光刻多层带瓣微流体装置

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

与复用电子检测的粒子的空间跟踪微流体平台

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Performance-testing Platform for a Conduction Micropump with an FR-4 Copper-clad Electrode Plate

FR-4 铜包电极板导电微泵性能测试平台

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is ...

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影像学在两层微流控平台拟南芥幼苗的根头发形态

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快速生长的纳氏弧菌的无细胞蛋白表达

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...