Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מועצת המחקר האירופית, ERC (פרויקט n. 677313 BioCircuit) NWO-VIDI מענק מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO, 723.016.003), מימון של משרד החינוך, תרבות ומדע (כבידה תוכניות, 024.001.035 & 024.003.013), התוכנית מדעי הגבול האנושי הענק RGP0032/2015, מועצת המחקר האירופית תחת אופק של האיחוד האירופי 2020 מחקר וחדשנות תוכנית גרנט 723106, ו השוויצרי הלאומי המדע הקרן גרנט 200021_182019.

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מכשיר מיקרופלואידיג מבוססי PDMS מבוסס מרובת שכבות, ויכולתה לקיים תגובות IVTT לפרקי זמן ממושכים. למרות שמתאים ביותר לדוגמה ספציפית זו, ניתן להשתמש בטכנולוגיה זו עבור יישומים רבים אחרים. שליטה נוספת על זרימת נוזלים-לזווג עם היכולת לחדש ברציפות ריאגנטים תגובה תוך הסרת (על ידי) מוצרים-הוא אידיאלי עבור תגובות סינתזה רציפה, החקירה של התנהגויות דינמיות שונים, ו הסימולטני הולכה של וריאציות מרובות של תגובה אחת.
למרות תהליך הייצור הפשוט יחסית של התקנים מבוססי PDMS, השימוש בו דורש התקנה חומרה נרחבת. מערכי שסתומים, מווסתים לחץ, משאבות לחץ, אינקובטורים ויחידות קירור, המעבר מייצור לשימוש אינו אלמנטרי, ודורש השקעה ראשונית משמעותית. בנוסף, היכולת להגדיר בעקביות ולבצע ניסויים מוצלחים עם התקנים אלה דורש השקעה משמעותית בזמן; נקודה שכתב היד הזה מטרתו להתייחס אליה. עם זאת, במקום כלשהו, ניתן לשנות את ההתקנה כולה למגוון מטרות. יתר על כן, ההתקנה חומרה כוללת אלמנטים מודולריים רבים, אשר כל אחד מהם ניתן להרחיב כדי לאפשר מורכבים יותר עיצובים התקן microfluidic להיות מועסק. בנוסף, העיצוב המודולרי מאפשר להחליף רכיבי חומרה על-ידי חלופות מתפקדות באופן דומה, כך שמשתמשים אינם מוגבלים להתקנה הספציפית המתוארת כאן48,49.
שינויים בין התקנים נפרדים ובתנאים החיצוניים (כגון תנודות בלחץ) עלולים לגרום לאי בזמן ביצוע ניסויים באמצעות התקנים אלה. כדי לטפל בבעיה זו, יש לבצע כיול של המערכת לפני כל ניסוי, ולספק יחס רענון ייחודי לכל אחד מהכורים. בזמן שכיול מטפל בווריאציות התקן להתקן וניסוי-לניסוי, זהו תהליך הארוך בזמן ולא מושלם. נוזלים עם עוצמות שונות של ויסקוזה לא יזרום עם אותו קצב כאשר נחשף ללחץ זהה, וככזה ביצוע כיול עם מספר ריאגנטים לא יכול להניב יחסי רענוןזהים. אפקט זה הוא החליש על-ידי ניצול שלושה ערוצי שליטה למשאבת הפריסטסטי הריאגנטים לתוך המכשיר microflu, בניגוד לוויסות הזרימה על ידי שינוי הלחץ המסופק בלבד. כמוצא אחרון במקרים שבהם הפער בצמיגות גדול מאוד, יחס רענון ייחודי יכול להיות מיושם עבור כל מגיב בודד על ידי ביצוע ניסויים כיול מרובים.
השימוש של המשאבה הפריסטלטית כדי להזריק ריאגנטים לתוך המכשיר microflu, מחליש את ההשפעות של שימוש בפתרונות עם עוצמות משתנות, אולם הוא גם יוצר בעיה משנית. שימוש בצעדים נפרדים כדי לשאוב נוזלים לתוך המכשיר microflu, פירושו כי הרזולוציה של זריקות לתוך הכור בודד, מוגבל על ידי עוצמת הקול מוזרק בעת ביצוע מחזור משאבת יחיד. בתוך המחקר שלנו ערך זה נקבע במהלך הכיול-הוא שווה כ %1, המציין כי מחזור משאבה אחת מהווה כ 1% של נפח המגיב (על 0.1 nL). ככזה, הוספת 30% של נפח המגיב דורש ביצוע של 30 מחזורי משאבה, עם 23 מחזורי משאבה של פתרון התגובה IVTT להתווסף, ורק 7 מחזורי משאבה של דנ א או מים באולטרסאונד להתווסף. למרות מספיק עבור המחקר שלנו, פרוטוקולים ניסיוניים אלטרנטיביים עלול להיתקל בבעיות כאשר מנסים להוסיף מספר גדול יותר של ריאגנטים ייחודי, להשתמש בשבר רענון נמוך יותר, או להוסיף כמויות קטנות יותר של מגיב אחד לכור. במקרים כאלה, עיצוב המכשיר microfluidic ניתן להתאים כדי לספק כורים עם נפח גדול יותר. דוגמה לכך מדווחת בניניהולטמאייר ואח '36.
באופן מכריע, המכשיר המתואר בכתב יד זה מאפשר לתגובות להיות מתמשך עבור משכים ממושכים וכתוצאה מכך המצב הקבוע שעתוק ושיעורי תרגום. על ידי הזרקת מדי פעם ריאגנטים חדש לתוך הכורים-והסרת התגובה (על ידי) מוצרים-התגובות הן מתמשכת התנהגויות דינמיות מורכבות ניתן לפקח. בדרך זו, פלטפורמה נוצרה כי במידה מסוימת-מחקה את הסביבה הסלולרית. יתר על כן, פלטפורמה זו מאפשרת את המחקר של הדינמיקה המערכת, על ידי התאמת התקופה בין זריקות לבין הרכב ספציפי של הזריקות. כתוצאה מכך, התקנים מיקרופלואידים מרובי שכבות אלה הם כלי רב עוצמה עבור המאפיינים והאופטימיזציה של רשתות סינטתיים הרומן אשר מציגים התנהגות דינמית מורכבת.

תאים מסוגלים לחוש ולהגיב לסביבתם באמצעות רשתות רגולטוריות דינאמיותמורכבות 1,2. תחום הביולוגיה הסינתטית מנצל את הידע שלנו על המרכיבים האנושיים המרכיבים את הרשתות הללו למהנדס מערכות ביולוגיות שיכולות להרחיב את הפונקציונליות של תאים3,4. לעומת זאת, ניתן גם להמשיך ולהבין את הרשתות הטבעיות השולטות על החיים על-ידי עיצוב מעגלים סינתטיים מפושטת של המעגלים הקיימים או על-ידי מערכות ביולוגיות הנדסיות מראש, אשר מציגים התנהגויות טבעיות. דה נובו הנדסה של מערכות ביולוגיות כאלה מבוצעת בצורה מלמטה למעלה שבו מעגלים גנטיים הרומן או מסלולים איתות מהונדסים באופן רציונלי, באמצעות חלקים מוגדרים היטב5,6. שילוב העיצוב הרציונלי של רשתות עם תכנון מערכות רלוונטיות ביולוגית מאפשר אפיון מעמיק וחקר מערכות רגולטוריות ביולוגיות עם רמות שונות של הפשטה7.
העבודות החלוציות של אלביץ ' ולייבלר8 וגרדנר ואח '9 היו הראשונים להדגים את המבוא המוצלח של רשתות גנטיות סינטתיים למארחים סלולריים. בעשור הבא, חוקרים רבים המשיכו לבנות על הצלחות ראשוניות אלה למרות הופעתה של מספר מגבלות לגבי המבוא של מעגלים סינתטיים לתוך תאים7,10,11 ,12. באופן אידיאלי, המבוא של מעגלים סינתטיים למחשבים מארחים סלולריים צריך להופיע בצורה מודולרית. למרבה הצער, המורכבות של הסביבה הסלולרית הופכת את זה למאתגר במיוחד, עם הפונקציה של חלקים רבים ורשתות להיות הקשר מאוד התלוי12,13,14. כתוצאה מכך, רשתות לעתים קרובות חווים אינטראקציות בלתי רצויות עם ערך רכיב מארח מקורי אשר יכול להשפיע על הפונקציה של המעגל הסינתטי. באופן דומה, הרכיבים של רשת אקסוגני יכולים לעכב תהליכים מארחים, להתחרות על משאבים משותפים בתוך המחשב המארח, ולהשפיע על קינטיקה הצמיחה15,16,17. כתוצאה מכך, כדי לעצב ולנבא באופן רציונלי את ההתנהגות של רשתות סינטתיים בסביבה vivo, מודל מקיף של כל הדינמיקה המארחת ומעגל נדרש18.
חלופה ממשית לשימוש במארחים סלולריים לאפיון של רשתות סינטתיים היא יישום של שעתוק ותרגום מחוץ לרשת (IVTT). מתפקד כ-גנט עבור רשתות סינטתיים, התגובות מתבצעות בפתרונות המרכיבים את כל הרכיבים הדרושים כדי לאפשר ביטוי גנים19,20,21. באופן זה, הסביבה הרלוונטית ביולוגית, אם כי מלאכותית, נוצרת בתוכה רשתות סינטתיים ניתן לבדוק22,23,24,25,26, 27,28. היתרון העיקרי של שימוש בפתרונות IVTT הוא היכולת לבצע תגובות תחת תנאים מוגדרים על-ידי המשתמש, עם החוקרים מסוגלים לכוונן את ההרכב המדויק של כל תגובה2. יתר על כן, הגישה ללא תא מאפשרת בדיקות תפוקה גבוהה של רשתות סינטתיים, כיוון שהיא מסירה את הצורך לבצע שלבי שיבוט סלולריים זמן רב. כתוצאה מכך, משך הזמן של מחזורי הבנייה-בדיקה רצופים מופחת באופן משמעותי29,30,31,32. מחזור העיצוב יכול להיות מואץ עוד יותר על-ידי ניצול שיטות שיבוט של תא חינם כגון מכלול הגיבסון להנדסה במהירות ברשתות הרומן, ועל ידי בניית רשתות מתבניות DNA ליניארי אשר-בניגוד הפלמידים הדרושים ב vivo בדיקות- יכול להיות מוגברבאמצעות תגובות שרשרתפולימראז (PCR)33,34.
תגובות אצווה הן השיטה הפשוטה ביותר שבה תגובות IVTT ניתן לבצע, המחייב ספינת תגובה אחת שבה כל רכיבי התגובה משולבים35. תגובות כאלה מספיקות לביטוי חלבון ובדיקות מעגל בסיסי עדיין להוכיח מספיק כאשר מנסים ללמוד את ההתנהגות הדינמית ארוכת טווח של רשת. במהלך תגובת האצווה, הריאגנטים מרוקן או עובר השפלה וכתוצאה מכך ירידה רציפה של שיעורי תמלול ותרגום. יתר על כן, כמו התקדמות התגובות על ידי-מוצרים להצטבר כי יכול להפריע-או לחלוטין לעכב-את התפקוד הנכון של הרשת. בסופו של דבר, השימוש כורים אצווה מגביל את ההתנהגות הדינמית אשר ניתן לצפות, עם רגולציה שלילית להיות מאתגרת במיוחד כדי ליישם5,36.
רב-תכליתיות מערכות ivtt מאפשרת שיטות חלופיות מרובות שבהן ניתן לבצע תגובות ממושכות של ivtt, החל מזרימה רציפה לשיטות מבוססות droplet, כמו גם גישות דיאליזה פשוטות יותר2,30, 37,38,39,40. היישום של התקנים microflu, מציע למשתמשים להגדיל את השליטה על התגובות שלהם תוך הגדלת התפוקה ומזעור עלויות35,41,42, עם כל גישה ספציפית שיש לה יתרונות משלו. השימוש בזרימה רציפה יכול להיות ממוטב בקלות עבור הגדלת תשואות ביטוי עם זאת, חוסר יכולת להסיר ביעילות מוצרי תגובה ספציפיים הופך את המחקר של התנהגות דינמית לא טריוויאלי39. בעוד העסקת droplet מבוססי microfluidic מערכות מאפשר הקרנת תפוקה גבוהה של רשתות הרומן, את הקושי של הספקת ריאגנטים טרי לתוצאות התגובה טיפות הדומה לאצווה קטנה בכמות התגובות43. כורים דיאליזה מבוסס לאפשר את המבוא של ריאגנטים טרי, כמו גם הסרת מוצרים מסוימים התגובה עם זאת, מולקולות RNA וחלבונים גדולים להצטבר בתוך הכור, להיות גדול מדי כדי לפזר דרך נקבוביות הקרום. יתר על כן, כמויות גדולות של ריאגנטים נדרשים לקיים את התגובות הללו לתקופות ממושכות30,44. בשנת 2013, maerkl et al. הציג מכשיר מיקרופלואידיג רב שכבתי שתוכנן במיוחד לניהול תגובות ivttממושכות 36,45. השימוש במכשירים מיקרופלואידים רב שכבתית מאפשר שליטה ישירה על זרימת הנוזלים, המאפשר ניתוב מחדש של זרימה, כמו גם בידוד של נוזלים באזורים ספציפיים של המכשיר46,47. אזורים מבודדים אלה יכולים לתפקד כתאי תגובה בקנה מידה של nanoliter עצמאית שבה תגובות IVTT ניתן לבצע. במהלך תגובת IVTT יחידה, זריקות תקופתיות של ריאגנטים טרי לתוך הכור משמשים לחדש רכיבי IVTT ו-DNA תבניות. במקביל, נפח שווה של פתרון התגובה הישנה הוא נעקרו, הסרת מוצרי התגובה. באופן זה, סביבה מחוץ לשיווי משקל מתוחזק היכן שיעור התמלול והתרגום הבזליים נשארים במצב יציב, מאריך את חיי התגובות של IVTT ומאפשר להתנהגויות דינמיות עשירות להתרחש. על ידי יישום גישה זו, החוקרים מסוגלים לחקור את שיעורי קינטי של תהליכים בודדים המתרחשים בתוך מעגל ספציפי, לסייע הנדסה קדימה של רשתות גנטיות הרומן. למשל, ניזלהולטמאייר ואח ' מיישמת גישה זו לאפיון אלמנטים שונים של מתנד טבעתי גנטי, הקובע את התעריפים הקינטית שלהם36. במחקרים נוספים, ילסווראפו et al הראה כי שיעורי קינטי של מקדם סיגמא 28 (σ28) נקבע תחת תנאי אצווה לא היו מספיק כדי לתאר את ההתנהגות של מתנד σ28, וכי התוספת של נתונים מבוססי זרימה תחזיות מודל משופר של התנהגות הרשת22.
מטרתו של כתב יד זה היא להציג פרוטוקול מלא לייצור התקנים מיקרופלואידים רב שכבתית המסוגלים לבצע תגובות לטווח ארוך של IVTT. בנוסף, כתב יד זה יתאר את כל החומרה והתוכנה הדרושים לביצוע תגובות ממושכות של IVTT. האקטואציה של התקן microflu, c הכרחי כדי לשלוט בזרימת הנוזלים בו-מושגת באמצעות סדרה של שסתומים פנאומטיים המתחברים ישירות למכשירים microflu, מיקרופלואידים באמצעות אורכי אבובים. בתורו, השסתומים הפנאומטיים נשלטים באמצעות ממשק בקרה וירטואלי בנוי בהתאמה אישית. זרימת הנוזלים בתוך המכשירים המיקרופלואידים מושגת באמצעות לחץ מתמשך אשר מסופק על ידי מערכת הלחץ הזמין מסחרית תקנה. תגובות IVTT מתבצעות בדרך כלל בין 29 ° צ' ו 37 ° c ואינקובטור מיקרוסקופ משמש כדי לווסת את הטמפרטורה במהלך התגובות. עם זאת, הפונקציונליות של תערובת ה-IVTT מדרדרת בהדרגה כאשר היא מאוחסנת מעל 4 ° c. ככזה, כתב יד זה יהיה להרחיב על מערכת קירור מחוץ שבב המשמש לצנן את תערובת ה-IVTT לפני הזרקה לתוך המכשיר microfluidic. לסיכום, כתב יד זה מספק סקירה מקיפה של ההליכים הנדרשים לבצע בהצלחה תגובות IVTT ממושכות באמצעות הכור זרם microflu, כך שחוקרים אחרים יוכלו לשכפל את הטכנולוגיה הזאת באופן יחסי קלות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

המגבלות של ביולוגיה סינתטי מבוסס תא נעשים יותר ויותר ברור כמו החוקרים מטרתו לפתח מעגלים סינתטיים גדול יותר ומורכב יותר הרגולציה הגנטית. הניתוח של רשתות הרגולציה הגנטית הסינתטי בvivo הוא זמן רב וסובל מחוסר שליטה סביבתית, עם רכיבים סינתטיים אקסוגני אינטראקציה עם תהליכים מארחים וכתוצאה מכך התנהגות בלתי רצויה. כדי להתגבר על בעיות אלה, אפיון ללא תא של המעגלים החדשניים הופך נפוץ יותר. בתמלול ובתרגום הפריה חוץ גופית מאפשרים התקנה של הסביבה הניסיונית והיא יכולה להיות ממוטבת לכל מערכת ייחודית. הפרוטוקולים המוצגים כאן פירוט הייצור של התקן microflu, מיקרו שכבה רב שניתן לשימוש כדי לקיים תגובות IVTT עבור משכי זמן ממושך. בניגוד לתגובות אצווה, שבו משאבים מרוקנים לאורך זמן ו (by-) מוצרים להצטבר, השימוש במכשירים microflu, מאפשר את חידוש המשאבים, כמו גם הסרת מוצרי התגובה. באופן זה, הסביבה התאית מועלת על-ידי שמירה על סביבה מחוץ לשיווי משקל שבה ההתנהגות הדינמית של מעגלי הגנים יכולה להיחקר בפרקי זמן ארוכים. כדי לנצל באופן מלא את התקן microflu, החומרה והתוכנה המרובים, שולבו כדי להפוך את תגובות ה-IVTT לאוטומטיות. על ידי שילוב תגובות IVTT עם פלטפורמת microflu, מיקרופלואידים המוצגת כאן, ניתן לנתח באופן מקיף התנהגויות רשת מורכבות, לקדם את הבנתנו את המנגנונים המסדירים תהליכים סלולריים.

Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

תהליך הייצור של מכשיר מבוסס PDMS, רב שכבתי, microfluidic המאפשר שעתוק ותרגום מבחנה (IVTT) התגובות להתבצע על פני תקופות ממושכות מתוארת. יתרה מזאת, סקירה מקיפה של החומרה והתוכנה הדרושה להפיכת תגובות אלה לאוטומטיות ולשמירה על המשך ממושך מסופקת.

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Prototyping רשתות גנים סינתטיים משופרת מאוד על ידי שימוש במערכות ביטוי גנים ללא תאים. הפרוטוקול שלנו מתאר את תהליך הייצור של כור זרימה מיקרופלואידי רב שכבתי ומראה כי מכשיר כזה יכול לשמש לביטוי ממושך ללא תאים של GFP. ביטויי חלבון נטולי תאים בשילוב עם כורי זרימה מיקרופלואידיים מספקים את פלטפורמת אב-האב-נתונים המהירה לעיצוב של מכשירים ביולוגיים סינתטיים.התקנה זו כולה היא רב-תכליתית מאוד ו ניתן להתאים אותה להוליכון של כל תגובה ביוכימית או כימית הדורשת רמות גבוהות של שליטה. הבטחת היציבות של פתרון התגובה ללא תאים היא קריטית וקשה להשגה. הקפד להתמקד במתן קירור מספיק ונצל את הצינורות שצוינו בפרוטוקול זה.המצאה והכנת הפלטפורמה הניסיונית דורשת חיבור של רכיבים בודדים רבים, תהליך שקשה לעקוב אחריו ללא עזרים חזותיים. כדי להתחיל, בצע יחד בפרוטוקול הטקסט הנלווה כדי להמציא את המכשיר microfluidic ולהגדיר את בקרת פנאומטי ויסות לחץ זרימה אשר ישמש לשליטה על השסתומים קריטי למכשיר זה. כדי להגדיר את הקירור מחוץ לשבב, התחל על ידי סליל אורך של צינורות PTFE על הפנים הקרות של אלמנט פלטייה ולאבטח את סליל עם קלטת.ודא כי קצה אחד של צינורות PTFE מחובר למאגרים של מערכת בקרת לחץ שכבת הזרימה, כי הקצה השני בולט לא יותר מסנטימטר אחד מפני השטח פלטייה. לאחר מכן הכנס אורך של 5 עד 10 ס"מ של צינורות PEEK לתוך הקצה הבולט של צינורות PTFE. יש למרוח כמות מספקת של תרכובת תרמית על הפנים החמות של אלמנט פלטייה ולהחיל אותה על הצלחת הקרה של גוש המים.ודאו שהצנרת, אלמנט פלטייה ובלוק הקירור נמצאים בקשר ישיר זה עם זה בכל עת. לאחר מכן חבר את אלמנט פלטייה לבקר הטמפרטורה באמצעות מחבר אפיק טורי, כך שניתן יהיה להסדיר את המתח המסופק לפלטייר. לאחר מכן, הצב בבטחה תרמיסטור על משטח פלטייה וחבר את התפוקה שלו לבקר הטמפרטורה.לאחר הפעלת מצנן המים, התאם את המתח המסופק לפלדייה עד שהטמפרטורה יציבה בארבע מעלות צלזיוס. עבור כל ערוץ בקרה של המכשיר microfluidic לחתוך אורך של צינורות סטנדרטיים כי הוא מטר אחד ארוך. בקצה אחד, הכנס את הסיכה של מד 23, יתן לולר אחד בגודל חצי אינץ' ובקצה השני הכנס סיכת חיבור מפלדת אל-חלד.חבר את תקע לור למחבר ניילון דוקרני זכר Luer 3/32 אינץ' והכנס את העקיצה של המחבר לאורך של צינורות פוליאוריתן. ואז להכניס צינורות פוליאוריתן זה ישירות לתוך אחד שסתומי סולנואיד. הבא לצרף 23 מד חצי אינץ ' לולר stub למזרק ולהכניס את זה לתוך חתיכה ארוכה של שלושה עד ארבעה סנטימטרים של צינורות סטנדרטיים.מניחים את הקצה הפתוח של צינור זה לתוך מאגר של מים טהורים במיוחד ולמלא את המזרק עם מים טהורים במיוחד. מספור כל ערוץ בקרה של המכשיר microfluidic כפי שמוצג כאן. עבור ערוצים 4 עד 29, למצוא את הצינור המתאים ולהכניס את סיכת המתכת לתוך הקצה הפתוח של הצינור המחובר למזרק.ואז להזריק מים לתוך צינורות תעלת הבקרה עד מחצית האורך כבר מלא. לאחר מכן, נתק את הצינורות מהמזרק והכנס את סיכת מחבר נירוסטה לתוך החור המתאים של המכשיר המיקרופלואידי. חזור על שלב זה עבור כל ערוצי הבקרה.עכשיו, להשתמש בממשק הבקרה כדי לפתוח את כל שסתומי סולנואיד. פעולה זו תלחץ על הנוזל בתוך צינורות תעלת הבקרה ותאלץ אותו להיכנס למכשיר המיקרופלואידי ולסגור את כל השסתומים מבוססי הממברנה בתוך המכשיר. עבור כל אחד מהריגטים הלא מנוקב חתכו אורך מטר של צינורות סטנדרטיים כדי לחבר את שקע המאגר לתוך ההתקן המיקרופלואידי.קח קצה אחד של הצינור ולהכניס את זה לתוך המאגר להבטיח כי הצינורות מגיע לבסיס המאגר. יש להדק את שקע צינורות המאגר כך שהושג אטום אטום. לאחר מכן, הכנס סיכת חיבור אל-חלד לקצה הפתוח של הצינור.לאחר מכן, צרף 23 מד חצי אינץ' לולר תותב לסוף מזרק מיליליטר אחד. הוסיפו אורך קצר של צינורות סטנדרטיים לסטוב לולר. מניחים את קצה הצינור לתוך הפתרון הרצוי reagent ולמלא את המזרק עם reagent.לאחר מכן הכנס את סיכת מחבר נירוסטה לתוך צינורות פוליאוריתן המחוברים למזרק ולמלא את הצינורות עם reagent. בעת שימוש בנפחי תגובה קטנים, ריאגנט לא ייכנס למאגר ואת הצינור עצמו יפעל כמאגר. בסיום, נתק את המזרק והכנס את סיכת המחבר לאחד חורי הכניסה של שכבת הזרימה של ההתקן המיקרופלואידי.לאחר מכן להפעיל לחץ על כל אחד המאגרים באמצעות תוכנת רגולטור הלחץ כדי לאלץ את reagents לתוך המכשיר microfluidic. ודא כי מצנן המים ואלמנטים Peltier כבר מופעל עם טמפרטורת פני השטח של פלטייה מוגדר ארבע מעלות צלזיוס. התקן את מערך הקירור קרוב ככל האפשר להתקן המיקרופלואידי כדי למזער את עוצמת הקול הבלתי מעורערת בין ה-Peltier למפרץ המכשיר.ואז לחבר את אחד מזרק מיליליטר אחד כדי 23 מד חצי אינץ ' לולר תקע עם אורך קצר של צינורות סטנדרטיים מחוברים עד הסוף. צייר את הריג'נט כדי להיות מקורר כדי למלא את המזרק. הבא לחבר את צינורות PEEK למזרק באמצעות צינורות החיבור ולהחיל לחץ מתמיד על המזרק לאלץ את מגיב דרך צינורות PEEK לתוך צינורות PTFE.לבסוף לנתק את צינורות PEEK מהמזרק ולהכניס אותו ישירות לתוך הכניסות ערוץ הזרימה של המכשיר microfluidic. כאשר הלחץ יוחל, הרוגנט מקורר ייאלץ לתוך המכשיר microfluidic. ודאו שההתקן המיקרופלואידי מאובטח בשלב המיקרוסקופ עם כל צינורות שכבת הבקרה והזרימה המחוברים וסגרו את כל הפתחים באינקובטור.לאחר מכן להגדיר את טמפרטורת הסביבה של החממה ל 29 מעלות צלזיוס. לאחר מכן תבטח שמערכת הקירור מופעלת ומוגדרת לארבע מעלות צלזיוס לפני תחילת הניסוי. בדוק כי הלחצים המוחלים על וסת לחץ ערוץ הזרימה מוגדר 800 מיליבאר ושימוש בתוכנה, להגדיר את לחץ הפלט של כל ערוץ זרימה בודדים בין 20 ל 100 מיליבאר.בדוק כי לחצים להחיל על שסתומי סולנואיד ערוץ הבקרה הוא בר אחד עבור ערוצים אחד עד שמונה ושלושה בר עבור ערוצים תשע עד 29. לאחר מכן, סגור את השקע של המכשיר על ידי לחיצה על ערוץ 29 ובו זמנית לדכא ערוצי בקרה אחד עד שלוש ו 15 עד 28. לאחר מכן לחץ באופן סלקטיבי על ערוצי הבקרה של המולטיפלקסר כדי לאפשר לריג'נט נבחר אחד לזרום לתוך ההתקן.השתמש במיקרוסקופ כדי לפקח על הסרת האוויר ולאחר מכן להבטיח כי כל reagents לזרום כראוי מבלי להציג בועות אוויר. באמצעות חבילת התוכנה שסופקה, הגדר את שדות הנתונים הקשורים לתהליך הכיול כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן לקבוע את נפח הנוזלים שנעקרו מכל כור במהלך שלב זרימה יחיד על ידי ביצוע פרוטוקול הכיול.בצע יחד עם השלבים שהוצגו על ידי תוכנת הבקרה כדי להשלים את הניתוח של ניסוי הכיול ולקבוע את יחס הרענון של כל כור טבעת בהתקן microfluidic. לבסוף, הגדר את הערכים הדרושים עבור הניסוי הרצוי בתוך ממשק הבקרה הווירטואלית. ליזום את הפרוטוקול הניסיוני על ידי לחיצה על לחצן ביצוע הניסוי בממשק הבקרה.במהלך ניסוי כיול הכורים מלאים בפלואורופור שעוצמתו מתועדת לאחר כל דילול. הירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות לכל דילול חושפת את נפח טבעת הכור שנעקרו עבור המספר שנקבע של שלבי הזרימה. אמצעי אחסון זה תותקף את יחס הרענון.יחס הרענון הממוצע וסטיית התקן מוצגים עבור כל שלב דילול באדום. שבעה מתוך שמונת הכורים מראים התנהגות דומה מאוד, אולם כור אחד מראה תנודות לאחר מחזור הדילול השביעי. זה מדגיש את הצורך ביחסי רענון ייחודיים עבור כל אחד מהכורים.התמליל הממושך במבחנה ותגובת התרגום המוצגים כאן היו 30% מנפח הכור שנעקרו כל 14.6 דקות. שני כורים של המכשיר המיקרופלואידי שבו משמשים כדורי סרק. כל הכורים האחרים כללו 75% תמלול במבחנה ותגובת תרגום ו-25% ממים טהורים במיוחד או קידוד תבניות DNA ליניאריות ננו-מולריות 2.5 לביטוי חלבון deGFP.בכל ארבעת הכורים שבהם נוסף הדנ"א, היה ביטוי deGFP ברור. כור אחד מציג אות פלואורסצנטי נמוך יותר. זה יכול להיגרם על ידי פער בזרימה וכתוצאה מכך פחות DNA נכנס הכור או בשל וריאציות בממדי הכור.לאחר 14 שעות, עלייה פתאומית ניכרת באות של הכורים המכילים DNA. זה נגרם על ידי בועת אוויר הנכנסת לשכבת הזרימה של המכשיר המיקרופלואידי. עם חידוש הזרימה, הניסוי חוזר לעוצמת הפלואורסצנטיות הקודמת שלו.פתרונות תגובה נטולי תאים נתונים לפגיעה לאורך זמן, אלא אם כן הם מקורר מספיק, להפוך את תהליך הקירור המתואר בפרוטוקול זה בעל חשיבות קריטית. בשל הרבגוניות של הפלטפורמה, מגוון תגובות ביוכימיות וכימיות יכולות להתנהל בצורה מדויקת ומבוקרת. היישום של כורי זרימה microfluidic האיץ תכנון רצוף לבנות מחזורי בדיקה עבור prototyping מעגלים גנטיים כפולים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

פוטו-ליתוגרפיה גובה רב שלבי משתנה עבור Valved רב שכבתי מכשירים microfluidic

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Performance-testing Platform for a Conduction Micropump with an FR-4 Copper-clad Electrode Plate

פלטפורמה בדיקות ביצועים הולכה Micropump עם צלחת אלקטרודה לבושת נחושת FR-4

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

תא ללא חלבון ביטוי באמצעות החיידק גדל במהירות ויבריו natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...