Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le Conseil européen de la recherche, ERC (projet n. 677313 BioCircuit) une subvention nWO-VIDI de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO, 723.016.003), un financement du Ministère de l'éducation, de la culture et des sciences (Gravity 024.001.035 et 024.003.013), le Human Frontier Science Program Grant RGP0032/2015, le Conseil européen de la recherche dans le cadre du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne Grant 723106, et une subvention de la Fondation nationale suisse pour la science 200021_182019.

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Un dispositif microfluidique multicouche basé sur le PDMS a été présenté, et sa capacité à soutenir les réactions IVTT pendant de longues périodes de temps a été démontrée. Bien que bien adaptée à cet exemple spécifique, cette technologie peut être utilisée pour de nombreuses autres applications. Le contrôle supplémentaire sur le flux de fluide - jumelé à la capacité de réapprovisionner continuellement les réactifs de réaction tout en enlevant (par) les produits - est idéal pour les réactions de synthèse continue, l'étude de divers comportements dynamiques, et les simultanés conduction de multiples variations d'une seule réaction.
Malgré le processus de fabrication relativement simple des dispositifs basés sur PDMS, l'utilisation de celui-ci nécessite une configuration matérielle étendue. Comprenant des panneaux de vannes, des régulateurs de pression, des pompes à pression, des incubateurs et des unités de refroidissement, la transition de la fabrication à l'utilisation n'est pas élémentaire et nécessite un investissement initial important. En outre, la capacité de mettre en place et d'effectuer régulièrement des expériences réussies avec ces appareils nécessite un investissement de temps important; un point que ce manuscrit vise à aborder. Cependant, une fois en place, la configuration entière peut être modifiée pour une gamme de fins. En outre, la configuration matérielle comprend de nombreux éléments modulaires, dont chacun peut être élargi pour permettre des conceptions d'appareils microfluidiques plus complexes à employer. En outre, la conception modulaire permet le remplacement des composants matériels par des alternatives fonctionnant de la même manière, de sorte que les utilisateurs ne sont pas limités à la configuration spécifique décrite ici48,49.
La variabilité entre les différents appareils et dans les conditions externes (telles que les fluctuations de pression) peut entraîner des inexactitudes lors de l'exécution d'expériences à l'aide de ces dispositifs. Pour résoudre ce problème, un étalonnage du système devrait être effectué avant chaque expérience, fournissant un ratio de rafraîchissement unique pour chacun des réacteurs. Bien que l'étalonnage s'adresse aux variations de l'appareil à l'appareil et de l'expérience à l'expérience, il s'agit d'un processus qui prend beaucoup de temps et n'est pas sans faille. Les fluides avec des viscosités différentes ne circuleront pas avec le même taux lorsqu'ils sont exposés à une pression identique, et en tant que tels l'exécution de l'étalonnage avec plusieurs réactifs peuvent ne pas donner des ratiosde rafraîchissement identiques. Cet effet est atténué en utilisant trois canaux de contrôle pour pomper peristaltiquement les réactifs dans le dispositif microfluidique, plutôt que de réguler le flux en variant la pression fournie seulement. En dernier recours dans les cas où la disparité dans la viscosité est très grande, un ratio de rafraîchissement unique peut être mis en œuvre pour chaque réactif individuel en effectuant plusieurs expériences d'étalonnage.
L'utilisation d'une pompe péristétique pour injecter des réactifs dans le dispositif microfluidique atténue les effets de l'utilisation de solutions avec des viscosités variables, mais elle crée également un problème secondaire. L'utilisation d'étapes discrètes pour pomper les fluides dans le dispositif microfluidique, signifie que la résolution des injections dans un seul réacteur, est limitée par le volume injecté lors de l'exécution d'un cycle de pompe unique. Dans le cadre de nos recherches, cette valeur - déterminée pendant l'étalonnage - est à peu près égale à 1 %, ce qui indique qu'un seul cycle de pompe déplace environ 1 % du volume du réacteur (environ 0,1 nL). En tant que tel, le déplacement de 30% du volume du réacteur nécessite l'exécution de 30 cycles de pompe, avec 23 cycles de pompe de la solution de réaction IVTT ajouté, et seulement 7 cycles de pompe de l'ADN ou de l'eau ultrapure ajouté. Bien que suffisants pour nos recherches, d'autres protocoles expérimentaux peuvent rencontrer des problèmes lorsqu'ils tentent d'ajouter un plus grand nombre de réactifs uniques, d'utiliser une fractionde rafraîchissement plus faible ou d'ajouter de plus petits volumes d'un seul réactif à un réacteur. Dans de tels cas, la conception de l'appareil microfluidique peut être adaptée pour fournir aux réacteurs un volume plus important. Un exemple de tel est rapporté dans Niederholtmeyer et al.36.
Essentiellement, l'appareil décrit dans ce manuscrit permet de maintenir des réactions pendant des durées prolongées, ce qui entraîne des taux de transcription et de traduction à taux d'état stable. En injectant périodiquement de nouveaux réactifs dans les réacteurs - et en supprimant les réactions (par) produits - les réactions sont soutenues et des comportements dynamiques complexes peuvent être surveillés. De cette façon, une plate-forme a été créée qui - dans une certaine mesure - imite l'environnement cellulaire. En outre, cette plate-forme permet l'exploration de la dynamique du système, en adaptant la période entre les injections et la composition spécifique des injections. En conséquence, ces dispositifs microfluidiques multicouches sont un outil puissant pour la caractérisation et l'optimisation de nouveaux réseaux synthétiques qui affichent un comportement dynamique complexe.

Les cellules sont capables de détecter et de répondre à leur environnement à l'aide de réseaux de réglementation dynamiques complexes1,2. Le domaine de la biologie synthétique utilise notre connaissance des composants naturels qui composent ces réseaux pour concevoir des systèmes biologiques qui peuvent étendre la fonctionnalité des cellules3,4. Inversement, il est également possible de mieux comprendre les réseaux naturels qui régissent la vie en concevant des analogues simplifiés et synthétiques des circuits existants ou en mettant en avant des systèmes biologiques qui présentent des comportements naturels. L'ingénierie de novo de ces systèmes biologiques est effectuée de façon ascendante où de nouveaux circuits génétiques ou voies de signalisation sont conçus de manière rationnelle, en utilisant des parties bien définies5,6. La combinaison de la conception rationnelle des réseaux avec la conception de systèmes biologiquement pertinents permet la caractérisation et l'étude approfondies des systèmes de régulation biologique avec différents niveaux d'abstraction7.
Les œuvres pionnières d'Elowitz et Leibler8 et Gardner etcoll. 9 ont été les premières à démontrer l'introduction réussie de réseaux génétiques synthétiques dans les hôtes cellulaires. Au cours de la décennie suivante, de nombreux chercheurs ont continué à s'appuyer sur ces premiers succès malgré l'émergence de plusieurs limitations concernant l'introduction de circuits synthétiques dans les cellules7,10,11 ,12. Idéalement, l'introduction de circuits synthétiques dans les hôtes cellulaires devrait se faire de façon modulaire. Malheureusement, la complexité de l'environnement cellulaire rend cela particulièrement difficile, avec la fonction de nombreuses pièces et réseaux étant très dépendant du contexte12,13,14. En conséquence, les réseaux éprouvent souvent des interactions indésirables avec les composants de l'hôte natif qui peuvent affecter la fonction du circuit synthétique. De même, les composants du réseau exogène peuvent inhiber les processus de l'hôte, rivaliser pour les ressources partagées au sein de l'hôte, et influencer la cinétique de croissance15,16,17. Par conséquent, afin de concevoir et de prédire rationnellement le comportement des réseaux synthétiques dans un environnement in vivo, un modèle complet de toutes les dynamiques spécifiques à l'hôte et au circuit est nécessaire18.
Une alternative viable à l'utilisation d'hôtes cellulaires pour la caractérisation des réseaux synthétiques est l'application de technologies de transcription et de traduction in vitro (IVTT). Agissant comme un banc d'essai pour les réseaux synthétiques, les réactions sont effectuées dans des solutions comprenant tous les composants nécessaires pour permettre l'expression des gènes19,20,21. De cette manière, un environnement biologiquement pertinent, quoique artificiel, est créé dans lequel les réseaux synthétiques peuvent être testés22,23,24,25,26, 27,28. Un avantage majeur de l'utilisation des solutions IVTT est la capacité d'effectuer des réactions dans des conditions spécifiées par l'utilisateur, avec des chercheurs capables d'ajuster la composition précise de chaque réaction2. En outre, l'approche sans cellules permet des tests à haut débit des réseaux synthétiques, car elle élimine la nécessité d'effectuer des étapes de clonage cellulaire qui prennent beaucoup de temps. En conséquence, la durée de la conception successive - construire - cycles d'essai est considérablement réduite29,30,31,32. Le cycle de conception peut être encore accéléré en utilisant des techniques de clonage sans cellules telles que l'assemblage Gibson pour concevoir rapidement de nouveaux réseaux, et en construisant des réseaux à partir de modèles d'ADN linéaires qui - contrairement aux plasmides requis pour les essais in vivo - peut être amplifié par des réactions en chaîne de polymérase (PCR)33,34.
Les réactions par lots sont la méthode la plus simple par laquelle les réactions IVTT peuvent être effectuées, nécessitant un seul vaisseau de réaction dans lequel tous les composants de réaction sont combinés35. De telles réactions sont suffisantes pour l'expression des protéines et les tests de circuit de base, mais s'avèrent insuffisantes lorsque l'on tente d'étudier le comportement dynamique à long terme d'un réseau. Au cours d'une réaction par lots, les réactifs sont soit épuisés, soit dégradations, ce qui entraîne une diminution continue des taux de transcription et de traduction. En outre, au fur et à mesure que les réactions progressent, les sous-produits s'accumulent qui peuvent interférer - ou inhiber complètement - le bon fonctionnement du réseau. En fin de compte, l'utilisation de réacteurs par lots limite le comportement dynamique qui peut être observé, avec une réglementation négative étant particulièrement difficile à mettre en œuvre5,36.
La polyvalence des systèmes IVTT permet de multiples méthodes alternatives par lesquelles des réactions IVTT prolongées peuvent être effectuées, allant du flux continu aux méthodes basées sur les gouttelettes ainsi que des approches de dialyse plus simples2,30, 37,38,39,40. L'application d'appareils microfluidiques offre aux utilisateurs un contrôle accru sur leurs réactions tout en augmentant le débit et en minimisant les coûts35,41,42, chaque approche spécifique ayant son propres avantages. L'utilisation du flux continu peut être facilement optimisée pour augmenter les rendements d'expression cependant, l'incapacité de supprimer efficacement les produits de réaction spécifiques rend l'étude du comportement dynamique non négligeable39. Bien que l'utilisation de systèmes microfluidiques à base de gouttelettes permet le dépistage à haut débit de nouveaux réseaux, la difficulté de fournir de nouveaux réactifs à la réaction entraîne des gouttelettes ressemblant à des réactions de lots de petit volume43. Les réacteurs à base de dialyse permettent l'introduction de réactifs frais ainsi que l'élimination de certains produits de réaction cependant, les molécules d'ARN et les protéines plus grandes s'accumulent dans le réacteur, étant trop grandes pour être diffusées à travers les pores de la membrane. En outre, de grands volumes de réactifs sont nécessaires pour soutenir ces réactions pendant de longues périodes30,44. En 2013, Maerkl et coll. ont présenté un dispositif microfluidique multicouches conçu spécifiquement pour effectuer des réactions IVTT prolongées36,45. L'utilisation d'appareils microfluidiques multicouches permet un contrôle direct sur le flux de fluide, permettant la réorientation du débit ainsi que l'isolement du fluide dans des régions spécifiques de l'appareil46,47. Ces régions isolées peuvent fonctionner comme des chambres de réaction indépendantes à l'échelle nanolitre dans laquelle des réactions IVTT peuvent être effectuées. Au cours d'une seule réaction IVTT, des injections périodiques de réactifs frais dans le réacteur sont utilisées pour reconstituer les composants IVTT et les modèles d'ADN. Simultanément, un volume égal de l'ancienne solution de réaction est déplacé, en supprimant les produits de réaction. De cette manière, un environnement hors d'équilibre est maintenu où les taux de transcription et de traduction basal restent en état stable, prolongeant la durée de vie des réactions iVTT et permettant aux comportements dynamiques riches de se produire. En appliquant cette approche, les chercheurs sont en mesure d'étudier les taux cinétiques des processus individuels se produisant dans un circuit spécifique, en aidant à l'ingénierie prospective de nouveaux réseaux génétiques. Par exemple, Niederholtmeyer et coll. ont mis en œuvre cette approche pour caractériser divers éléments d'un oscillateur d'anneau génétique, en déterminant les taux cinétiques de36. Dans d'autres études, Yelleswarapu et coll. ont montré que les taux cinétiques du facteur sigma 28(28) déterminés dans des conditions de lots étaient insuffisants pour décrire le comportement d'un oscillateur basé sur28et que l'ajout de données basées sur le flux prévisions de modèle améliorées du comportement du réseau22.
L'objectif de ce manuscrit est de présenter un protocole complet pour la fabrication d'appareils microfluidiques multicouches capables d'effectuer des réactions IVTT à long terme. En outre, ce manuscrit décrira tout le matériel et le logiciel nécessaires pour effectuer des réactions prolongées IVTT. L'actionnement du dispositif microfluidique - nécessaire pour contrôler le flux de fluides qui s'y trouve - est réalisé à l'aide d'une série de valves pneumatiques qui se connectent directement aux dispositifs microfluidiques par l'intermédiaire de longueurs de tubes. À leur tour, les vannes pneumatiques sont contrôlées via une interface de contrôle virtuelle sur mesure. L'écoulement des fluides à l'intérieur des dispositifs microfluidiques est réalisé à l'aide d'une pression continue qui est fournie par un système de régulation de la pression disponible dans le commerce. Les réactions IVTT sont généralement effectuées entre 29 et 37 oC et un incubateur de microscope est utilisé pour réguler la température pendant les réactions. Cependant, la fonctionnalité du mélange IVTT se dégrade progressivement lorsqu'elle est stockée au-dessus de 4 oC. En tant que tel, ce manuscrit s'étendra sur le système de refroidissement hors puce utilisé pour refroidir le mélange IVTT avant l'injection dans le dispositif microfluidique. En conclusion, ce manuscrit fournit un aperçu complet des procédures requises pour effectuer avec succès des réactions IVTT prolongées à l'aide d'un réacteur à débit microfluidique de sorte que d'autres chercheurs seront en mesure de reproduire cette technologie avec des aisance.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

Les limites de la biologie synthétique à base cellulaire deviennent de plus en plus évidentes à mesure que les chercheurs cherchent à mettre au point des circuits de régulation génétique synthétique plus vaste et plus complexe. L'analyse des réseaux de régulation génétiques synthétiques in vivo prend du temps et souffre d'un manque de contrôle environnemental, avec des composants synthétiques exogènes interagissant avec les processus de l'hôte entraînant un comportement indésirable. Pour surmonter ces problèmes, la caractérisation sans cellules des circuits nouveaux est de plus en plus répandue. Les mélanges de transcription et de traduction in vitro (IVTT) permettent la régulation de l'environnement expérimental et peuvent être optimisés pour chaque système unique. Les protocoles présentés ici détaillent la fabrication d'un dispositif microfluidique multicouche qui peut être utilisé pour soutenir les réactions IVTT pendant de longues durées. Contrairement aux réactions par lots, où les ressources s'épuisent au fil du temps et que les produits (par-) s'accumulent, l'utilisation de dispositifs microfluidiques permet de reconstituer les ressources ainsi que de retirer les produits de réaction. De cette façon, l'environnement cellulaire est imité en maintenant un environnement hors d'équilibre dans lequel le comportement dynamique des circuits génétiques peut être étudié sur de longues périodes de temps. Afin d'exploiter pleinement le dispositif microfluidique multicouches, le matériel et le logiciel ont été intégrés pour automatiser les réactions IVTT. En combinant les réactions IVTT avec la plate-forme microfluidique présentée ici, il devient possible d'analyser en profondeur les comportements de réseau complexes, en améliorant notre compréhension des mécanismes qui régulent les processus cellulaires.

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A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Le processus de fabrication d'un dispositif microfluidique à base de PDMS, multicouches, qui permet d'effectuer des réactions de transcription et de traduction in vitro (IVTT) sur de longues périodes est décrit. En outre, un aperçu complet du matériel et des logiciels nécessaires pour automatiser et maintenir ces réactions pendant de longues durées est fourni.

Une plate-forme microfluidique multicouche pour la conduite d'une expression génique prolongée sans cellules

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Le prototypage des réseaux génétiques synthétiques est grandement amélioré par l’utilisation de systèmes d’expression génétique sans cellules. Notre protocole décrit le processus de fabrication du réacteur à flux microfluidique multicouche et montre qu’un tel dispositif peut être utilisé pour l’expression prolongée de GFP sans cellules. Les expressions protéiques sans cellules, combinées à des réacteurs à débit microfluidique, constituent la plate-forme de prototypage rapide pour la conception de dispositifs biologiques synthétiques.Toute cette configuration est très polyvalente et peut être adaptée à la conduction de toutes les réactions biochimiques ou chimiques nécessitant des niveaux élevés de contrôle. Il est essentiel et difficile d’assurer la stabilité de la solution de réaction sans cellules. Assurez-vous de vous concentrer sur la fourniture d’un refroidissement suffisant et d’utiliser le tube spécifié dans ce protocole.La fabrication et la préparation de la plate-forme expérimentale nécessitent la connexion de nombreux composants individuels, un processus qui peut être difficile à suivre sans aides visuelles. Pour commencer, suivez le protocole texte qui l’accompagne pour fabriquer l’appareil microfluidique et mettre en place le contrôle pneumatique et la régulation de la pression d’écoulement qui seront utilisés pour contrôler les valves essentielles à cet appareil. Pour configurer le refroidissement hors puce, commencez par encmenter une longueur de tube PTFE sur la face froide d’un élément Peltier et fixez la bobine avec du ruban adhésif.Assurez-vous qu’une extrémité du tube PTFE est reliée aux réservoirs du système de contrôle de la pression de la couche d’écoulement et que l’autre extrémité ne dépasse pas un centimètre de la surface Peltier. Ensuite, insérez une longueur de cinq à 10 centimètres de tube PEEK dans l’extrémité saillante du tube PTFE. Appliquer une quantité suffisante de composé thermique sur la face chaude de l’élément Peltier et le placer sur la plaque froide du bloc d’eau.Assurez-vous que le tube, l’élément Peltier et le bloc de refroidissement sont en contact direct les uns avec les autres en tout temps. Ensuite, connectez l’élément Peltier au contrôleur de température à l’aide d’un connecteur de bus en série afin que la tension fournie au Peltier puisse être régulée. Ensuite, placez solidement un thermistor sur la surface Peltier et connectez sa sortie au contrôleur de température.Après avoir activé le refroidisseur d’eau, adaptez la tension fournie au Peltier jusqu’à ce que la température soit stable à quatre degrés Celsius. Pour chaque canal de commande de l’appareil microfluidique couper une longueur de tube standard qui est d’un mètre de long. À une extrémité, insérez la goupille d’une jauge 23, d’un talon Luer d’un demi-pouce et, à l’autre extrémité, insérez une goupille de raccordement en acier inoxydable.Connectez le talon Luer à un connecteur en nylon barbelé mâle Luer de 3/32 pouces et insérez la barbe du connecteur dans une longueur de tube en polyuréthane. Insérez ensuite ce tube en polyuréthane directement dans l’une des valves solénoïdes. Ensuite, fixez un talon Luer de 23 jauges d’un demi-pouce à une seringue et insérez-le dans un morceau de tube standard de trois à quatre centimètres de long.Placez l’extrémité ouverte de ce tube dans un réservoir d’eau ultra pure et remplissez la seringue d’eau ultra pure. Numérotez chaque canal de commande de l’appareil microfluidique comme indiqué ici. Pour les canaux 4 à 29, trouvez le tube correspondant et insérez la goupille métallique dans l’extrémité ouverte du tube fixé à la seringue.Injectez ensuite de l’eau dans le canal de commande jusqu’à ce que la moitié de la longueur ait été remplie. Ensuite, déconnectez le tube de la seringue et insérez la goupille du connecteur en acier inoxydable dans le trou correspondant de l’appareil microfluidique. Répétez cette étape pour tous les canaux de contrôle.Maintenant, utilisez l’interface de commande pour ouvrir toutes les valves solénoïdes. Cela va pressuriser le fluide dans le canal de commande tube le forçant dans le dispositif microfluidique et la fermeture de toutes les valves à base de membranes à l’intérieur de l’appareil. Pour chacun des reagents non cooled couper une longueur de mètre de tube standard pour connecter la sortie du réservoir aux entrées de périphérique microfluidique.Prenez une extrémité du tube et insérez-la dans le réservoir pour vous assurer que le tube atteint la base du réservoir. La sortie de tubes du réservoir doit être resserré afin qu’un joint hermétique soit atteint. Ensuite, insérez une goupille de raccordement inoxydable dans l’extrémité ouverte du tube.Ensuite, fixez un talon Luer de 23 jauges d’un demi-pouce à l’extrémité d’une seringue d’un millilitre. Ajoutez une courte longueur de tube standard au talon Luer. Placez l’extrémité du tube dans la solution de reagent désirée et remplissez la seringue avec le reagent.Insérez ensuite la goupille du connecteur en acier inoxydable dans le tube en polyuréthane relié à la seringue et remplissez le tube avec le reagent. Lors de l’utilisation de petits volumes de réaction, le reagent n’entrera pas dans le réservoir et le tube lui-même agira comme réservoir. Une fois terminée, déconnecter la seringue et insérer la goupille du connecteur dans l’un des trous d’entrée de la couche d’écoulement de l’appareil microfluidique.Appliquez ensuite une pression sur chacun des réservoirs à l’aide du logiciel de régulateur de pression pour forcer les réadiants à entrer dans l’appareil microfluidique. Assurez-vous que le refroidisseur d’eau et les éléments Peltier ont été activés avec la température de surface du Peltier réglée à quatre degrés Celsius. Montez la configuration de refroidissement aussi près que possible de l’appareil microfluidique afin de minimiser le volume non refroidi entre le Peltier et l’entrée de l’appareil.Ensuite, connectez celui de la seringue d’un millilitre à un talon Luer de 23 jauges d’un demi-pouce avec une courte longueur de tube standard fixée à l’extrémité. Dessinez dans le reagent à refroidir pour remplir la seringue. Ensuite, connectez le tube PEEK à la seringue par le tube conjonctif et appliquez une pression constante sur la seringue forçant le reagent à travers le tube PEEK et dans le tube PTFE.Débranchez enfin le tube PEEK de la seringue et insérez-le directement dans les entrées du canal d’écoulement de l’appareil microfluidique. Lorsque la pression est appliquée, le reagent refroidi sera forcé dans le dispositif microfluidique. Assurez-vous que le dispositif microfluidique est fixé sur la scène du microscope avec tous les tubes de commande et de couche d’écoulement attachés et fermez toutes les ouvertures sur l’incubateur.Ensuite, réglez la température ambiante de l’incubateur à 29 degrés Celsius. Ensuite, assurez-vous que le système de refroidissement a été allumé et est réglé à quatre degrés Celsius avant le début de l’expérience. Vérifiez que les pressions appliquées au régulateur de pression du canal d’écoulement sont réglées à 800 millibar et à l’aide du logiciel, réglez la pression de sortie de chaque canal de flux individuel entre 20 et 100 millibar.Vérifiez que les pressions exercées sur les valves solénoïdes du canal de commande sont une barre pour les canaux une à huit et trois barres pour les canaux neuf à 29. Ensuite, fermez la prise de l’appareil en pressurisant le canal 29 et dépressurisez simultanément les canaux de commande un à trois et de 15 à 28. Dépressurisez ensuite sélectivement les canaux de commande du multiplexeur pour permettre à un seul réaccérateur sélectionné de s’écouler dans l’appareil.Utilisez le microscope pour surveiller l’élimination de l’air et par la suite s’assurer que tous les reagents circulent correctement sans introduire de bulles d’air. À l’aide du logiciel fourni, configurer les champs de données liés au processus d’étalonnage décrits dans le protocole texte qui l’accompagne. Déterminez ensuite le volume de liquide déplacé de chaque réacteur au cours d’une seule étape d’entrée en exécutant le protocole d’étalonnage.Suivez les étapes présentées par le logiciel de contrôle pour compléter l’analyse de l’expérience d’étalonnage et déterminer le rapport de rafraîchissement de chaque réacteur à terminaisons dans le dispositif microfluidique. Enfin, définissez les valeurs requises pour l’expérience souhaitée dans l’interface de contrôle virtuel. Lancez le protocole expérimental en appuyant sur le bouton d’expérience perform dans l’interface de contrôle.Au cours d’une expérience d’étalonnage, les réacteurs sont remplis d’un fluorophore dont l’intensité est enregistrée après chaque dilution. La diminution de l’intensité de fluorescence par dilution révèle le volume de l’anneau du réacteur déplacé pour le nombre défini d’étapes d’entrée. Ce volume est appelé le rapport de rafraîchissement.Le rapport de rafraîchissement moyen et l’écart type sont indiqués pour chaque étape de dilution en rouge. Sept des huit réacteurs présentent un comportement très similaire, mais un réacteur montre des fluctuations après le septième cycle de dilution. Cela met en évidence la nécessité de ratios de rafraîchissement uniques pour chacun des réacteurs.La transcription in vitro prolongée et la réaction de traduction montrée ici ont eu 30% du volume de réacteur déplacé toutes les 14.6 minutes. Deux réacteurs de l’appareil microfluidique lorsqu’il est utilisé comme blancs. Tous les autres réacteurs comprenaient 75% de solution de transcription in vitro et de réaction de traduction et 25% d’eau ultra pure ou 2,5 modèles d’ADN linéaire nanomolaire codant pour l’expression de la protéine deGFP.Dans les quatre réacteurs où l’ADN a été ajouté, il y avait une expression claire deGFP. Un réacteur affiche un signal de fluorescence plus faible. Cela pourrait être causé par une disparité de débit entraînant une réduction de l’ADN entrant dans le réacteur ou par des variations dans les dimensions du réacteur.Après 14 heures, une augmentation soudaine est observée dans le signal des réacteurs contenant de l’ADN. Ceci est causé par une bulle d’air entrant dans la couche d’écoulement du dispositif microfluidique. À la reprise du flux, l’expérience revient à son intensité de fluorescence précédente.Les solutions de réaction sans cellules sont sujettes à dégradation au fil du temps à moins qu’elles ne soient suffisamment refroidies, ce qui rend le processus de refroidissement décrit dans ce protocole d’une importance critique. En raison de la polyvalence de la plate-forme, une variété de réactions biochimiques et chimiques peuvent être menées d’une manière précise et contrôlée. L’application de réacteurs à débit microfluidique a accéléré les cycles successifs d’essai de conception pour le prototypage des doubles circuits génétiques.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Recherche

Bio-ingénierie

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