Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Europese Onderzoeksraad, ERC (project n. 677313 BioCircuit), een NWO-VIDI-subsidie van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO, 723.016.003), financiering van het ministerie van onderwijs, cultuur en Wetenschappen (zwaartekracht Programma's, 024.001.035 & 024.003.013), het Human Frontier Science Program Grant RGP0032/2015, de Europese Onderzoeksraad in het kader van het Horizon 2020 onderzoeks-en innovatieprogramma van de Europese Unie, subsidie 723106, en een Zwitserse National Science Foundation Grant 200021_182019.

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Er is een PDMS-gebaseerd meerlaagse microfluïdisch apparaat gepresenteerd, en de mogelijkheid om ivtt-reacties gedurende langere tijd te ondersteunen is aangetoond. Hoewel zeer geschikt voor dit specifieke voorbeeld, kan deze technologie denkbaar worden gebruikt voor tal van andere toepassingen. De extra controle over vloeistofstroom-gecombineerd met de mogelijkheid om continu reactie reagentia aan te vullen terwijl (by) producten worden verwijderd-is ideaal voor continue synthese reacties, het onderzoek naar verschillende dynamische gedragingen en de gelijktijdige de geleiding van meerdere variaties van een enkele reactie.
Ondanks het relatief eenvoudige fabricageproces van op PDMS gebaseerde apparaten, vereist het gebruik daarvan een uitgebreide hardware-installatie. Bestaande uit ventiel arrays, drukregelaars, druk pompen, incubators en koelunits, de overgang van fabricage naar gebruik is niet elementair en vereist een aanzienlijke initiële investering. Bovendien vereist de mogelijkheid om consistent te zetten en succesvol experimenten uit te voeren met deze apparaten een aanzienlijke tijdsinvestering; een punt dat dit manuscript beoogt aan te pakken. Echter, eenmaal op zijn plaats, de hele Setup kan worden gewijzigd voor een scala van doeleinden. Bovendien bevat de hardware-setup tal van modulaire elementen, die elk kunnen worden uitgebreid zodat complexere microfluïdische apparaatontwerpen kunnen worden gebruikt. Bovendien maakt het modulaire ontwerp het mogelijk om hardwarecomponenten te vervangen door soortgelijke functionerende alternatieven, zodat gebruikers niet beperkt zijn tot de specifieke instellingen die hier worden beschreven48,49.
Variabiliteit tussen afzonderlijke apparaten en in de externe omstandigheden (zoals drukschommelingen) kan leiden tot onnauwkeurigheden bij het uitvoeren van experimenten met deze apparaten. Om dit probleem aan te pakken, moet voorafgaand aan elk experiment een kalibratie van het systeem worden uitgevoerd, waarbij voor elk van de reactoren een unieke vernieuwings ratio wordt geboden. Terwijl de kalibratie de variaties van het apparaat-naar-apparaat en experiment-naar-experiment adresseert, is het een tijdrovend proces en niet foutloos. Vloeistoffen met verschillende viscositeiten zullen niet met dezelfde snelheid stromen bij blootstelling aan identieke druk, en als zodanig kan de kalibratie met meerdere reagentia geen identieke vernieuwings verhoudingenopleveren. Dit effect wordt verzwakt door het gebruik van drie controle kanalen om de reagentia peristaltisch te pompen in het microfluïdische apparaat, in tegenstelling tot het reguleren van de stroom door de meegeleverde druk alleen te variëren. Als laatste redmiddel in gevallen waarin de ongelijkheid in viscositeit zeer groot is, kan voor elk afzonderlijk reagens een unieke vernieuwings ratio worden geïmplementeerd door meerdere kalibratie-experimenten uit te voeren.
Het gebruik van een peristaltische pomp om reagentia te injecteren in het microfluïdische apparaat verzwakt de effecten van het gebruik van oplossingen met verschillende viscositeiten, maar creëert ook een secundair probleem. Het gebruik van discrete stappen om vloeistoffen in het microfluïdische apparaat te pompen, betekent dat de resolutie van injecties in één enkele reactor wordt beperkt door het volume dat wordt geïnjecteerd bij het uitvoeren van een enkele pomp cyclus. Binnen ons onderzoek is deze waarde, bepaald tijdens de kalibratie, ongeveer gelijk aan 1%, wat aangeeft dat een enkele pomp cyclus ongeveer 1% van het reactorvolume (ongeveer 0,1 nL) verplaatst. Als zodanig vereist het verplaatsen van 30% van het reactorvolume de uitvoering van 30 pomp cycli, waarbij 23 pomp cycli van de IVTT-reactie oplossing worden toegevoegd en er slechts 7 pomp cycli van DNA of ultrapuur water worden toegevoegd. Hoewel voldoende voor ons onderzoek, kunnen alternatieve experimentele protocollen problemen ondervinden bij het proberen om grotere aantallen unieke reagentia toe te voegen, een lagere vernieuwings fractiete gebruiken of kleinere volumes van één reagens aan een reactor toe te voegen. In dergelijke gevallen kan het ontwerp van het microfluïdische apparaat worden aangepast om reactoren met een groter volume te leveren. Een voorbeeld van dergelijke wordt gerapporteerd in Niederholtmeyer et al.36.
Cruciaal is dat het apparaat dat in dit manuscript wordt geschetst, reacties kan behouden voor langdurige duur, wat resulteert in een steady-state transcriptie en vertaal snelheid. Door het periodiek injecteren van nieuwe reagentia in de reactoren-en het verwijderen van reactie (by) producten-de reacties zijn aanhoudende en complexe dynamische gedragingen kunnen worden bewaakt. Op deze manier is er een platform gecreëerd dat-tot op zekere hoogte-de cellulaire omgeving nabootst. Bovendien maakt dit platform het mogelijk om de systeemdynamiek te verkennen, door de periode tussen injecties en de specifieke samenstelling van de injecties aan te passen. Als gevolg hiervan zijn deze meerlaagse microfluïdische apparaten een krachtig hulpmiddel voor de karakterisering en optimalisering van nieuwe synthetische netwerken die complex dynamisch gedrag vertonen.

Cellen zijn in staat om te voelen en te reageren op hun omgeving met behulp van complexe dynamische regelgevende netwerken1,2. Het gebied van synthetische biologie maakt gebruik van onze kennis van de natuurlijk voorkomende componenten die deze netwerken omvatten om biologische systemen te engineeren die de functionaliteit van de cellen3,4kunnen uitbreiden. Omgekeerd is het ook mogelijk om ons begrip van de natuurlijke netwerken die het leven beheerst te ontwikkelen door het ontwerpen van vereenvoudigde, synthetische analogen van bestaande circuits of door voorwaarts-technische biologische systemen die van nature voorkomende gedragingen vertonen. De de Novo engineering van dergelijke biologische systemen wordt uitgevoerd in een bottom-up mode waar nieuwe genetische circuits of signalerings trajecten op een rationele manier worden ontworpen, met behulp van goed gedefinieerde delen5,6. Het combineren van het rationele ontwerp van netwerken met het ontwerp van biologisch relevante systemen maakt de diepgaande karakterisering en studie van biologische regelgevingssystemen mogelijk met verschillende niveaus van abstractie7.
De pioniers werken van Elowitz en Leibler8 en Gardner et al.9 demonstreerden als eerste de succesvolle introductie van synthetische genetische netwerken in cellulaire hosts. In het volgende decennium, talrijke onderzoekers zijn blijven voortbouwen op deze eerste successen ondanks de opkomst van verschillende beperkingen met betrekking tot de invoering van synthetische circuits in cellen7,10,11 ,12. Idealiter zou de introductie van synthetische circuits in cellulaire hosts op een modulaire manier moeten plaatsvinden. Helaas, de complexiteit van de cellulaire omgeving maakt dit bijzonder uitdagend, met de functie van vele delen en netwerken zijn zeer contextafhankelijke12,13,14. Als gevolg hiervan, netwerken vaak ervaren ongewenste interacties met native host componenten die invloed kunnen zijn op de functie van het synthetische circuit. Evenzo kunnen componenten van het exogene netwerk hostprocessen remmen, concurreren voor gedeelde bronnen binnen de host en invloed hebben op de groei kinetiek15,16,17. Om het gedrag van synthetische netwerken in een in vivo-omgeving rationeel te kunnen ontwerpen en voorspellen, is daarom een uitgebreid model van alle host-en circuitspecifieke dynamiek vereist18.
Een levensvatbaar alternatief voor het gebruik van cellulaire hosts voor de karakterisering van synthetische netwerken is de toepassing van in vitro transcriptie-en vertaaltechnologieën (IVTT). Optreden als testbed voor synthetische netwerken, worden reacties uitgevoerd in oplossingen die alle componenten omvatten die nodig zijn om genexpressie19,20,21mogelijk te maken. Op deze manier wordt een biologisch relevante, zij het kunstmatige, omgeving gecreëerd waarbinnen synthetische netwerken kunnen worden getest22,23,24,25,26, 27,28. Een groot voordeel van het gebruik van IVTT-oplossingen is de mogelijkheid om reacties uit te voeren onder door de gebruiker gespecificeerde omstandigheden, waarbij onderzoekers de precieze samenstelling van elke reactie2kunnen afstemmen. Bovendien maakt de cel-vrije aanpak het testen van synthetische netwerken met hoge doorvoer mogelijk, omdat het de noodzaak elimineert om tijdrovende stappen voor het klonen van cellen uit te voeren. Hierdoor wordt de duur van opeenvolgende cycli van ontwerp-build-test aanzienlijk verlaagd29,30,31,32. De ontwerpcyclus kan verder worden versneld door gebruik te maken van celvrije kloontechnieken zoals de Gibson-assembly om nieuwe netwerken snel te engineeren, en door netwerken te bouwen van lineaire DNA-templates die-in tegenstelling tot de plasmiden die nodig zijn voor in vivo testen- kan worden versterkt via polymerase kettingreacties (PCR)33,34.
Batch reacties zijn de eenvoudigste methode waarmee IVTT-reacties kunnen worden uitgevoerd, waarbij een enkelvoudig reactie vaartuig vereist is, waarbij alle reactie componenten worden gecombineerd35. Dergelijke reacties zijn voldoende voor eiwit expressie en elementaire circuit testen maar blijken niet voldoende bij het bestuderen van het dynamische gedrag op lange termijn van een netwerk. In de loop van een batch reactie zijn reagentia uitgeput of worden ze afgebroken, wat resulteert in een continue afname van de transcriptie-en vertaal percentages. Bovendien, naarmate de reacties vooruitgang by-producten accumuleren die kunnen interfereren met-of volledig remmen-de juiste werking van het netwerk. Uiteindelijk beperkt het gebruik van batch reactoren het dynamische gedrag dat kan worden waargenomen, waarbij negatieve regulering bijzonder uitdagend is om5,36te implementeren.
De veelzijdigheid van ivtt-systemen maakt het mogelijk om meerdere alternatieve methoden te gebruiken waarmee langdurige ivtt-reacties kunnen worden uitgevoerd, variërend van continue stroom tot druppel methoden en eenvoudigere dialyse benaderingen2,30, 37,38,39,40. De toepassing van microfluïdische apparaten biedt gebruikers meer controle over hun reacties terwijl het verhogen van de doorvoer en het minimaliseren van de kosten35,41,42, met elke specifieke aanpak met zijn eigen voordelen. Het gebruik van continue stroom kan gemakkelijk worden geoptimaliseerd voor het verhogen van de expressie opbrengsten het onvermogen om specifieke reactieproducten effectief te verwijderen maakt echter de studie van dynamisch gedrag niet-triviaal39. Terwijl het gebruik van op basis van druppel gebaseerde microfluïdische systemen een high-throughput screening van nieuwe netwerken mogelijk maakt, is de moeilijkheid van het leveren van verse reagentia aan de reactie resulteert in de druppels die lijken op kleine volume batch reacties43. Dialyse-gebaseerde reactoren maken de introductie van verse reagentia mogelijk, evenals het verwijderen van sommige reactieproducten echter, RNA moleculen en grotere eiwitten accumuleren in de reactor, te groot om te diffuus door de membraan poriën. Bovendien zijn grote hoeveelheden reagentia nodig om deze reacties gedurende langere perioden van30,44te ondersteunen. In 2013, maerkl et al. presenteerde een meerlaagse microfluïdische inrichting speciaal ontworpen voor het uitvoeren van langdurige ivtt-reacties36,45. Het gebruik van meerlaagse microfluïdische apparaten maakt directe controle over de vloeistofstroom mogelijk, waardoor de omleiding van de stroom en de isolatie van vloeistof in specifieke gebieden van het apparaat46,47. Deze geïsoleerde gebieden kunnen functioneren als onafhankelijke nanoliter-reactie kamers waarin IVTT-reacties kunnen worden uitgevoerd. In de loop van een enkele IVTT-reactie worden periodieke injecties van verse reagentia in de reactor gebruikt om IVTT-componenten en DNA-templates aan te vullen. Tegelijkertijd wordt een gelijk volume van de oude reactie oplossing verplaatst, wat reactieproducten verwijdert. Op deze manier wordt een out-of-evenwichts omgeving gehandhaafd waar de basale transcriptie-en vertaal percentages in steady-state blijven, waardoor de levensduur van IVTT-reacties wordt voortgezet en er rijke dynamische gedragingen kunnen optreden. Door het toepassen van deze aanpak kunnen onderzoekers de kinetische percentages van de individuele processen die zich voordoen binnen een specifiek circuit onderzoeken, met als hulpmiddel de voorwaartse engineering van nieuwe genetische netwerken. Zo heeft Niederholtmeyer et al. deze benadering geïmplementeerd om verschillende elementen van een genetische ring oscillator te karakteriseren, waarbij de kinetische percentages daarvan worden bepaald36. In verdere studies toonde Yelleswarapu et al. aan dat de kinetische percentages van Sigma factor 28 (σ28), bepaald onder batch omstandigheden, onvoldoende waren om het gedrag van een σ28-gebaseerde oscillator te beschrijven, en dat de toevoeging van gegevens op basis van stroom verbeterde model voorspellingen van het netwerk gedrag22.
Het doel van dit manuscript is om een compleet protocol te presenteren voor de fabricage van meerlaagse microfluïdische apparaten die op lange termijn IVTT-reacties kunnen uitvoeren. Daarnaast zal dit manuscript alle hardware en software beschrijven die nodig zijn om langdurige IVTT-reacties uit te voeren. De bediening van het microfluïdische apparaat-noodzakelijk om de stroom van vloeistoffen daarin te regelen-wordt bereikt met behulp van een reeks pneumatische kleppen die rechtstreeks verbinding maken met de microfluïdische apparaten via lengtes van slangen. De pneumatische kleppen worden op hun beurt bediend via een op maat gemaakte virtuele bedieningsinterface. Vloeistofstroom binnen de microfluïdische apparaten wordt bereikt met behulp van continue druk die wordt geleverd door een commercieel beschikbaar druk regulatie systeem. IVTT-reacties worden meestal uitgevoerd tussen 29 °C en 37 °C en een Microscoop-incubator wordt gebruikt om de temperatuur te reguleren tijdens reacties. De functionaliteit van het IVTT-mengsel degradeert echter geleidelijk bij opslag boven 4 °C. Als zodanig zal dit manuscript worden uitgebreid op het off-chip koelsysteem dat wordt gebruikt om het IVTT-mengsel vóór de injectie in het microfluïdische apparaat te koelen. Concluderend, dit manuscript biedt een uitgebreid overzicht van de procedures die nodig zijn om met succes langdurige IVTT-reacties uit te voeren met behulp van een microfluïdische stroom reactor, zodat andere onderzoekers deze technologie kunnen repliceren met relatieve Gemak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

De beperkingen van de cel-gebaseerde synthetische biologie worden steeds duidelijker als onderzoekers zijn gericht op het ontwikkelen van grotere en complexere synthetische genetische regelgevings circuits. De analyse van synthetische genetische regulerings netwerken in vivo is tijdrovend en lijdt aan een gebrek aan milieucontrole, met exogene synthetische componenten die interactie hebben met hostprocessen, wat resulteert in ongewenst gedrag. Om deze problemen te overwinnen, wordt de celvrije karakterisering van de nieuwe circuits steeds vaker. In vitro transcriptie-en vertaal (IVTT) mengsels maken de regulering van de experimentele omgeving mogelijk en kunnen worden geoptimaliseerd voor elk uniek systeem. De protocollen hier gepresenteerd detail de fabricage van een meerlaagse microfluïdische apparaat dat kan worden gebruikt om te ondersteunen ivtt reacties voor langdurige duur. In tegenstelling tot batch reacties, waarbij de middelen in de loop der tijd uitgeput raken en (per-) producten zich ophopen, maakt het gebruik van microfluïdische apparaten de aanvulling van middelen mogelijk, evenals het verwijderen van reactieproducten. Op deze manier wordt de cellulaire omgeving geëmuleerd door een out-of-evenwichts omgeving te handhaven waarin het dynamische gedrag van gencircuits gedurende langere tijd kan worden onderzocht. Om het meerlaagse microfluïdische apparaat volledig te benutten, zijn hardware en software geïntegreerd om de ivtt-reacties te automatiseren. Door het combineren van IVTT-reacties met het microfluïdische platform dat hier wordt gepresenteerd, wordt het mogelijk om complexe netwerk gedragingen uitgebreid te analyseren, wat ons inzicht in de mechanismen die cellulaire processen reguleren bevorderen.

Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Het fabricageproces van een op PDMS gebaseerd, meerlaagse, microfluïdisch apparaat waarmee in vitro transcriptie-en vertalings Reacties (IVTT) gedurende langere perioden kunnen worden uitgevoerd, wordt beschreven. Bovendien wordt een uitgebreid overzicht gegeven van de hardware en software die nodig is voor het automatiseren en onderhouden van deze reacties voor langdurige duur.

Een Multilayer microfluidic platform voor de geleiding van langdurige cel-vrije genexpressie

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Prototyping synthetische gennetwerken wordt sterk verbeterd door het gebruik van celvrije genexpressiesystemen. Ons protocol beschrijft het fabricageproces voor meerlaagse microfluïde stroomreactor en laat zien dat een dergelijk apparaat kan worden gebruikt voor langdurige celvrije expressie van GFP. Celvrije eiwitexpressies in combinatie met microfluïde stroomreactoren vormen het rapid prototyping platform voor het ontwerp van synthetische biologische apparaten.Deze hele setup is zeer veelzijdig en kan worden aangepast voor de geleiding van biochemische of chemische reacties die een hoog niveau van controle vereisen. Het waarborgen van de stabiliteit van de celvrije reactieoplossing is cruciaal en moeilijk te bereiken. Zorg ervoor dat u zich richt op het verstrekken van voldoende koeling en gebruik maken van de slang die in dit protocol.Het fabriceren en voorbereiden van het experimentele platform vereist de verbinding van tal van individuele componenten, een proces dat moeilijk te volgen is zonder visuele hulpmiddelen. Om te beginnen volgt u in het bijbehorende tekstprotocol om het microfluïde apparaat te fabriceren en de pneumatische regel- en stroomdrukregeling in te stellen die zal worden gebruikt voor het regelen van de kleppen die van cruciaal belang zijn voor dit apparaat. Om de off-chip koeling op te zetten, begin met het oprollen van een lengte van PTFE-buizen op de koude vlak van een Peltier-element en zet de spoel vast met tape.Zorg ervoor dat het ene uiteinde van de PTFE-slang is aangesloten op reservoirs van het drukcontrolesysteem van de stroomlaag en dat het andere uiteinde niet meer dan één centimeter van het Peltier-oppervlak uitsteekt. Voeg vervolgens een lengte van vijf tot 10 centimeter van PEEK-buizen in het uitstekende uiteinde van de PTFE-slang. Breng een voldoende hoeveelheid thermische verbinding aan op de hete aandacht van het Peltier-element en plaats deze op de koude plaat van het waterblok.Zorg ervoor dat de slang, het Peltier-element en het koelblok te allen tijde met elkaar in contact staan. Sluit vervolgens het Peltier-element aan op de temperatuurregelaar met behulp van een seriële busconnector, zodat de spanning die aan de Peltier wordt geleverd kan worden geregeld. Plaats vervolgens een thermistor op het Peltier-oppervlak en sluit de output aan op de temperatuurregelaar.Pas na het inschakelen van de waterkoeler de aan de Peltier geleverde spanning aan tot de temperatuur stabiel is op vier graden Celsius. Voor elk controlekanaal van het microfluïde apparaat snijdt een lengte van standaard buizen die een meter lang. Aan de ene kant, steek de pin van een 23 meter, een halve inch Luer stomp en aan de andere kant steek een roestvrij stalen verbindingspen.Sluit de Luer stomp aan op een mannelijke Luer 3/32 inch prikkeldraad nylon connector en steek de weerhaak van de connector in een lengte van polyurethaan buizen. Steek deze polyurethaanbuizen direct in een van de solenoïde kleppen. Bevestig vervolgens een 23 meter halve inch Luer stomp aan een spuit en steek dit in een drie tot vier centimeter lang stuk standaard buizen.Plaats het open uiteinde van deze slang in een reservoir van ultra zuiver water en vul de spuit met ultra zuiver water. Nummer elk controlekanaal van het microfluïde apparaat zoals hier weergegeven. Voor de kanalen vier tot en met 29, zoek de bijbehorende slang en steek de metalen pin in het open uiteinde van de slang bevestigd aan de spuit.Injecteer vervolgens water in de leidingsbuizen tot de helft van de lengte is gevuld. Los vervolgens de slang los van de spuit en steek de roestvrijstalen connectorpin in het overeenkomstige gat van het microfluïde apparaat. Herhaal deze stap voor alle besturingskanalen.Gebruik nu de bedieningsinterface om alle solenoïde kleppen te openen. Dit zal de vloeistof onder druk zetten in de leiding kanaal buizen dwingen het in de microfluïde apparaat en het sluiten van alle membraan-gebaseerde kleppen in het apparaat. Voor elk van de ongekoelde reagentia gesneden een meter lengte van de standaard buizen om het reservoir uitlaat aan te sluiten op de microfluïde apparaat inlaten.Neem een uiteinde van de slang en steek dit in het reservoir ervoor te zorgen dat de slang bereikt de basis van het reservoir. De reservoirbuizenafzet moet zo worden aangedraaid dat een luchtdichte afdichting wordt bereikt. Steek vervolgens een roestvrije verbindingspin in het open uiteinde van de slang.Bevestig vervolgens een 23 meter halve inch Luer stomp aan het einde van een een milliliter spuit. Voeg een korte lengte van de standaard buizen aan de Luer stomp. Plaats het uiteinde van de slang in de gewenste reagensoplossing en vul de spuit met het reagens.Steek vervolgens de roestvrijstalen connectorpin in de polyurethaanbuis die op de spuit is aangesloten en vul de slang met het reagens. Bij het gebruik van kleine reactievolumes komt het reagens niet in het reservoir terecht en fungeert de slang zelf als reservoir. Los de spuit los en plaats de connectorpin in een van de inlaatgaten van de microfluïde van het microfluïde apparaat.Breng vervolgens druk uit op elk van de reservoirs met behulp van de drukregelaarsoftware om de reagentia in het microfluïde apparaat te dwingen. Zorg ervoor dat de waterkoeler en Peltier elementen zijn ingeschakeld met de oppervlaktetemperatuur van de Peltier ingesteld op vier graden Celsius. Monteer de koelset zo dicht mogelijk bij het microfluïde apparaat om het ongekoelde volume tussen de Peltier en de inlaat van het apparaat te minimaliseren.Sluit dan degene die de ene milliliter spuit aan een 23 meter halve inch Luer stomp met een korte lengte van de standaard buizen aan het einde. Teken in de te gekoelde reagens om de spuit te vullen. Sluit vervolgens de PEEK-slang aan op de spuit via de verbindingsbuizen en druk op de spuit die het reagens door de PEEK-buizen en in de PTFE-slang dwingt.Los ten slotte de PEEK-slang los van de spuit en plaats deze rechtstreeks in de stroomkanaalinlaten van het microfluïde apparaat. Wanneer de druk wordt uitgeoefend, wordt het gekoelde reagens in het microfluïde apparaat gedwongen. Zorg ervoor dat het microfluïde apparaat veilig is op het microscoopstadium met alle bedienings- en stroomlaagbuizen en sluit eventuele openingen op de couveuse.Stel vervolgens de omgevingstemperatuur van de couveuse in op 29 graden Celsius. Zorg er dan voor dat het koelsysteem is ingeschakeld en is ingesteld op vier graden Celsius voordat het experiment wordt gestart. Controleer of de druk die wordt uitgeoefend op de drukregelaar van het stroomkanaal is ingesteld op 800 millibar en met behulp van de software, de uitgangsdruk van elk individueel stroomkanaal instellen op tussen de 20 en 100 millibar.Controleer of de druk die wordt uitgeoefend op het controlekanaal solenoïde kleppen is een bar voor kanalen een tot en met acht en drie bar voor kanalen negen tot en met 29. Sluit vervolgens de uitlaat van het apparaat door kanaal 29 onder druk te zetten en tegelijkertijd de besturingskanalen één tot en met drie en 15 tot en met 28 te depressuriseren. Druk vervolgens selectief op de besturingskanalen van de multiplexer om één geselecteerd reagens in het apparaat te laten stromen.Gebruik de microscoop om het verwijderen van lucht te controleren en er vervolgens voor te zorgen dat alle reagentia correct stromen zonder luchtbellen in te voeren. Stel met behulp van het meegeleverde softwarepakket de gegevensvelden in die verband houden met het kalibratieproces zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Bepaal vervolgens het vloeistofvolume dat tijdens één instroomstap uit elke reactor wordt verplaatst door het kalibratieprotocol uit te voeren.Volg samen met de stappen die door de besturingssoftware worden gepresenteerd om de analyse van het kalibratie-experiment te voltooien en om de verversingsverhouding van elke ringreactor in het microfluïde apparaat te bepalen. Ten slotte stelt u de vereiste waarden in voor het gewenste experiment binnen de virtuele besturingsinterface. Start het experimentele protocol door op de experimentknop uit te voeren in de besturingsinterface.Tijdens een kalibratie-experiment worden de reactoren gevuld met een fluorofofre waarvan de intensiteit na elke verdunning wordt geregistreerd. De daling van de fluorescentieintensiteit per verdunning geeft het volume aan van de reactorring die wordt verplaatst voor het ingestelde aantal instroomstappen. Dit volume wordt de vernieuwingsverhouding genoemd.De gemiddelde verversingsratio en standaarddeviatie worden weergegeven voor elke verdunningsstap in rood. Zeven van de acht reactoren vertonen zeer vergelijkbaar gedrag, maar één reactor vertoont schommelingen na de zevende verdunningscyclus. Dit benadrukt de noodzaak van unieke refresh ratio's voor elk van de reactoren.De langdurige in vitro transcript en vertaling reactie hier getoond had 30% van de reactor volume verplaatst om de 14,6 minuten. Twee reactoren van de microfluïde inrichting waar gebruikt als losse flodders. Alle andere reactoren bestonden uit 75% in vitro transcriptie en vertaalreactieoplossing en 25% van ultra zuiver water of 2,5 nanomolar lineaire DNA-sjablonen die coderen voor de expressie van het deGFP-eiwit.In alle vier de reactoren waar DNA werd toegevoegd, was er duidelijke deGFP expressie. Eén reactor geeft een lager fluorescentiesignaal weer. Dit kan worden veroorzaakt door verschillen in stroom, wat resulteert in minder DNA dat de reactor binnenkomt of als gevolg van variaties in de reactorafmetingen.Na 14 uur, een plotselinge toename wordt gezien in het signaal van de reactoren met DNA. Dit wordt veroorzaakt door een luchtbel die de stroomlaag van het microfluïde apparaat binnendringt. Bij hervatting van de stroom keert het experiment terug naar de vorige fluorescentieintensiteit.Celvrije reactieoplossingen zijn na verloop van tijd onderhevig aan degradatie, tenzij ze voldoende gekoeld zijn, waardoor het koelproces beschreven in dit protocol van cruciaal belang is. Door de veelzijdigheid van het platform kunnen verschillende biochemische en chemische reacties op een nauwkeurige en gecontroleerde manier worden uitgevoerd. De toepassing van microfluïde stroomreactoren heeft opeenvolgende ontwerp build testcycli voor prototyping dubbele genetische circuits versneld.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cel Knijpen als een robuuste, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

De Multi-orgel Chip - Een Microfluïdische platform voor lange termijn Multi-weefsel Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-stap Variabele Hoogte fotolithografie voor Valved Multilayer microfluïdische apparaten

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluïdische Platform met multiplexverzending elektronische detectie voor ruimtelijke Tracking van Deeltjes

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Performance-testing Platform for a Conduction Micropump with an FR-4 Copper-clad Electrode Plate

Een Performance-testing Platform voor een geleiding Micropump met een plaat van de FR-4 koper beklede elektrode

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Beeldvorming van de morfologie van het haar van de wortel van Arabidopsis zaailingen in een twee-laag Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Een Microfluidic Platform voor het longitudinale beeldvorming in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cel-vrije eiwit expressie met behulp van de snel groeiende bacterie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...