Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af det europæiske forskningsråd, ERC (projekt n. 677313 BioCircuit), et NWO-VIDI-stipendium fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO, 723.016.003), støtte fra ministeriet for uddannelse, kultur og videnskab (Gravity programmer, 024.001.035 & 024.003.013), Human Frontier Science program Grant RGP0032/2015, det Europæiske Forskningsråd under den Europæiske Unions Horizon 2020 forsknings-og innovationsprogram Grant 723106, og en schweizisk National Science Foundation Grant 200021_182019.

Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.

En PDMS-baseret flerlags mikrofluidisk-enhed er blevet præsenteret, og dens evne til at opretholde ivtt-reaktioner i længere perioder er blevet påvist. Selvom velegnet til dette specifikke eksempel, denne teknologi kan tænkes bruges til mange andre applikationer. Den ekstra kontrol over fluid flow-parret med evnen til kontinuerligt at genopbygge reaktions reagenser, mens du fjerner (ved) produkter-er ideel til kontinuerlige syntese reaktioner, undersøgelse af forskellige dynamiske adfærd, og den samtidige overledning af flere variationer af en enkelt reaktion.
På trods af den relativt ligetil fabrikationsproces af PDMS-baserede enheder kræver brugen heraf en omfattende hardware opsætning. Bestående af ventilsystemer, trykregulatorer, tryk pumper, inkubatorer og køleenheder er overgangen fra fabrikation til brug ikke elementær og kræver en betydelig initialinvestering. Desuden kræver evnen til konsekvent at oprette og udføre vellykkede eksperimenter med disse anordninger en betydelig tidsinvestering; et punkt, som dette manuskript har til formål at løse. Men når du er på plads, kan hele opsætningen ændres til en række formål. Desuden består hardware opsætningen af talrige modulære elementer, som hver kan udvides, så det er muligt at arbejde med mere komplekse mikrofluidiske enheds designs. Derudover muliggør det modulære design udskiftning af hardwarekomponenter ved tilsvarende fungerende alternativer, således at brugerne ikke er begrænset til den specifikke opsætning, der er beskrevet her48,49.
Variabilitet mellem de enkelte enheder og under de ydre forhold (f. eks. trykudsving) kan resultere i unøjagtigheder, når de udfører eksperimenter ved hjælp af disse enheder. For at løse dette problem skal der udføres en kalibrering af systemet før hvert eksperiment, hvilket giver et unikt opdaterings forhold for hver af reaktorerne. Mens kalibreringen adresserer enheden-til-enhed og eksperiment-til-eksperiment variationer, er det en tidskrævende proces og ikke fejlfri. Væsker med forskellige viskositeter vil ikke flyde med samme hastighed, når de udsættes for identisk tryk, og som sådan udfører kalibreringen med flere reagenser, kan ikke give identiske opdaterings forhold. Denne effekt dæmpes ved at anvende tre kontrol kanaler til Peristaltisk at pumpe reagenserne ind i den mikrofluidiske enhed i modsætning til regulering af strømmen ved at variere det medfølgende tryk. Som en sidste udvej i tilfælde, hvor forskellen i viskositet er meget stor, kan der implementeres et unikt opdaterings forhold for hver enkelt reagens ved at udføre flere kalibrerings eksperimenter.
Brugen af en peristaltisk pumpe til injektion af reagenser i den mikrofluidiske anordning dæmper virkningerne af at anvende opløsninger med varierende viskositeter, men det skaber også et sekundært problem. Ved hjælp af diskrete trin til pumpning af væsker ind i den mikrofluidiske anordning, betyder, at opløsningen af injektioner i en enkelt reaktor, er begrænset af den mængde, der injiceres, når du udfører en enkelt pumpe cyklus. Inden for vores forskning er denne værdi-bestemt under kalibreringen-omtrent lig med 1%, hvilket indikerer, at en enkelt pumpe cyklus forflytter ca. 1% af reaktor volumenet (ca. 0,1 nL). Som sådan kræver forskydningen af 30% af reaktor volumenet udførelse af 30 pumpe cyklusser med 23 pumpe cyklusser af ivtt-reaktions opløsningen, og der tilsættes kun 7 pumpe cyklusser af DNA eller ultrarent vand. Selv om de er tilstrækkelige til vores forskning, kan alternative forsøgsprotokoller støde på problemer, når de forsøger at tilføje et større antal unikke reagenser, bruge en lavere opdaterings fraktioneller tilføje mindre volumener af en enkelt reagens til en reaktor. I sådanne tilfælde kan mikrofluidic enhedens design tilpasses til at give reaktorer med en større volumen. Et eksempel på en sådan er rapporteret i Niederholtmeyer et al.36.
Det er afgørende, at anordningen, der er skitseret i dette manuskript, gør det muligt at opretholdes reaktioner ved længerevarende varigheder, hvilket resulterer i transkription og oversættelses rater i steady state. Ved periodisk indsprøjtning nye reagenser i reaktorerne-og fjerne reaktion (af) produkter-Reaktionerne er vedvarende og komplekse dynamiske adfærd kan overvåges. På denne måde er der skabt en platform, som-til en vis grad-efterligner det cellulære miljø. Endvidere, denne platform muliggør udforskning af systemets dynamik, ved at tilpasse perioden mellem injektioner og den specifikke sammensætning af injektionerne. Som følge heraf er disse flerlags mikrofluidiske enheder et effektivt værktøj til karakterisering og optimering af nye syntetiske net, der udviser kompleks dynamisk adfærd.

Celler er i stand til at fornemme og reagere på deres omgivelser ved hjælp af komplekse dynamiske regulerende netværk1,2. Feltet af syntetisk biologi udnytter vores viden om de naturligt forekommende komponenter, der omfatter disse netværk til ingeniør biologiske systemer, som kan udvide funktionaliteten af cellerne3,4. Omvendt er det også muligt at fremme vores forståelse af de naturlige netværk, der styrer livet ved at designe forenklede, syntetiske analoger af eksisterende kredsløb eller ved fremad-Engineering biologiske systemer, som udviser naturligt forekommende adfærd. De Novo engineering af sådanne biologiske systemer udføres på en bottom-up mode, hvor nye genetiske kredsløb eller signalveje er konstrueret på en rationel måde, ved hjælp af veldefinerede dele5,6. Kombinationen af den rationelle udformning af netværk med udformningen af biologisk relevante systemer gør det muligt dybdegående karakterisering og undersøgelse af biologiske reguleringssystemer med forskellige niveauer af abstraktion7.
De pioner værker af Elowitz og Leibler8 og Gardner et al.9 var de første til at demonstrere den vellykkede indførelse af syntetiske genetiske netværk i cellulære værter. I det følgende årti har talrige forskere fortsat med at bygge videre på disse første succeser på trods af fremkomsten af flere begrænsninger med hensyn til indførelsen af syntetiske kredsløb i cellerne7,10,11 ,12. Ideelt set bør indførelsen af syntetiske kredsløb i cellulære værter ske i en modulær måde. Desværre gør kompleksiteten af det cellulære miljø dette særligt udfordrende, med funktionen af mange dele og netværk er meget kontekstafhængige12,13,14. Som et resultat, netværk ofte oplever uønskede interaktioner med indfødte vært der som kan påvirke funktionen af syntetisk kredsløb. På samme måde kan komponenter i det udefrakommende netværk hæmme værts processerne, konkurrere om fælles ressourcer inden for værten og påvirke vækst kinetikken15,16,17. Med henblik på rationelt at udforme og forudsige adfærden af syntetiske net i et in vivo-miljø kræves der derfor en omfattende model af alle værts-og kredsløbs specifikke dynamikker18.
Et levedygtigt alternativ til brugen af cellulære værter til karakterisering af syntetiske net er anvendelsen af in vitro transkription og oversættelse (IVTT) teknologier. Som en test for syntetiske net udføres der reaktioner i opløsninger, som omfatter alle de komponenter, der er nødvendige for at muliggøre genekspression19,20,21. På denne måde skabes et biologisk relevant, omend kunstigt, miljø, inden for hvilket syntetiske net kan testes22,23,24,25,26, 27,28. En stor fordel ved at bruge IVTT løsninger er evnen til at udføre reaktioner under bruger-specificerede betingelser, med forskerne i stand til at tune den præcise sammensætning af hver reaktion2. Desuden, den celle-fri tilgang muliggør High-gennemløb afprøvning af syntetiske netværk, da det fjerner behovet for at udføre tidskrævende cellulære kloning trin. Som et resultat, varigheden af successive design-build-testcyklusser er væsentligt reduceret29,30,31,32. Design cyklussen kan accelereres yderligere ved at anvende celle frie kloningsteknikker såsom Gibson assembly til hurtigt at konstruere nye netværk, og ved at opbygge netværk fra lineære DNA-skabeloner, som-i modsætning til plasmider kræves til in vivo test- kan forstærkes via polymerase kædereaktioner (PCR)33,34.
Batch reaktioner er den enkleste metode, hvormed IVTT reaktioner kan udføres, kræver et enkelt reaktions fartøj, hvori alle reaktions komponenterne kombineres35. Sådanne reaktioner er tilstrækkelige til protein ekspression og grundlæggende kredsløb test endnu vise sig utilstrækkelige, når de forsøger at studere den langsigtede dynamiske opførsel af et netværk. I løbet af en batch reaktion er reagenserne enten udtømte eller underkastes nedbrydning, hvilket resulterer i et kontinuerligt fald i transskription og oversættelses rater. Endvidere, som reaktioner fremskridt biprodukter ophobes, der kan forstyrre-eller helt hæmme-den korrekte funktion af netværket. I sidste ende begrænser brugen af batch reaktorer den dynamiske adfærd, der kan iagttages, idet negativ regulering er særligt udfordrende at implementere5,36.
Alsidigheden af ivtt-systemer muliggør flere alternative metoder, som forlængede ivtt-reaktioner kan udføres, lige fra kontinuerlig flow til dråbe baserede metoder samt enklere dialyse tilgange2,30, 37,38,39,40. Anvendelsen af mikrofluidisk-enheder giver brugerne øget kontrol over deres reaktioner og samtidig øge gennemløb og minimere omkostningerne35,41,42, med hver specifik tilgang, der har sin egne fordele. Brugen af kontinuerlig flow kan nemt optimeres for at øge ekspression udbytter dog, den manglende evne til effektivt at fjerne specifikke reaktionsprodukter gør studiet af dynamisk opførsel ikke-triviel39. Mens anvender dråbe baserede mikrofluidisk systemer giver høj gennemløb screening af nye netværk, vanskeligheden ved at levere friske reagenser til reaktionen resulterer i dråberne ligner små volumen batch reaktioner43. Dialyse baserede reaktorer tillader indførelse af friske reagenser samt fjernelse af nogle reaktionsprodukter men, RNA molekyler og større proteiner ophobes i reaktoren, at være for stor til at sprede gennem membranen porer. Desuden kræves store mængder reagenser for at opretholde disse reaktioner i længere perioder30,44. I 2013 præsenterede maerkl et al. en multi-lags mikrofluidisk-anordning designet specielt til at udføre forlængede ivtt-reaktioner36,45. Brugen af flerlags mikrofluidiske enheder giver mulighed for direkte kontrol over væskestrømmen, hvilket giver mulighed for omdirigering af flow samt isolering af væske i specifikke områder af enheden46,47. Disse isolerede regioner kan fungere som uafhængige nanoliter-skala reaktions kamre, hvor IVTT reaktioner kan udføres. I løbet af en enkelt IVTT-reaktion anvendes periodiske injektioner af friske reagenser i reaktoren til genopfyldning af IVTT-komponenter og DNA-skabeloner. Samtidig forskydes en tilsvarende mængde af den gamle reaktions opløsning, hvorved reaktionsprodukter fjernes. På denne måde opretholdes en out-of-ligevægt miljø, hvor de basale transkription og oversættelse satser forblive i Steady-State, forlænge levetiden af IVTT reaktioner og giver rig dynamisk adfærd at forekomme. Ved at anvende denne fremgangsmåde, forskerne er i stand til at undersøge de kinetiske rater af de enkelte processer, der opstår inden for et bestemt kredsløb, medvirken i frem-engineering af nye genetiske netværk. For eksempel, niederholtmeyer et al. implementeret denne fremgangsmåde til at karakterisere forskellige elementer af en genetisk ring oscillator, fastsættelse af kinetiske satser heraf36. I yderligere undersøgelser viste Yelleswarapu et al., at de kinetiske rater af Sigma faktor 28 (σ28) bestemt under batch betingelser ikke var tilstrækkelige til at beskrive adfærden af en σ28-baseret oscillator, og at tilføjelsen af flow-baserede data forbedrede model forudsigelser af netværkets opførsel22.
Formålet med dette manuskript er at fremlægge en komplet protokol til fremstilling af flerlags mikrofluidiske enheder, der kan udføre langvarige IVTT-reaktioner. Desuden vil dette manuskript beskrive al den hardware og software, der kræves for at udføre forlængede IVTT-reaktioner. Aktivering af den mikrofluidisk enhed-nødvendig for at kontrollere strømmen af væsker deri-opnås ved hjælp af en serie af pneumatiske ventiler, der tilsluttes direkte til de mikrofluidisk enheder via længder af slanger. Til gengæld styres pneumatiske ventiler via en specialbygget virtuel kontrol grænseflade. Væskestrømmen i de mikrofluidiske anordninger opnås ved hjælp af kontinuerligt tryk, som leveres af et kommercielt tilgængeligt tryk reguleringssystem. IVTT-reaktioner udføres typisk mellem 29 °C og 37 °C, og en mikroskop inkubator anvendes til at regulere temperaturen under reaktionerne. Imidlertid nedbrydes funktionaliteten af IVTT-blandingen gradvist, når den opbevares over 4 °C. Som sådan vil dette manuskript ekspandere på off-chip kølesystemet bruges til at køle ivtt blandingen før injektion i mikrofluidisk enhed. Afslutningsvis giver dette manuskript et omfattende overblik over de procedurer, der er nødvendige for at kunne udføre længerevarende IVTT-reaktioner ved hjælp af en mikrofluidisk strømnings reaktor, således at andre forskere vil være i stand til at replikere denne teknologi med relative Lethed.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

Begrænsningerne af celle-baseret syntetisk biologi bliver stadig tydeligere, da forskerne har til formål at udvikle større og mere komplekse syntetiske genetiske regulerende kredsløb. Analysen af syntetiske genetiske reguleringsnetværk in vivo er tidskrævende og lider under manglende miljøkontrol, med eksogene syntetiske komponenter, der interagerer med værts processer, hvilket resulterer i uønsket adfærd. For at overvinde disse problemer, celle-fri karakterisering af nye kredsløb er ved at blive mere udbredt. In vitro transskription og oversættelse (IVTT) blandinger tillader regulering af forsøgs miljøet og kan optimeres for hvert unikt system. Protokollerne præsenteres her detaljer fremstilling af en flerlags mikrofluidisk enhed, der kan udnyttes til at opretholde ivtt reaktioner for længerevarende varigheder. I modsætning til batch reaktioner, hvor ressourcer er opbrugt over tid og (af-) produkter akkumuleres, brugen af mikrofluidisk enheder giver mulighed for genopfyldning af ressourcer samt fjernelse af reaktionsprodukter. På denne måde er det cellulære miljø emuleret ved at opretholde en out-of-ligevægt miljø, hvor den dynamiske opførsel af genkredsløb kan undersøges i længere tid. For fuldt ud at udnytte den flerlags mikrofluidisk enhed, hardware og software er blevet integreret for at automatisere ivtt reaktioner. Ved at kombinere ivtt reaktioner med den mikrofluidisk platform præsenteret her, bliver det muligt at omfattende analysere komplekse netværk adfærd, fremme vores forståelse af de mekanismer, der regulerer cellulære processer.

Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Fremstillingsprocessen af en PDMS-baseret, flerlags, mikrofluidisk enhed, der tillader in vitro transkription og oversættelse (ivtt) reaktioner, der skal udføres over længere perioder er beskrevet. Desuden gives der en omfattende oversigt over den hardware og software, der kræves for at automatisere og vedligeholde disse reaktioner for længerevarende varigheder.

En Mikrofluidic-platform med flere lag til overledning af forlænget celle frit genekspression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Prototyping syntetiske gennetværk er stærkt forbedret ved brug af celle-fri genekspressionssystemer. Vores protokol beskriver fremstillingsprocessen for mikrofluidisk flowreaktor med flerelag og viser, at en sådan anordning kan bruges til langvarig cellefri ekspression af GFP. Cellefrie proteinudtryk i kombination med mikrofluidiske flowreaktorer udgør den hurtige prototypingplatform til design af syntetiske biologiske anordninger.Hele dette setup er meget alsidigt og kan tilpasses til ledning af alle biokemiske eller kemiske reaktioner, der kræver høje niveauer af kontrol. Det er afgørende og vanskeligt at sikre stabiliteten af den cellefrie reaktionsløsning. Sørg for at fokusere på at give tilstrækkelig køling og udnytte de slanger, der er angivet i denne protokol.Fremstilling og forberedelse af forsøgsplatformen kræver tilslutning af mange individuelle komponenter, en proces, der kan være vanskelig at følge uden visuelle hjælpemidler. Til at begynde med skal du følge med i den medfølgende tekstprotokol for at fremstille den mikrofluidiske anordning og for at opsætte den pneumatiske regulering af kontrol og flowtryk, som vil blive anvendt til at kontrollere de ventiler, der er afgørende for denne anordning. For at opsætte off-chip køling, begynde med at spole en længde ptfe slanger på den kolde side af en Peltier element og sikre spolen med tape.Sørg for, at den ene ende af PTFE-slangen er forbundet med reservoirer i flowlagstrykkontrolsystemet, og at den anden ende ikke rager mere end en centimeter ud af Peltiers overflade. Næste indsætte en fem til 10 centimeter længde PEEK slanger i den fremspringende ende af PTFE slange. Påfør en tilstrækkelig mængde termisk forbindelse på peltierelementets varme side, og placer det på vandblokkens kolde plade.Sørg for, at slangen, Peltier-elementet og køleblokken altid er i direkte kontakt med hinanden. Tilslut derefter Peltier-elementet til temperaturregulatoren ved hjælp af et serielt busstik, så den spænding, der leveres til Peltier, kan reguleres. Derefter sikkert placere en thermistor på Peltier overfladen og tilslut dens output til temperaturregulatoren.Efter at have tændt vandkøleren, tilpasse spændingen leveres til Peltier, indtil temperaturen er stabil ved fire grader Celsius. For hver kontrolkanal af den mikrofluidiske enhed skære en længde af standard slange, der er en meter lang. I den ene ende, indsætte stiften af en 23 gauge, en halv tomme Luer stub og i den anden ende indsætte en rustfrit stål tilslutningsstift.Tilslut Luer stub til en mandlig Luer 3/32 tommer pigtråd nylon stik og indsæt modhager af stikket i en længde af polyurethan slanger. Sæt derefter denne polyurethanslange direkte ind i en af magnetventilerne. Næste vedhæfte en 23 gauge halv tomme Luer stub til en sprøjte og indsætte dette i en tre til fire centimeter lang stykke standard slange.Placer den åbne ende af denne slange i et reservoir af ultra rent vand og fyld sprøjten med ultra rent vand. Nummerer hver kontrolkanal for den mikrofluidiske enhed som vist her. For kanal fire til 29 skal du finde den tilsvarende slange og sætte metalstiften i den åbne ende af slangen, der er fastgjort til sprøjten.Injicer derefter vand i kontrolkanalens slanger, indtil halvdelen af længden er fyldt. Derefter skal du tage slangen ud af sprøjten og sætte stikket i rustfrit stål ind i det tilsvarende hul i den mikrofluidiske enhed. Gentag dette trin for alle kontrolkanalerne.Nu skal du bruge kontrolgrænsefladen til at åbne alle magnetventilerne. Dette vil presse væsken i kontrolkanalen slange tvinger det ind i mikrofluidic enhed og lukke alle de membran-baserede ventiler i enheden. For hver af de ikke-afkølede reagenser skæres en meter længde af standard slange til at forbinde reservoiret stikkontakt til den mikrofluidiske enhed indløb.Tag den ene ende af slangen og sæt den i beholderen for at sikre, at slangen når bunden af beholderen. Beholderens slangeudgang skal strammes, så der opnås en lufttæt forsegling. Sæt derefter en rustfri forbindelsesstift ind i den åbne ende af slangen.Dernæst vedhæfte en 23 gauge halv tomme Luer stub til slutningen af en en milliliter sprøjte. Tilføj en kort længde af standard slange til Luer stub. Slangen sættes i den ønskede reagensopløsning, og fyld sprøjten med reagenset.Sæt derefter stikket i rustfrit stål i polyurethanslangen, der er forbundet med sprøjten, og fyld slangen med reagenset. Når der skal bruges små reaktionsmængder, kommer reagenset ikke ind i beholderen, og selve slangen fungerer som reservoir. Når sprøjten er færdig, skal du tage stikket ud og sætte stikstiften i et af mikrofluidiske enheders indløbshuller i strømlaget.Tryk derefter på hver af beholderne ved hjælp af trykregulatorsoftwaren for at tvinge reagenserne ind i mikrofluidisk anordning. Sørg for, at vandkøleren og Peltier-elementerne er blevet tændt med peltierens overfladetemperatur indstillet til fire grader Celsius. Monter køleopsætningen så tæt på mikrofluidisk enhed som muligt for at minimere den ukoolerede lydstyrke mellem Peltier og enhedens indløb.Derefter tilsluttes den ene milliliter sprøjte til en 23 gauge halv tomme Luer stub med en kort længde af standard slanger fastgjort til enden. Tegn i det, der skal afkøles reagens, for at fylde sprøjten. Derefter tilsluttes PEEK-slangen til sprøjten via binderøret, og tryk konstant på sprøjten, der tvinger reagenset gennem KIG-slangen og ind i PTFE-slangen.Til sidst frakobles PEEK-slangen fra sprøjten, og sæt den direkte ind i mikrofluide enhedens indløb i strømkanalen. Når trykket er påtryk, vil det afkølede reagens blive tvunget ind i mikrofluidic enheden. Sørg for, at mikrofluidisk anordning er sikret på mikroskopstadiet med alle kontrol- og flowlagsslange fastgjort, og luk eventuelle åbninger på inkubatoren.Næste sæt den omgivende temperatur af inkubatoren til 29 grader Celsius. Derefter sikre, at kølesystemet er blevet tændt og er indstillet til fire grader Celsius før påbegyndelse af eksperimentet. Kontroller, at det tryk, der påføres flowkanaltrykregulatoren, er indstillet til 800 millibar, og ved hjælp af softwaren skal du indstille udgangstrykket for hver enkelt flowkanal til mellem 20 og 100 millibar.Kontroller, at tryk på kontrolkanalen magnetventiler er en bar for kanaler en gennem otte og tre bar for kanal ni til 29. Luk derefter enhedens udløb ved at trykke på kanal 29 og samtidig trykke kontrolkanalerne en til tre og 15 til 28. Derefter skal du trykke på styrekanalerne for multixeren selektivt, så et enkelt valgt reagens kan strømme ind i enheden.Brug mikroskopet til at overvåge fjernelsen af luft og sørg derefter for, at alle reagenser flyder korrekt uden at indføre luftbobler. Ved hjælp af den medfølgende softwarepakke skal du konfigurere de datafelter, der er relateret til kalibreringsprocessen, som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Derefter bestemmes den væskevolumen, der forskydes fra hver reaktor under et enkelt indløbstrin, ved at udføre kalibreringsprotokollen.Følg sammen med de trin, der præsenteres af kontrolsoftwaren for at fuldføre analysen af kalibreringseksperimentet og for at bestemme opdateringsforholdet for hver ringreaktor i mikrofluidic-enheden. Endelig skal du indstille de nødvendige værdier for det ønskede eksperiment inden for den virtuelle kontrolgrænseflade. Start forsøgsprotokollen ved at trykke på eksperimentknappen i kontrolgrænsefladen.Under et kalibreringsforsøg fyldes reaktorerne med en fluorophore, hvis intensitet registreres efter hver fortynding. Faldet i fluorescensintensiteten pr. fortynding afslører mængden af reaktorringen, der er forskudt for det indstillede antal indstrømstrin. Denne diskenhed kaldes opdateringsforholdet.Det gennemsnitlige opdateringsforhold og standardafvigelsen vises for hvert fortyndingstrin i rødt. Syv af de otte reaktorer viser meget lignende adfærd, men en reaktor viser udsving efter den syvende fortyndingscyklus. Dette understreger behovet for unikke opdateringsforhold for hver af reaktorerne.Den langvarige in vitro-udskrift og oversættelsesreaktion vist her havde 30% af reaktoren volumen fordrevet hver 14,6 minutter. To reaktorer af mikrofluidic anordningen, hvor de anvendes som emner. Alle de andre reaktorer bestod af 75% in vitro transskription og oversættelse reaktion løsning og 25% af enten ultra rent vand eller 2,5 nanomolar lineære DNA skabeloner kodning for udtrykket af deGFP protein.I alle fire reaktorer, hvor DNA blev tilføjet, var der klart deGFP udtryk. En reaktor viser et lavere fluorescenssignal. Dette kan skyldes forskelle i flow, hvilket resulterer i mindre DNA ind i reaktoren eller på grund af variationer i reaktorens dimensioner.Efter 14 timer ses der en pludselig stigning i signalet fra de reaktorer, der indeholder DNA. Dette skyldes en luftboble, der trænger ind i mikrofluidic-enhedens flowlag. Ved genoptagelse af flowet vender eksperimentet tilbage til sin tidligere fluorescensintensitet.Cellefrie reaktionsopløsninger forringes over tid, medmindre de er tilstrækkeligt afkølet, hvilket gør den køleproces, der er beskrevet i denne protokol, af afgørende betydning. På grund af platformens alsidighed kan en række biokemiske og kemiske reaktioner udføres på en præcis og kontrolleret måde. Anvendelsen af mikrofluidiske flowreaktorer har fremskyndet successive design bygge test cykler til prototyping dobbelt genetiske kredsløb.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell Klemme som en robust, Mikrofluid Intracellulær Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Mikrofluid Platform for Måling neutrofilkemotaksi fra uforarbejdede fuldblod

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-orgel Chip - En Mikrofluid platform for langsigtet Multi-væv cokultur

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-trins Variabel Højde Fotolitografi for med ventiler Multilayer mikrofluidenheder

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikrofluid Platform med Multiplexed Elektronisk Detection for fysisk sporing af partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Performance-testing Platform for a Conduction Micropump with an FR-4 Copper-clad Electrode Plate

En Performance-test Platform for en overledning Micropump med en FR-4 kobberbeklædte elektrode plade

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging rod hår morfologi af Arabidopsis stiklinger i en to-lags mikrofluid Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En mikrofluid Platform for langsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Celle-fri Protein udtryk ved hjælp af hurtigt voksende bakterie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...