Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca, CER (progetto n. 677313 BioCircuit) una sovvenzione NWO-VIDI dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO, 723.016.003), finanziamento da parte del Ministero dell'Istruzione, della Cultura e della Scienza (Gravità 024.001.035 e 024.003.013), il Programma di Scienze delle Frontiere Umane Grant RGP0032/2015, il Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea Grant 723106 e una Fondazione nazionale svizzera per la scienza Grant 200021_182019.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

È stato presentato un dispositivo microfluidico multistrato basato su PDMS ed è stata dimostrata la sua capacità di sostenere le reazioni IVTT per periodi di tempo prolungati. Anche se adatto per questo esempio specifico, questa tecnologia può essere utilizzata in teoria per numerose altre applicazioni. Il controllo aggiuntivo sul flusso dei fluidi, abbinato alla capacità di ricostituire continuamente i reagenti di reazione, rimuovendo (by)prodotti, è ideale per reazioni di sintesi continua, lo studio di vari comportamenti dinamici e la contemporanea conduzione di molteplici variazioni di una singola reazione.
Nonostante il processo di fabbricazione relativamente semplice dei dispositivi basati su PDMS, l'uso richiede un'ampia configurazione hardware. Composto da array di valvole, regolatori di pressione, pompe di pressione, incubatrici e unità di raffreddamento, la transizione dalla fabbricazione all'uso non è elementare e richiede un investimento iniziale significativo. Inoltre, la capacità di impostare ed eseguire esperimenti di successo con questi dispositivi richiede un notevole investimento in termini di tempo; un punto che questo manoscritto si propone di affrontare. Tuttavia, una volta sul posto, l'intera configurazione può essere modificata per una serie di scopi. Inoltre, la configurazione hardware comprende numerosi elementi modulari, ognuno dei quali può essere ampliato per consentire l'impiego di progetti di dispositivi microfluidici più complessi. Inoltre, la progettazione modulare consente la sostituzione dei componenti hardware mediante alternative analogamente funzionanti, in modo che gli utenti non siano limitati alla configurazione specifica descritta qui48,49.
La variabilità tra i singoli dispositivi e in condizioni esterne (ad esempio le fluttuazioni di pressione) può causare imprecisioni durante l'esecuzione di esperimenti che utilizzano questi dispositivi. Per risolvere questo problema, è necessario eseguire una calibrazione del sistema prima di ogni esperimento, fornendo un rapporto di aggiornamento univoco per ciascuno dei reattori. Mentre la calibrazione affronta le variazioni da dispositivo a dispositivo e da esperimento a esperimento, è un processo che richiede molto tempo e non è impeccabile. I fluidi con viscosità diverse non scorrono con la stessa velocità quando esposti a una pressione identica, e come tali l'esecuzione della calibrazione con più reagenti non può produrre rapporti di aggiornamento identici. Questo effetto è attenuato utilizzando tre canali di controllo per pompare peristalmente i reagenti nel dispositivo microfluidico, invece di regolare il flusso variando solo la pressione fornita. Come ultima risorsa nei casi in cui la disparità nella viscosità è molto grande, è possibile implementare un rapporto di aggiornamento unico per ogni singolo reagente eseguendo più esperimenti di calibrazione.
L'uso di una pompa peritale per iniettare reagenti nel dispositivo microfluidico attenua gli effetti dell'uso di soluzioni con diverse viscosità, tuttavia crea anche un problema secondario. L'utilizzo di passaggi discreti per pompare fluidi nel dispositivo microfluidico, significa che la risoluzione delle iniezioni in un singolo reattore, è limitata dal volume iniettato quando si esegue un singolo ciclo di pompaggio. All'interno della nostra ricerca questo valore - determinato durante la calibrazione - è approssimativamente uguale all'1%, il che indica che un ciclo a pompa singola sposta circa l'1% del volume del reattore (circa 0,1 nL). Come tale, la sostituzione del 30% del volume del reattore richiede l'esecuzione di 30 cicli di pompa, con 23 cicli di pompa della soluzione di reazione IVTT aggiunti, e solo 7 cicli di pompa di DNA o acqua ultrapura aggiunta. Sebbene sufficienti per la nostra ricerca, i protocolli sperimentali alternativi possono incontrare problemi quando si tenta di aggiungere un numero maggiore di reagenti univoci, utilizzare una frazionedi aggiornamento inferiore o aggiungere volumi più piccoli di un singolo reagente a un reattore. In questi casi, il design del dispositivo microfluidico può essere adattato per fornire ai reattori un volume maggiore. Un esempio di questo è riportato in Niederholtmeyer et al.36.
Fondamentalmente, il dispositivo delineato all'interno di questo manoscritto permette di sostenere le reazioni per durate prolungate con conseguente trascrizione e tassi di traduzione allo stato costante. Iniettando periodicamente nuovi reagenti nei reattori - e rimuovendo la reazione (by) dei prodotti - le reazioni sono sostenute e possono essere monitorati comportamenti dinamici complessi. In questo modo, è stata creata una piattaforma che - in una certa misura imita l'ambiente cellulare. Inoltre, questa piattaforma consente l'esplorazione delle dinamiche del sistema, adattando il periodo tra le iniezioni e la composizione specifica delle iniezioni. Di conseguenza, questi dispositivi microfluidici multistrato sono un potente strumento per la caratterizzazione e l'ottimizzazione di nuove reti sintetiche che mostrano un comportamento dinamico complesso.

Le cellule sono in grado di percepire e rispondere al loro ambiente utilizzando complesse reti regolatorie dinamiche1,2. Il campo della biologia sintetica utilizza la nostra conoscenza dei componenti naturali che comprendono queste reti per progettare sistemi biologici in grado di espandere la funzionalità delle cellule3,4. Al contrario, è anche possibile approfondire la nostra comprensione delle reti naturali che governano la vita progettando analoghi sintetici semplificati di circuiti esistenti o da sistemi biologici in ingegneria in avanti che presentano comportamenti naturali. L'ingegneria de novo di tali sistemi biologici viene eseguita in modo bottom-up dove nuovi circuiti genetici o percorsi di segnalazione sono progettati in modo razionale, utilizzando parti ben definite5,6. La combinazione della progettazione razionale delle reti con la progettazione di sistemi biologicamente rilevanti consente la caratterizzazione approfondita e lo studio di sistemi normativi biologici con vari livelli di astrazione7.
Le opere pionieristiche di Elowitz e Leibler8 e Gardner et al.9 sono state le prime a dimostrare l'introduzione di successo di reti genetiche sintetiche negli host cellulari. Nel decennio successivo, numerosi ricercatori hanno continuato a costruire su questi successi iniziali nonostante l'emergere di diverse limitazioni per quanto riguarda l'introduzione di circuiti sintetici nelle cellule7,10,11 ,12. Idealmente, l'introduzione di circuiti sintetici negli host cellulari dovrebbe avvenire in modo modulare. Purtroppo, la complessità dell'ambiente cellulare rende questo particolarmente impegnativo, con la funzione di molte parti e reti altamente context dipendente12,13,14. Di conseguenza, le reti spesso sperimentano interazioni indesiderate con la componentia host nativa che possono influenzare la funzione del circuito sintetico. Analogamente, i componenti della rete esogena possono inibire i processi host, competere per le risorse condivise all'interno dell'host e influenzare la cinetica di crescita15,16,17. Di conseguenza, per progettare e prevedere razionalmente il comportamento delle reti sintetiche in un ambiente in vivo, è necessario un modello completo di tutte le dinamiche specifiche dell'host e del circuito18.
Una valida alternativa all'uso degli host cellulari per la caratterizzazione delle reti sintetiche è l'applicazione di tecnologie di trascrizione e traduzione in vitro (IVTT). Agendo come banco di prova per le reti sintetiche, le reazioni vengono eseguite in soluzioni che comprendono tutti i componenti necessari per consentire l'espressionegenica 19,20,21. In questo modo, si crea un ambiente biologicamente rilevante, anche se artificiale, all'interno del quale le reti sintetiche possono essere testate22,23,24,25,26, 27,28. Un grande vantaggio dell'utilizzo di soluzioni IVTT è la capacità di eseguire reazioni in condizioni specificate dall'utente, con ricercatori in grado di ottimizzare la composizione precisa di ogni reazione2. Inoltre, l'approccio senza cellule consente il test ad alta velocità effettiva delle reti sintetiche, poiché elimina la necessità di eseguire lunghe operazioni di clonazione cellulare. Di conseguenza, la durata dei cicli di progettazione - compilazione e test successivi è significativamente ridotta29,30,31,32. Il ciclo di progettazione può essere ulteriormente accelerato utilizzando tecniche di clonazione senza cellule come l'assemblaggio Gibson per progettare rapidamente nuove reti e costruendo reti da modelli di DNA lineare che - a differenza dei plasmidi necessari per il test in vivo - possono essere amplificati tramite reazioni a catena polimerasi (PCR)33,34.
Le reazioni batch sono il metodo più semplice con cui possono essere eseguite reazioni IVTT, richiedendo un singolo vaso di reazione in cui tutti i componenti di reazione sono combinati35. Tali reazioni sono sufficienti per l'espressione proteica e i test di circuito di base, ma si rivelano insufficienti quando si tenta di studiare il comportamento dinamico a lungo termine di una rete. Nel corso di una reazione batch, i reagenti sono esauriti o subiscono una degradazione con conseguente riduzione continua dei tassi di trascrizione e traduzione. Inoltre, man mano che le reazioni progrediscono i sottoprodotti si accumulano che possono interferire con - o inibire completamente - il corretto funzionamento della rete. In definitiva, l'uso di reattori a lotti limita il comportamento dinamico che può essere osservato, con una regolamentazione negativa particolarmente difficile da implementare5,36.
La versatilità dei sistemi IVTT consente molteplici metodi alternativi con cui è possibile eseguire reazioni IVTT prolungate, che vanno dal flusso continuo ai metodi a base di gocciolamenti, così come la dialisi più semplice si avvicina2,30, 37,38,39,40. L'applicazione di dispositivi microfluidici offre agli utenti un maggiore controllo sulle loro reazioni aumentando al contempo la produttività e riducendo al minimo i costi35,41,42, con ogni approccio specifico che ha il suo propri vantaggi. L'uso del flusso continuo può essere facilmente ottimizzato per aumentare i rendimenti di espressione tuttavia, l'incapacità di rimuovere in modo efficace prodotti di reazione specifici rende lo studio del comportamento dinamico non banale39. Sebbene l'impiego di sistemi microfluidici basati su goccioline consenta lo screening ad alto velocità di nuove reti, la difficoltà di fornire nuovi reagenti ai risultati della reazione nelle goccioline simili a reazioni batch di piccole dimensioni43. I reattori basati sulla dialisi consentono l'introduzione di reagenti freschi e la rimozione di alcuni prodotti di reazione, tuttavia, le molecole di RNA e le proteine più grandi si accumulano all'interno del reattore, essendo troppo grandi per diffondersi attraverso i pori della membrana. Inoltre, grandi volumi di reagenti sono necessari per sostenere queste reazioni per periodi prolungati30,44. Nel 2013, Maerkl et al. ha presentato un dispositivo microfluidico multistrato progettato specificamente per condurre reazioni IVTT prolungate36,45. L'uso di dispositivi microfluidici multistrato consente il controllo diretto sul flusso del fluido, consentendo il reindirizzamento del flusso e l'isolamento del fluido in specifiche regioni del dispositivo46,47. Queste regioni isolate possono funzionare come camere di reazione indipendenti su scala nanolloficante in cui possono essere eseguite reazioni IVTT. Nel corso di una singola reazione IVTT, iniezioni periodiche di reagenti freschi nel reattore vengono utilizzate per ricostituire i componenti IVTT e i modelli di DNA. Allo stesso tempo, un volume uguale della vecchia soluzione di reazione viene spostato, rimuovendo i prodotti di reazione. In questo modo, viene mantenuto un ambiente fuori equilibrio in cui i tassi di trascrizione e traduzione basale rimangono in stato costante, prolungando la durata delle reazioni IVTT e consentendo comportamenti dinamici ricchi. Applicando questo approccio, i ricercatori sono in grado di studiare i tassi cinetici dei singoli processi che si verificano all'interno di un circuito specifico, aiutando nell'ingegneria in avanti di nuove reti genetiche. Per esempio, Niederholtmeyer et al. ha implementato questo approccio per caratterizzare vari elementi di un oscillatore ad anello genetico, determinando i tassi cinetici di36. In altri studi, Yelleswarapu et al. hanno mostrato che i tassi cinetici del fattore di sigma28(-28) determinati in condizioni di lotto erano insufficienti per descrivere il comportamento di un oscillatore basato sul flusso e che l'aggiunta di dati basati sul flusso previsioni del modello migliorato del comportamento di rete22.
L'obiettivo di questo manoscritto è quello di presentare un protocollo completo per la fabbricazione di dispositivi microfluidici multistrato in grado di eseguire reazioni IVTT a lungo termine. Inoltre, questo manoscritto descriverà tutto l'hardware e il software necessari per eseguire reazioni IVTT prolungate. L'azionamento del dispositivo microfluidico - necessario per controllare il flusso dei fluidi in esso contenuti - si ottiene utilizzando una serie di valvole pneumatiche che si collegano direttamente ai dispositivi microfluidici tramite lunghezze di tubi. A sua volta, le valvole pneumatiche sono controllate tramite un'interfaccia di controllo virtuale su misura. Il flusso di fluido all'interno dei dispositivi microfluidici viene ottenuto utilizzando una pressione continua fornita da un sistema di regolazione della pressione disponibile in commercio. Le reazioni IVTT sono tipicamente eseguite tra i 29 e i 37 gradi centigradi e un'incubatrice al microscopio viene utilizzata per regolare la temperatura durante le reazioni. Tuttavia, la funzionalità della miscela IVTT si degrada gradualmente se immagazzinata al di sopra dei 4 gradi centigradi. Come tale, questo manoscritto si espanderà sul sistema di raffreddamento off-chip utilizzato per raffreddare la miscela IVTT prima dell'iniezione nel dispositivo microfluidico. In conclusione, questo manoscritto fornisce una panoramica completa delle procedure necessarie per eseguire con successo reazioni IVTT prolungate utilizzando un reattore a flusso microfluidico in modo che altri ricercatori saranno in grado di replicare questa tecnologia con facilità.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

I limiti della biologia sintetica basata sulle cellule stanno diventando sempre più evidenti in quanto i ricercatori mirano a sviluppare circuiti di regolazione genetica sintetica più grandi e complessi. L'analisi delle reti di regolamentazione genetica sintetica in vivo richiede molto tempo e soffre di una mancanza di controllo ambientale, con componenti sintetici esogeni che interagiscono con i processi host con conseguente comportamento indesiderato. Per superare questi problemi, la caratterizzazione senza cellule di nuovi circuiti sta diventando sempre più prevalente. Le miscele di trascrizione e traduzione in vitro (IVTT) consentono la regolazione dell'ambiente sperimentale e possono essere ottimizzate per ogni sistema unico. I protocolli qui presentati illustrano in dettaglio la fabbricazione di un dispositivo microfluidico multistrato che può essere utilizzato per sostenere le reazioni IVTT per durate prolungate. A differenza delle reazioni batch, in cui le risorse si esauriscono nel tempo e i prodotti (by-), l'uso di dispositivi microfluidici consente il rifornimento delle risorse e la rimozione dei prodotti di reazione. In questo modo, l'ambiente cellulare viene emulato mantenendo un ambiente fuori equilibrio in cui il comportamento dinamico dei circuiti genici può essere studiato per lunghi periodi di tempo. Per sfruttare appieno il dispositivo microfluidico multistrato, hardware e software sono stati integrati per automatizzare le reazioni IVTT. Combinando le reazioni ITTT con la piattaforma microfluidica qui presentata, diventa possibile analizzare in modo completo comportamenti di rete complessi, migliorando la nostra comprensione dei meccanismi che regolano i processi cellulari.

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A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Viene descritto il processo di fabbricazione di un dispositivo microfluidico basato su PDMS, multistrato, che consente di eseguire reazioni in vitro e di traduzione (IVTT) per periodi prolungati. Inoltre, viene fornita una panoramica completa dell'hardware e del software necessari per automatizzare e mantenere queste reazioni per durate prolungate.

Una piattaforma microfluidica multistrato per la conduzione di un'espressione genica prolungata senza cellule

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

La prototipazione delle reti geniche sintetiche è notevolmente migliorata dall'uso di sistemi di espressione genica liberi dalle cellule. Il nostro protocollo descrive il processo di fabbricazione per il reattore a flusso microfluidico multistrato e mostra che tale dispositivo può essere utilizzato per l'espressione prolungata senza cellule della GFP. Le espressioni proteiche senza cellule in combinazione con i reattori a flusso microfluidico forniscono la piattaforma di prototipazione rapida per la progettazione di dispositivi biologici sintetici.L'intera configurazione è altamente versatile e può essere adattata per la conduzione di qualsiasi reazione biochimica o chimica che richieda alti livelli di controllo. Garantire la stabilità della soluzione di reazione priva di cellule è fondamentale e difficile da raggiungere. Assicurati di concentrarti sul fornire un raffreddamento sufficiente e utilizzare i tubi specificati in questo protocollo.La fabbricazione e la preparazione della piattaforma sperimentale richiede il collegamento di numerosi singoli componenti, un processo che può essere difficile da seguire senza ausili visivi. Per iniziare, seguire nel protocollo di testo di accompagnamento per fabbricare il dispositivo microfluidico e impostare il controllo pneumatico e la regolazione della pressione di flusso che verrà utilizzato per controllare le valvole critiche per questo dispositivo. Per impostare il raffreddamento off-chip, iniziare avvolgendo una lunghezza di tubi PTFE sulla faccia fredda di un elemento Peltier e fissare la bobina con del nastro adesivo.Assicurarsi che un'estremità del tubo PTFE sia collegata ai serbatoi del sistema di controllo della pressione dello strato di flusso e che l'altra estremità sporge non più di un centimetro dalla superficie Peltier. Inserire quindi una lunghezza da cinque a 10 centimetri di tubi PEEK nell'estremità sporgente del tubo PTFE. Applicare una quantità sufficiente di composto termico sulla faccia calda dell'elemento Peltier e posizionarlo sulla piastra fredda del blocco d'acqua.Assicurarsi che il tubo, l'elemento Peltier e il blocco di raffreddamento siano sempre a diretto contatto tra loro. Collegare quindi l'elemento Peltier al regolatore di temperatura utilizzando un connettore bus seriale in modo che la tensione fornita al Peltier possa essere regolata. Quindi, posizionare in modo sicuro un termistore sulla superficie Peltier e collegarne l'uscita al regolatore di temperatura.Dopo aver accendeto il refrigeratore d'acqua, adattare la tensione fornita al Peltier fino a quando la temperatura è stabile a quattro gradi Celsius. Per ogni canale di controllo del dispositivo microfluidico tagliare una lunghezza di tubi standard lunga un metro. Ad un'estremità, inserire il perno di uno stub Luer da 23 gauge, un mezzo pollice e all'altra estremità inserire un perno di collegamento in acciaio inossidabile.Collegare lo stub Luer a un connettore maschio in nylon spinato Luer da 3/32 pollici e inserire la spina del connettore in una lunghezza di tubi in poliuretano. Quindi inserire questo tubo in poliuretano direttamente in una delle valvole solenoidi. Quindi attacca uno stub Luer da 23 pollici calibro a una siringa e inserisci questo in un pezzo di tubi standard lungo da tre a quattro centimetri.Posizionare l'estremità aperta di questo tubo in un serbatoio di acqua ultra pura e riempire la siringa con acqua ultra pura. Numerare ogni canale di controllo del dispositivo microfluidico come mostrato qui. Per i canali da quattro a 29, trovare i tubi corrispondenti e inserire il perno metallico nell'estremità aperta del tubo attaccato alla siringa.Quindi iniettare acqua nel tubo del canale di controllo fino a quando metà della lunghezza è stata riempita. Quindi, scollegare il tubo dalla siringa e inserire il perno del connettore in acciaio inossidabile nel foro corrispondente del dispositivo microfluidico. Ripetere questo passaggio per tutti i canali di controllo.Ora, usa l'interfaccia di controllo per aprire tutte le valvole solenoidi. Ciò premerà il fluido all'interno del tubo del canale di controllo forzarlo nel dispositivo microfluidico e chiudere tutte le valvole a membrana all'interno del dispositivo. Per ciascuno dei reagenti non raffreddati tagliare una lunghezza di metro di tubi standard per collegare l'uscita del serbatoio alle entrate del dispositivo microfluidico.Prendere un'estremità del tubo e inserirlo nel serbatoio assicurando che il tubo raggiunga la base del serbatoio. L'uscita del tubo del serbatoio deve essere stretta in modo da ottenere una tenuta ermetica. Quindi, inserire un perno di connessione inossidabile nell'estremità aperta del tubo.Quindi, attaccare uno stub Luer da 23 pollici all'estremità di una siringa da millelitro. Aggiungere una breve lunghezza di tubi standard allo stub Luer. Posizionare l'estremità del tubo nella soluzione reagente desiderata e riempire la siringa con il reagente.Quindi inserire il perno del connettore in acciaio inossidabile nel tubo in poliuretano collegato alla siringa e riempire il tubo con il reagente. Quando si utilizzano piccoli volumi di reazione, il reagente non entrerà nel serbatoio e il tubo stesso fungerà da serbatoio. Al termine, scollegare la siringa e inserire il perno del connettore in uno dei fori di ingresso dello strato di flusso del dispositivo microfluidico.Quindi applicare pressione a ciascuno dei serbatoi utilizzando il software di regolatore di pressione per forzare i reagenti nel dispositivo microfluidico. Assicurarsi che il refrigeratore d'acqua e gli elementi Peltier siano stati accesi con la temperatura superficiale del Peltier impostata a quattro gradi Celsius. Montare la configurazione di raffreddamento il più vicino possibile al dispositivo microfluidico per ridurre al minimo il volume non raffreddato tra peltier e l'ingresso del dispositivo.Quindi collegare quella della siringa da un millilitro a uno stub Luer da 23 pollici calibro con una breve lunghezza di tubi standard attaccati all'estremità. Disegnare nel reagente da raffreddare per riempire la siringa. Collegare quindi il tubo PEEK alla siringa tramite il tubo connettivo e applicare una pressione costante sulla siringa forzando il reagente attraverso i tubi PEEK e nei tubi PTFE.Infine scollegare il tubo PEEK dalla siringa e inserirlo direttamente nelle entrate del canale di flusso del dispositivo microfluidico. Quando viene applicata la pressione, il reagente raffreddato verrà forzato nel dispositivo microfluidico. Assicurarsi che il dispositivo microfluidico sia sicuro sullo stadio del microscopio con tutti i tubi di controllo e strato di flusso collegati e chiudere eventuali aperture sull'incubatore.Impostare quindi la temperatura ambiente dell'incubatore su 29 gradi Celsius. Assicurarsi quindi che il sistema di raffreddamento sia stato acceso e sia impostato su quattro gradi Celsius prima di avviare l'esperimento. Verificare che le pressioni applicate al regolatore di pressione del canale di flusso sia impostato su 800 millibar e utilizzando il software, impostare la pressione di uscita di ogni singolo canale di flusso su un tra 20 e 100 millibar.Verificare che le pressioni applicate alle valvole solenoidi del canale di controllo sia di una barra per i canali da una a otto e tre barre per i canali da nove a 29. Quindi, chiudere l'uscita del dispositivo pressurizzando il canale 29 e depressurizzare contemporaneamente i canali di controllo da uno a tre e da 15 a 28. Quindi depressurizzare selettivamente i canali di controllo del multiplexer per consentire a un singolo reagente selezionato di fluire nel dispositivo.Utilizzare il microscopio per monitorare la rimozione dell'aria e successivamente assicurarsi che tutti i reagenti fluiranno correttamente senza introdurre bolle d'aria. Utilizzando il pacchetto software fornito, impostare i campi dati relativi al processo di calibrazione come descritto nel protocollo di testo allegato. Successivamente determinare il volume del fluido spostato da ciascun reattore durante una singola fase di afflusso eseguendo il protocollo di taratura.Seguire i passaggi presentati dal software di controllo per completare l'analisi dell'esperimento di taratura e determinare il rapporto di aggiornamento di ciascun reattore ad anello nel dispositivo microfluidico. Infine, impostare i valori necessari per l'esperimento desiderato all'interno dell'interfaccia di controllo virtuale. Avviare il protocollo sperimentale premendo il pulsante Esegui esperimento nell'interfaccia di controllo.Durante un esperimento di taratura i reattori sono riempiti con un fluoroforo la cui intensità viene registrata dopo ogni diluizione. La diminuzione dell'intensità di fluorescenza per diluizione rivela il volume dell'anello del reattore spostato per il numero prestabilito di fasi di afflusso. Questo volume è definito rapporto di aggiornamento.Il rapporto di aggiornamento medio e la deviazione standard vengono visualizzati per ogni passaggio di diluizione in rosso. Sette degli otto reattori mostrano un comportamento molto simile, tuttavia un reattore mostra fluttuazioni dopo il settimo ciclo di diluizione. Ciò evidenzia la necessità di rapporti di aggiornamento unici per ciascuno dei reattori.La prolungata reazione di trascrizione e traduzione in vitro qui mostrata ha fatto spostare il 30% del volume del reattore ogni 14,6 minuti. Due reattori del dispositivo microfluidico se utilizzati come spazi vuoti. Tutti gli altri reattori comprendevano il 75% di soluzione di reazione di trascrizione e traslazione in vitro e il 25% di acqua ultra pura o modelli di DNA lineare nanomolare 2,5 che codificano per l'espressione della proteina deGFP.In tutti e quattro i reattori in cui è stato aggiunto il DNA, c'era una chiara espressione del deGFP. Un reattore mostra un segnale di fluorescenza inferiore. Ciò potrebbe essere causato da disparità di flusso che si traduce in una minore entrata del DNA nel reattore o a causa delle variazioni nelle dimensioni del reattore.Dopo 14 ore, si vede un improvviso aumento del segnale dei reattori contenenti DNA. Ciò è causato da una bolla d'aria che entra nello strato di flusso del dispositivo microfluidico. Alla ripresa del flusso, l'esperimento ritorna alla sua precedente intensità di fluorescenza.Le soluzioni di reazione senza cellule sono soggette a degradazione nel tempo a meno che non siano sufficientemente raffreddate, rendono il processo di raffreddamento descritto in questo protocollo di importanza critica. Grazie alla versatilità della piattaforma, una varietà di reazioni biochimiche e chimiche possono essere condotte in modo preciso e controllato. L'applicazione di reattori a flusso microfluidico ha accelerato i successivi cicli di test di costruzione della progettazione per la prototipazione di doppi circuiti genetici.

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