Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat, ERC (Projekt n. 677313 BioCircuit) unterstützt, einem NWO-VIDI-Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO, 723.016.003), mit Mitteln des Ministeriums für Bildung, Kultur und Wissenschaft (Gravity 024.001.035 & 024.003.013), das Human Frontier Science Program Grant RGP0032/2015, den European Research Council im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizont 2020 der Europäischen Union Grant 723106 und einen Stipendium der Schweizerischen Nationalstiftung 200021_182019.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Ein mikrofluidisches Gerät auf PDMS-Basis wurde vorgestellt, und seine Fähigkeit, IVTT-Reaktionen über einen längeren Zeitraum aufrecht zu erhalten, wurde nachgewiesen. Obwohl diese Technologie für dieses spezifische Beispiel gut geeignet ist, kann sie für zahlreiche andere Anwendungen eingesetzt werden. Die zusätzliche Kontrolle des Flüssigkeitsflusses - gepaart mit der Fähigkeit, Reaktionsreagenzien kontinuierlich aufzufüllen und gleichzeitig (durch) Produkte zu entfernen - ist ideal für kontinuierliche Synthesereaktionen, die Untersuchung verschiedener dynamischer Verhaltensweisen und die gleichzeitige Leitung mehrerer Variationen einer einzelnen Reaktion.
Trotz des relativ einfachen Fertigungsprozesses von PDMS-basierten Geräten erfordert deren Verwendung eine umfangreiche Hardware-Einrichtung. Der Übergang von der Fertigung zur Verwendung besteht aus Ventilanordnungen, Druckreglern, Druckpumpen, Inkubatoren und Kühlaggregaten und erfordert keine erheblichen Anfangsinvestitionen. Darüber hinaus erfordert die Fähigkeit, konsequent emittierende Experimente mit diesen Geräten durchzuführen, eine erhebliche Zeitinvestition; ein Punkt, auf den dieses Manuskript eingehen soll. Sobald sie jedoch eingerichtet ist, kann das gesamte Setup für eine Reihe von Zwecken geändert werden. Darüber hinaus umfasst die Hardware-Einrichtung zahlreiche modulare Elemente, die jeweils erweitert werden können, um komplexere mikrofluidische Gerätekonstruktionen zum Einsatz zu veranlassen. Darüber hinaus ermöglicht der modulare Aufbau den Austausch von Hardwarekomponenten durch ähnlich funktionierende Alternativen, so dass die Benutzer nicht auf die hier beschriebene spezifische Einrichtung beschränkt sind48,49.
Die Variabilität zwischen einzelnen Geräten und unter den äußeren Bedingungen (z. B. Druckschwankungen) kann bei der Durchführung von Experimenten mit diesen Geräten zu Ungenauigkeiten führen. Um dieses Problem zu beheben, sollte vor jedem Experiment eine Kalibrierung des Systems durchgeführt werden, die ein eindeutiges Aktualisierungsverhältnis für jeden der Reaktoren bereitstellt. Während die Kalibrierung die Geräte-zu-Gerät- und Experiment-zu-Experiment-Variationen adressiert, ist es ein zeitaufwändiger Prozess und nicht einwandfrei. Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Viskositäten fließen nicht mit der gleichen Rate, wenn sie identischem Druck ausgesetzt sind, und als solche führt die Kalibrierung mit mehreren Reagenzien möglicherweise nicht zu identischen Refresh Ratios. Dieser Effekt wird durch den Einsatz von drei Steuerkanälen abgeschwächt, um die Reagenzien peristaltisch in das mikrofluidische Gerät zu pumpen, anstatt den Durchfluss nur durch Variation des zugeführten Drucks zu regulieren. Als letztes Mittel in Fällen, in denen die Viskositätsunterschiede sehr groß sind, kann für jedes einzelne Reagenz ein einzigartiges Refresh Ratio implementiert werden, indem mehrere Kalibrierungsexperimente durchgeführt werden.
Die Verwendung einer peristaltischen Pumpe zur Injektion von Reagenzien in das mikrofluidische Gerät dämt die Auswirkungen der Verwendung von Lösungen mit unterschiedlichen Viskositäten ab, schafft aber auch ein sekundäres Problem. Die Verwendung diskreter Schritte, um Flüssigkeiten in das mikrofluidische Gerät zu pumpen, bedeutet, dass die Auflösung von Injektionen in einen einzelnen Reaktor durch das Volumen begrenzt wird, das bei der Durchführung eines einzelnen Pumpenzyklus injiziert wird. Innerhalb unserer Forschung beträgt dieser Wert - der während der Kalibrierung ermittelt wurde - ungefähr 1%, was darauf hindeutet, dass ein einzelner Pumpenzyklus etwa 1% des Reaktorvolumens (ca. 0,1 nL) verdrängt. Daher erfordert die Verdrängung von 30 % des Reaktorvolumens die Ausführung von 30 Pumpenzyklen, wobei 23 Pumpenzyklen der IVTT-Reaktionslösung hinzugefügt und nur 7 Pumpenzyklen von DNA oder Reinstwasser hinzugefügt werden. Obwohl alternative versuchsweise, Probleme zu vermeiden, können alternative Versuchsprotokolle Probleme auftreten, wenn sie versuchen, eine größere Anzahl einzigartiger Reagenzien hinzuzufügen, eine niedrigere Refresh Fractionzu verwenden oder einem Reaktor kleinere Volumina eines einzelnen Reagenzes hinzuzufügen. In solchen Fällen kann das Mikrofluid-Gerätedesign angepasst werden, um Reaktoren ein größeres Volumen zu bieten. Ein Beispiel dafür ist in Niederholtmeyer et al.36berichtet.
Entscheidend ist, dass das in diesem Manuskript beschriebene Gerät es ermöglicht, Reaktionen über einen längeren Zeitraum aufrecht zu erhalten, was zu stationären Transkriptions- und Übersetzungsraten führt. Durch periodische Injektion neuer Reagenzien in die Reaktoren - und Entfernen von Reaktion (durch) Produkte - werden die Reaktionen nachhaltig und komplexe dynamische Verhaltensweisen überwacht werden. Auf diese Weise wurde eine Plattform geschaffen, die - bis zu einem gewissen Grad - die zelluläre Umgebung imitiert. Darüber hinaus ermöglicht diese Plattform die Erforschung der Systemdynamik, indem der Zeitraum zwischen den Injektionen und der spezifischen Zusammensetzung der Injektionen angepasst wird. Daher sind diese mehrschichtigen mikrofluidischen Geräte ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung und Optimierung neuartiger synthetischer Netzwerke, die komplexes dynamisches Verhalten aufweisen.

Zellen sind in der Lage, ihre Umgebung mithilfe komplexer dynamischer Regulierungsnetzwerke zu erkennen und darauf zu reagieren1,2. Der Bereich der Synthetischen Biologie nutzt unser Wissen über die natürlich vorkommenden Komponenten, die diese Netzwerke umfassen, um biologische Systeme zu entwickeln, die die Funktionalität von Zellen erweitern können3,4. Umgekehrt ist es auch möglich, unser Verständnis der natürlichen Netzwerke, die das Leben bestimmen, durch die Entwicklung vereinfachter, synthetischer Analoga bestehender Schaltkreise oder durch vorwärtsgerichtete biologische Systeme, die natürlich vorkommende Verhaltensweisen aufweisen, zu fördern. Die De-novo-Engineering solcher biologischen Systeme wird in einer Bottom-up-Manier durchgeführt, wo neuartige genetische Schaltkreise oder Signalwege auf rationale Weise mit den genau definierten Teilen5,6entwickelt werden. Die Kombination der rationellen Gestaltung von Netzwerken mit der Entwicklung biologisch relevanter Systeme ermöglicht die tiefgehende Charakterisierung und Untersuchung biologischer Regulierungssysteme mit verschiedenen Abstraktionsebenen7.
Die Pionierarbeiten von Elowitz und Leibler8 und Gardner et al.9 waren die ersten, die die erfolgreiche Einführung synthetischer genetischer Netzwerke in zelluläre Wirte demonstrierten. In den folgenden zehn Jahren haben zahlreiche Forscher weiter auf diesen anfänglichen Erfolgen aufgebaut, trotz der Entstehung mehrerer Einschränkungen in Bezug auf die Einführung synthetischer Schaltkreise in Die Zellen7,10,11 ,12. Idealerweise sollte die Einführung synthetischer Schaltungen in zelluläre Wirte modular erfolgen. Leider macht die Komplexität der zellulären Umgebung dies besonders schwierig, wobei die Funktion vieler Teile und Netzwerke stark kontextabhängig ist12,13,14. Infolgedessen treten in Netzwerken häufig unerwünschte Interaktionen mit nativen Hostkomponenten auf, die die Funktion der synthetischen Schaltung beeinträchtigen können. Ebenso können Komponenten des exogenen Netzwerks Hostprozesse hemmen, um gemeinsam genutzte Ressourcen innerhalb des Hosts konkurrieren und die Wachstumskinetik15,16,17beeinflussen. Um das Verhalten synthetischer Netzwerke in einer In-vivo-Umgebung rational zu gestalten und vorherzusagen, ist daher ein umfassendes Modell aller host- und schaltungsspezifischen Dynamiken erforderlich18.
Eine praktikable Alternative zur Verwendung von Zellhosts zur Charakterisierung synthetischer Netzwerke ist die Anwendung von In-vitro-Transkriptions- und -übersetzungstechnologien (IVTT). Als Teststand für synthetische Netzwerke werden Reaktionen in Lösungen durchgeführt, die alle Komponenten umfassen, die erforderlich sind, um die Genexpression19,20,21zu ermöglichen. Auf diese Weise entsteht eine biologisch relevante, wenn auch künstliche Umgebung, in der synthetische Netzwerke getestet werden können22,23,24,25,26, 27,28. Ein großer Vorteil der Verwendung von IVTT-Lösungen ist die Fähigkeit, Reaktionen unter benutzerdefinierten Bedingungen durchzuführen, wobei Forscher in der Lage sind, die genaue Zusammensetzung jederReaktion2 zu optimieren. Darüber hinaus ermöglicht der zellfreie Ansatz Tests synthetischer Netzwerke mit hohem Durchsatz, da zeitaufwändige Zellklonschritte überflüssig werden. Als Ergebnis wird die Dauer der aufeinanderfolgenden Konstruktion - Build - Testzyklen deutlich reduziert29,30,31,32. Der Entwurfszyklus kann weiter beschleunigt werden, indem zellfreie Klontechniken wie die Gibson-Baugruppe verwendet werden, um schnell neuartige Netzwerke zu entwickeln, und indem Netzwerke aus linearen DNA-Vorlagen aufgebaut werden, die - im Gegensatz zu den Plasmiden, die für In-vivo-Tests erforderlich sind - kann über Polymerase-Kettenreaktionen (PCR)33,34verstärkt werden.
Batch-Reaktionen sind die einfachste Methode, mit der IVTT-Reaktionen durchgeführt werden können, wobei ein einziges Reaktionsgefäß erforderlich ist, wobei alle Reaktionskomponenten35kombiniert werden. Solche Reaktionen reichen für die Proteinexpression und grundlegende Schaltungstests aus, erweisen sich jedoch als unzureichend, wenn man versucht, das langfristige dynamische Verhalten eines Netzwerks zu untersuchen. Im Laufe einer Chargenreaktion werden Reagenzien entweder erschöpft oder werden abgebaut, was zu einer kontinuierlichen Abnahme der Transkriptions- und Übersetzungsraten führt. Darüber hinaus akkumulieren sich mit fortschreitenden Reaktionen Nebenprodukte, die das korrekte Funktionieren des Netzes stören oder ganz hemmen können. Letztlich begrenzt der Einsatz von Batchreaktoren das beobachtete dynamische Verhalten, wobei die Durchführung von Negativregulierungen besonders schwierig ist,5,36zu implementieren.
Die Vielseitigkeit von IVTT-Systemen ermöglicht mehrere alternative Methoden, mit denen längere IVTT-Reaktionen durchgeführt werden können, von kontinuierlichen Strömungs- bis hin zu Tröpfchen-basierten Methoden sowie einfacheren Dialyseansätzen2,30, 37,38,39,40. Die Anwendung von mikrofluidischen Geräten bietet Benutzern eine erhöhte Kontrolle über ihre Reaktionen bei gleichzeitiger Erhöhung des Durchsatzes und der Minimierung der Kosten35,41,42, wobei jeder spezifische Ansatz seine eigene Vorteile. Die Verwendung von kontinuierlichen Durchfluss kann leicht für die Erhöhung der Expressionsausbeute optimiert werden, jedoch macht die Unfähigkeit, bestimmte Reaktionsprodukte effektiv zu entfernen, die Untersuchung des dynamischen Verhaltens nicht trivial39. Während der Einsatz von mikrofluidischen Tröpfchensystemen ein Hochdurchsatz-Screening neuartiger Netzwerke ermöglicht, führt die Schwierigkeit, der Reaktion frische Reagenzien zu liefern, dazu, dass die Tröpfchen kleinen Volumenbatchreaktionen ähneln43. Dialyse-basierte Reaktoren ermöglichen die Einführung von frischen Reagenzien sowie die Entfernung einiger Reaktionsprodukte, jedoch sammeln sich RNA-Moleküle und größere Proteine im Reaktor an, da sie zu groß sind, um sie durch die Membranporen zu diffundieren. Darüber hinaus sind große Mengen von Reagenzien erforderlich, um diese Reaktionen über einen längeren Zeitraum30,44aufrecht zu erhalten. Im Jahr 2013 präsentierten Maerkl et al. ein mehrschichtiges mikrofluidisches Gerät, das speziell für die Durchführung längerer IVTT-Reaktionen36,45entwickelt wurde. Der Einsatz von mehrschichtigen mikrofluidischen Geräten ermöglicht eine direkte Kontrolle des Flüssigkeitsflusses, was die Umleitung des Durchflusses sowie die Isolierung von Flüssigkeit in bestimmten Bereichen des Geräts46,47ermöglicht. Diese isolierten Regionen können als unabhängige Nanoliter-Skala-Reaktionskammern fungieren, in denen IVTT-Reaktionen durchgeführt werden können. Im Laufe einer einzigen IVTT-Reaktion werden periodische Injektionen frischer Reagenzien in den Reaktor verwendet, um IVTT-Komponenten und DNA-Vorlagen aufzufüllen. Gleichzeitig wird ein gleiches Volumen der alten Reaktionslösung verdrängt, wodurch Reaktionsprodukte entfernt werden. Auf diese Weise wird eine a-out-of-balance Umgebung beibehalten, in der die Basaltranskriptions- und Übersetzungsraten im stationären Zustand bleiben, was die Lebensdauer von IVTT-Reaktionen verlängert und ein reiches dynamisches Verhalten ermöglicht. Durch die Anwendung dieses Ansatzes sind die Forscher in der Lage, die kinetischen Raten der einzelnen Prozesse zu untersuchen, die innerhalb eines bestimmten Kreislaufs auftreten, und dabei die Weiterentwicklung neuartiger genetischer Netzwerke zu unterstützen. So implementierten Niederholtmeyer et al. diesen Ansatz, um verschiedene Elemente eines genetischen Ringoszillators zu charakterisieren und die kinetischen Raten davon zu bestimmen36. In weiteren Studien zeigten Yelleswarapu et al., dass die kinetischen Raten des Sigma-Faktors 28(28), die unter Chargenbedingungen bestimmt wurden, nicht ausreichten, um das Verhalten eines28-basiertenOszillators zu beschreiben, und dass die Zugabe von strömungsbasierten verbesserte Modellvorhersagen des Netzwerkverhaltens22.
Ziel dieses Manuskripts ist es, ein vollständiges Protokoll für die Herstellung von mehrschichtigen mikrofluidischen Geräten zu präsentieren, die in der Lage sind, langfristige IVTT-Reaktionen durchzuführen. Darüber hinaus wird dieses Manuskript die gesamte Hardware und Software beschreiben, die erforderlich ist, um längere IVTT-Reaktionen durchzuführen. Die Betätigung der mikrofluidischen Vorrichtung - notwendig, um den Flüssigkeitsfluss darin zu steuern - wird durch eine Reihe von pneumatischen Ventilen erreicht, die sich über Rohrlängen direkt mit den mikrofluidischen Geräten verbinden. Die Steuerung der pneumatischen Ventile erfolgt wiederum über eine kundenspezifische virtuelle Steuerschnittstelle. Der Flüssigkeitsfluss innerhalb der mikrofluidischen Geräte wird durch kontinuierlichen Druck erreicht, der durch ein handelsübliches Druckregelungssystem gewährleistet wird. IVTT-Reaktionen werden in der Regel zwischen 29 °C und 37 °C durchgeführt und ein Mikroskop-Inkubator wird verwendet, um die Temperatur während der Reaktionen zu regulieren. Die Funktionalität des IVTT-Gemischs nimmt jedoch allmählich ab, wenn es über 4 °C gelagert wird. Daher wird dieses Manuskript das Off-Chip-Kühlsystem erweitern, mit dem das IVTT-Gemisch vor der Injektion in das mikrofluidische Gerät gekühlt wird. Zusammenfassend bietet dieses Manuskript einen umfassenden Überblick über die Verfahren, die erforderlich sind, um längere IVTT-Reaktionen mit einem mikrofluidischen Durchflussreaktor erfolgreich durchzuführen, so dass andere Forscher in der Lage sein werden, diese Technologie mit relativen bequemlichkeit.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

Die Grenzen der zellbasierten synthetischen Biologie werden immer offensichtlicher, da Forscher größere und komplexere synthetische genetische Regulierungskreise entwickeln wollen. Die Analyse synthetischer genetischer Regulierungsnetzwerke in vivo ist zeitaufwändig und leidet unter einem Mangel an Umweltkontrolle, wobei exogene synthetische Komponenten mit Wirtsprozessen interagieren, was zu unerwünschtem Verhalten führt. Um diese Probleme zu überwinden, wird die zellfreie Charakterisierung neuartiger Schaltkreise immer häufiger. In-vitro-Transkriptions- und -translationsgemische (IVTT)-Mischungen ermöglichen die Regulierung der experimentellen Umgebung und können für jedes einzelne System optimiert werden. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben die Herstellung eines mehrschichtigen mikrofluidischen Geräts, das verwendet werden kann, um IVTT-Reaktionen über längere Dauer aufrecht zu erhalten. Im Gegensatz zu Chargenreaktionen, bei denen Ressourcen im Laufe der Zeit erschöpft sind und sich (by-) Produkte ansammeln, ermöglicht der Einsatz mikrofluidischer Geräte die Auffüllung von Ressourcen sowie die Entfernung von Reaktionsprodukten. Auf diese Weise wird die zelluläre Umgebung emuliert, indem eine a-out-of-Balance-Umgebung beibehalten wird, in der das dynamische Verhalten von Genkreisen über einen längeren Zeitraum untersucht werden kann. Um das mehrschichtige mikrofluidische Gerät voll auszuschöpfen, wurden Hard- und Software integriert, um die IVTT-Reaktionen zu automatisieren. Durch die Kombination von IVTT-Reaktionen mit der hier vorgestellten mikrofluidischen Plattform wird es möglich, komplexe Netzwerkverhalten umfassend zu analysieren und so unser Verständnis der Mechanismen zu fördern, die zelluläre Prozesse regulieren.

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A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Der Herstellungsprozess eines PDMS-basierten, mehrschichtigen, mikrofluidischen Geräts, das in vitro Transkription und Translation (IVTT) Reaktionen über längere Zeiträume durchführen kann, wird beschrieben. Darüber hinaus erhalten Sie einen umfassenden Überblick über die Hard- und Software, die zur Automatisierung und Aufrechterhaltung dieser Reaktionen über einen längeren Zeitraum erforderlich ist.

Eine multilayer mikrofluidische Plattform für die Leitung einer längeren zellfreien Genexpression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Das Prototyping synthetischer Gennetzwerke wird durch den Einsatz zellfreier Genexpressionssysteme erheblich verbessert. Unser Protokoll beschreibt den Herstellungsprozess für mehrschichtigen mikrofluidischen Durchflussreaktor und zeigt, dass ein solches Gerät für eine längere zellfreie Expression von GFP verwendet werden kann. Zellfreie Proteinausdrücke in Kombination mit mikrofluidischen Durchflussreaktoren bieten die Rapid Prototyping Plattform für die Entwicklung synthetischer biologischer Geräte.Dieses gesamte Setup ist sehr vielseitig und kann für die Leitung von biochemischen oder chemischen Reaktionen angepasst werden, die ein hohes Maß an Kontrolle erfordern. Die Gewährleistung der Stabilität der zellfreien Reaktionslösung ist entscheidend und schwer zu erreichen. Achten Sie darauf, sich auf die Bereitstellung einer ausreichenden Kühlung zu konzentrieren und die in diesem Protokoll angegebenen Schläuche zu nutzen.Die Herstellung und Vorbereitung der experimentellen Plattform erfordert die Verbindung zahlreicher Einzelkomponenten, ein Prozess, der ohne Sehhilfen nur schwer zu verfolgen ist. Zunächst folgen Sie dem begleitenden Textprotokoll, um das mikrofluidische Gerät herzustellen und die pneumatische Steuerung und Durchflussdruckregelung einzurichten, die zur Steuerung der für dieses Gerät kritischen Ventile verwendet wird. Um die Off-Chip-Kühlung einzurichten, beginnen Sie mit dem Aufwickeln einer Länge von PTFE-Schläuchen auf die kaltwandige Fläche eines Peltier-Elements und sichern Sie die Spule mit Klebeband.Stellen Sie sicher, dass ein Ende des PTFE-Schlauchs mit den Reservoirs des Durchflussschichtdruckregelsystems verbunden ist und dass das andere Ende nicht mehr als einen Zentimeter von der Peltier-Oberfläche ragt. Als nächstes legen Sie eine fünf bis zehn Zentimeter lange PEEK-Schläuche in das hervorstehende Ende des PTFE-Schlauchs ein. Tragen Sie eine ausreichende Menge an thermischer Verbindung auf die heiße Fläche des Peltier-Elements auf und legen Sie es auf die kalte Platte des Wasserblocks.Stellen Sie sicher, dass der Schlauch, das Peltier-Element und der Kühlblock jederzeit in direktem Kontakt miteinander stehen. Schließen Sie das Peltier-Element über einen seriellen Busstecker an den Temperaturregler an, damit die dem Peltier zugeführte Spannung reguliert werden kann. Platzieren Sie dann sicher einen Thermistor auf der Peltier-Oberfläche und schließen Sie dessen Ausgang an den Temperaturregler an.Nach dem Einschalten des Wasserkühlers passen Sie die dem Peltier zugeführte Spannung an, bis die Temperatur bei vier Grad Celsius stabil ist. Für jeden Steuerkanal des mikrofluidischen Geräts schneiden Sie eine Länge von Standardschläuchen, die einen Meter lang ist. Legen Sie an einem Ende den Stift eines 23-Messgeräts, einen halben Zoll Luer-Stub und am anderen Ende einen Edelstahl-Anschlussstift ein.Verbinden Sie den Luer-Stub mit einem 3/32 Zoll langen Luer-Barbed-Nylon-Stecker und stecken Sie den Widerhaken des Steckers in eine Länge von Polyurethan-Schläuchen. Dann legen Sie diese Polyurethan-Schläuche direkt in eines der Magnetventile ein. Als nächstes einen 23 Gauge halb Zoll Luer-Stub an einer Spritze befestigen und in ein drei bis vier Zentimeter langes Stück Standardschläuche einlegen.Legen Sie das offene Ende dieser Schläuche in ein Reservoir mit reinem Ultrawasser und füllen Sie die Spritze mit ultrareinem Wasser. Nummeren Sie jeden Steuerkanal des mikrofluidischen Geräts, wie hier gezeigt. Für die Kanäle vier bis 29 den entsprechenden Schlauch finden und den Metallstift in das offene Ende des an der Spritze befestigten Schlauchs einlegen.Dann wasser in den Steuerkanalschlauch injizieren, bis die Hälfte der Länge gefüllt ist. Trennen Sie anschließend den Schlauch von der Spritze und stecken Sie den Edelstahl-Steckerstift in das entsprechende Loch des mikrofluidischen Geräts. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Steuerkanäle.Verwenden Sie nun die Steuerschnittstelle, um alle Magnetventile zu öffnen. Dadurch wird die Flüssigkeit innerhalb des Steuerkanalrohres unter Druck gesetzt, die sie in das mikrofluidische Gerät zwingt und alle membranbasierten Ventile innerhalb des Geräts schließt. Für jeden der ungekühlten Reagenzien schneiden Sie eine MeterLänge von Standardschläuchen, um den Behälterauslass mit den einlässen mikrofluidischen Geräten zu verbinden.Nehmen Sie ein Ende des Schlauches und legen Sie diese in das Reservoir ein, um sicherzustellen, dass der Schlauch die Basis des Reservoirs erreicht. Der Behälterrohrauslass sollte so angezogen werden, dass eine luftdichte Abdichtung erreicht wird. Setzen Sie dann einen Rostanschlussstift in das offene Ende des Schlauches ein.Als nächstes befestigen Sie einen 23 Gauge halben Zoll Luer-Stub am Ende einer Ein-Milliliter-Spritze. Fügen Sie dem Luer-Stub eine kurze Länge von Standardschläuchen hinzu. Legen Sie das Ende des Schlauches in die gewünschte Reagenzlösung und füllen Sie die Spritze mit dem Reagenz.Legen Sie dann den Edelstahl-Steckverbinderstift in den mit der Spritze verbundenen Polyurethanschlauch ein und füllen Sie den Schlauch mit dem Reagenz. Bei Verwendung kleiner Reaktionsvolumina gelangt das Reagenz nicht in das Reservoir und der Schlauch selbst fungiert als Reservoir. Trennen Sie nach Fertigstellung die Spritze, und stecken Sie den Steckerstift in eine der Einlasslöcher der Mikrofluidanlage.Dann drücken Sie auf jedes reservoir mit der Druckregler-Software, um die Reagenzien in das mikrofluidische Gerät zu zwingen. Stellen Sie sicher, dass die Wasserkühler und Peltier-Elemente eingeschaltet wurden, wobei die Oberflächentemperatur des Peltier auf vier Grad Celsius eingestellt ist. Montieren Sie das Kühlsystem so nah wie möglich am mikrofluidischen Gerät, um das ungekühlte Volumen zwischen dem Peltier und dem Geräteeinlass zu minimieren.Dann verbinden Sie die eine die ein Milliliter Spritze mit einem 23 Gauge halb Zoll Luer Stub mit einer kurzen Länge der Standard-Schläuche am Ende befestigt. Ziehen Sie das zu kühlende Reagenz ein, um die Spritze zu füllen. Als nächstes verbinden Sie den PEEK-Schlauch über den Bindeschlauch mit der Spritze und drücken Sie konstant auf die Spritze, die das Reagenz durch den PEEK-Schlauch und in den PTFE-Schlauch zwingt.Trennen Sie schließlich den PEEK-Schlauch von der Spritze und legen Sie ihn direkt in die Durchflusskanaleinlässe des mikrofluidischen Geräts ein. Wenn Druck ausgeübt wird, wird das gekühlte Reagenz in das mikrofluidische Gerät gedrückt. Stellen Sie sicher, dass das mikrofluidische Gerät auf der Mikroskopbühne sicher ist, wobei alle Kontroll- und Durchflussschichtschläuche befestigt sind und alle Öffnungen am Inkubator schließen.Als nächstes stellen Sie die Umgebungstemperatur des Inkubators auf 29 Grad Celsius. Stellen Sie dann sicher, dass das Kühlsystem eingeschaltet ist und auf vier Grad Celsius eingestellt ist, bevor Sie das Experiment einschalten. Prüfen Sie, ob die auf den Durchflussdruckregler ausgeübten Drücke auf 800 Millibar eingestellt sind, und stellen Sie mit der Software den Ausgangsdruck jedes einzelnen Durchflusskanals auf 20 bis 100 Millibar ein.Prüfen Sie, ob der Druck auf die Magnetventile des Steuerkanals für die Kanäle eins bis acht und drei bar für die Kanäle 9 bis 29 einen Balken beträgt. Schließen Sie als Nächstes den Auslass des Geräts, indem Sie Kanal 29 unter Druck setzen und gleichzeitig die Steuerkanäle eins bis drei und 15 bis 28 drücken. Drücken Sie dann selektiv die Steuerkanäle des Multiplexers, damit ein einzelnes ausgewähltes Reagenz in das Gerät fließen kann.Verwenden Sie das Mikroskop, um die Entfernung von Luft zu überwachen und anschließend sicherzustellen, dass alle Reagenzien korrekt fließen, ohne Luftblasen einzuführen. Richten Sie mit dem mitgelieferten Softwarepaket die Datenfelder zum Kalibrierungsprozess ein, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Anschließend bestimmen Sie das Flüssigkeitsvolumen, das während eines einzelnen Zulaufschritts aus jedem Reaktor verschoben wird, indem Sie das Kalibrierprotokoll ausführen.Befolgen Sie die von der Steuerungssoftware vorgestellten Schritte, um die Analyse des Kalibrierexperiments abzuschließen und das Aktualisierungsverhältnis jedes Ringreaktors im mikrofluidischen Gerät zu bestimmen. Legen Sie schließlich die erforderlichen Werte für das gewünschte Experiment innerhalb der virtuellen Steuerungsschnittstelle fest. Initiieren Sie das experimentelle Protokoll, indem Sie die Schaltfläche "Experiment ausführen" in der Steuerschnittstelle drücken.Während eines Kalibrierversuchs werden die Reaktoren mit einem Fluorophor gefüllt, dessen Intensität nach jeder Verdünnung aufgezeichnet wird. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität pro Verdünnung zeigt das Volumen des Reaktorrings, der für die eingestellte Anzahl von Zulaufschritten verschoben wurde. Dieses Volumen wird als Aktualisierungsverhältnis bezeichnet.Das durchschnittliche Aktualisierungsverhältnis und die Standardabweichung werden für jeden Verdünnungsschritt rot dargestellt. Sieben der acht Reaktoren weisen ein sehr ähnliches Verhalten auf, ein Reaktor weist jedoch Schwankungen nach dem siebten Verdünnungszyklus auf. Dies unterstreicht die Notwendigkeit einzigartiger Aktualisierungsverhältnisse für jeden Reaktor.Die hier gezeigte verlängerte In-vitro-Transkription und Übersetzungsreaktion hatten alle 14,6 Minuten 30 % des Reaktorvolumens verschoben. Zwei Reaktoren des mikrofluidischen Geräts, wo als Rohlinge verwendet. Alle anderen Reaktoren umfassten 75% in vitro Transkriptions- und Translationsreaktionslösung und 25% entweder ultrareines Wasser oder 2,5 nanomolar lineare DNA-Vorlagen, die für die Expression des DeGFP-Proteins kodiert wurden.In allen vier Reaktoren, in denen DNA hinzugefügt wurde, gab es eine klare DeGFP-Expression. Ein Reaktor zeigt ein niedrigeres Fluoreszenzsignal an. Dies könnte durch Unterschiedliche im Durchfluss, die zu weniger DNA in den Reaktor führen, oder durch Schwankungen der Reaktorabmessungen verursacht werden.Nach 14 Stunden ist ein plötzlicher Anstieg des Signals der DNA-haltigen Reaktoren zu beobachten. Dies wird durch eine Luftblase verursacht, die in die Strömungsschicht des mikrofluidischen Geräts eindringt. Nach Wiederaufnahme des Flusses kehrt das Experiment zu seiner vorherigen Fluoreszenzintensität zurück.Zellfreie Reaktionslösungen unterliegen im Laufe der Zeit einer Verschlechterung, es sei denn, sie sind ausreichend gekühlt, was den in diesem Protokoll beschriebenen Kühlprozess von entscheidender Bedeutung macht. Durch die Vielseitigkeit der Plattform können eine Vielzahl biochemischer und chemischer Reaktionen präzise und kontrolliert durchgeführt werden. Die Anwendung von mikrofluidischen Durchflussreaktoren hat aufeinanderfolgende Design-Build-Testzyklen für das Prototyping von doppelten genetischen Schaltkreisen beschleunigt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Forschung

Biotechnik

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Mikrofluidik-Plattform zur Messung der Neutrophilen-Chemotaxis von Rohboden Vollblut

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Die Multi-Organ Chip - Ein Mikrofluidik-Plattform für langfristige Multi-Gewebe Cokultur

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Mehrstufige Höhenverstellbarem Lithografie für Valved Mehrschichtige Mikrofluidiksysteme

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Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Performance-testing Platform for a Conduction Micropump with an FR-4 Copper-clad Electrode Plate

Leistungstests Plattform für eine Wärmeleitung Mikropumpe mit einem FR-4 kupferummantelte Elektrodenplatte

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Bildgebung der Wurzelhaare Morphologie der Arabidopsis Sämlinge in einer zweischichtigen mikrofluidischen Plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Zellfreien Protein Ausdruck mithilfe der rasch wachsenden Bakterium Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...