Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

この研究は、欧州研究評議会、ERC(プロジェクトn.677313バイオサーキット)がオランダ科学研究機構(NWO、723.016.003)からのNWO-VIDI助成金、文部科学省(重力)からの資金提供によって支援されました。プログラム, 024.001.035 & 024.003.013), ヒューマンフロンティア科学プログラムグラントRGP0032/2015, 欧州連合のホライズン2020研究革新プログラム助成金723106, スイス国立科学財団助成金200021_182019.

著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

PDMSベースの多層マイクロ流体デバイスが発表され、IVTT反応を長期間持続する能力が実証されています。この特定の例に適していますが、このテクノロジは他の多くのアプリケーションに使用できます。流体の流れに対する追加の制御 - (によって)製品を除去しながら、継続的に反応試薬を補充する能力と組み合わせることで、連続的な合成反応、様々な動的挙動の調査、および同時に最適です。単一の反応の複数のバリエーションの伝導。
PDMSベースのデバイスの比較的簡単な製造プロセスにもかかわらず、その使用には広範なハードウェアセットアップが必要です。バルブアレイ、圧力レギュレータ、圧力ポンプ、インキュベーター、冷却ユニットを含む、製造から使用への移行は初歩的ではなく、多大な初期投資を必要とします。さらに、これらのデバイスを一貫してセットアップして成功した実験を実行するには、かなりの時間投資が必要です。この原稿が取り組むポイント。ただし、いったん設定すると、さまざまな目的でセットアップ全体を変更できます。さらに、ハードウェアセットアップは多数のモジュラー要素で構成され、それぞれがより複雑なマイクロ流体デバイス設計を採用できるように拡張できます。さらに、モジュラー設計により、同様に機能する代替手段によってハードウェアコンポーネントを置き換えることができます。
個々のデバイス間の変動性、および外部条件(圧力変動など)では、これらのデバイスを使用して実験を行う際に不正確な結果が生じる可能性があります。この問題に対処するには、各実験の前にシステムのキャリブレーションを実行し、各反応器に固有のリフレッシュ比を提供する必要があります。キャリブレーションは、デバイス間および実験から実験へのバリエーションに対応しますが、時間のかかるプロセスであり、完璧ではありません。粘度が異なる流体は、同一の圧力にさらされた場合と同じ速度で流れ、複数の試薬でキャリブレーションを行うように、同一のリフレッシュ比を得ない場合があります。この効果は、3つの制御チャネルを利用して試薬を微小流体装置に注ぎ込むことで減衰し、供給圧力のみを変化させることによって流れを調節するのとは対照的である。粘度の格差が非常に大きい場合の最後の手段として、複数の校正実験を行うことで、個々の試薬ごとに独自のリフレッシュ比を実装することができます。
微小流体装置に試薬を注入する蠕動ポンプの使用は、さまざまな粘度を持つ溶液を使用する効果を減衰させるが、それはまた二次的な問題を作成する。マイクロ流体装置に流体を送り込む離散ステップを使用すると、単一の反応器への注入の分解能が、単一のポンプサイクルを実行する際に注入される体積によって制限される。我々の研究では、キャリブレーション中に決定されたこの値は、1つのポンプサイクルが反応器体の約1%(約0.1 nL)を置き換えるであることを示す、ほぼ1%です。したがって、原子炉体積の30%を置き換えるには、IVTT反応溶液の23ポンプサイクルが追加され、DNAまたは超純水のポンプサイクルが7つしか加えられており、30ポンプサイクルの実行が必要です。私たちの研究には十分ですが、代替実験プロトコルは、より多くのユニークな試薬を追加したり、より低いリフレッシュ画分を使用したり、単一の試薬の量を減らしたりする場合に問題が発生する可能性があります。このような場合、マイクロ流体デバイスの設計は、より大きな容積を持つ反応器を提供するように適合させることができる。そのような例はニーダーホルトマイヤーら36で報告されている。
重要なことに、この原稿の中で概説された装置は安定した状態の転写および翻訳率の結果として長期間反応を持続することを可能にする。定期的に新しい試薬を反応器に注入し、反応を除去することによって、反応は持続し、複雑な動的挙動を監視することができます。このようにして、ある程度は細胞環境を模倣するプラットフォームが作成されました。さらに、このプラットフォームは、注射と注射の特定の組成との間の期間を適応させることによって、システムダイナミクスの探索を可能にする。その結果、これらの多層マイクロ流体デバイスは、複雑な動的挙動を表示する新しい合成ネットワークの特性と最適化のための強力なツールです。

細胞は、複雑な動的調節ネットワーク1、2を使用して環境を感知し、応答することができます。合成生物学の分野は、これらのネットワークを含む天然成分に関する我々の知識を利用して、細胞3、4の機能を拡張できる生物学的システムを設計する。逆に、既存回路の簡略化された合成アナログを設計したり、自然発生する行動を示すフォワードエンジニアリング生物学的システムを設計したりすることで、生命を支配する自然ネットワークの理解を深めることも可能です。このような生物学的システムのde novo工学は、新しい遺伝回路またはシグナル伝達経路が、明確に定義された部分5、6を使用して合理的な方法で設計されるボトムアップ方方法で行われる。ネットワークの合理的な設計と生物学的に関連するシステムの設計を組み合わせることで、様々な抽象化7の様々なレベルを持つ生物学的調節システムの詳細な特性と研究が可能になります。
ElowitzとLeibler8およびGardner et al. al. 9の先駆的な研究は、細胞宿主への合成遺伝ネットワークの導入に成功した最初の作品でした。次の10年間で、多くの研究者は、細胞7、10、11への合成回路の導入に関するいくつかの制限の出現にもかかわらず、これらの初期の成功に基づいて構築し続けています 、12.理想的には、細胞ホストへの合成回路の導入は、モジュラー方式で行われるべきです。残念ながら、セルラー環境の複雑さは、多くの部分とネットワークの機能が高度にコンテキスト依存している12、13、14で、これを特に困難にします。その結果、ネットワークは、多くの場合、合成回路の機能に影響を与える可能性のあるネイティブホストコンポーネントとの望ましくない相互作用を経験します。同様に、外因性ネットワークの構成要素は、宿主プロセスを阻害し、宿主内の共有リソースを競い合い、成長運動学15、16、17に影響を与えることができる。したがって、インビボ環境における合成ネットワークの挙動を合理的に設計および予測するためには、すべてのホストおよび回路固有のダイナミクスの包括的なモデルが必要である18.
合成ネットワークの特性を示すためにセルラーホストを使用する実行可能な代替手段は、インビトロ転写および翻訳(IVTT)技術の適用である。合成ネットワークのテストベッドとして機能し、反応は、遺伝子発現19、20、21を可能にするために必要なすべての成分を含む溶液で行われる。このように、生物学的に関連する、人工的であるが、合成ネットワークをテストすることができる環境が22、23、24、25、26、 27、28.IVTTソリューションを使用する主な利点は、研究者が各反応2の正確な組成を調整することができ、ユーザー指定の条件下で反応を実行する能力です。さらに、セルフリーアプローチは、時間のかかるセルラークローン作成手順を実行する必要がないので、合成ネットワークのハイスループットテストを可能にします。その結果、連続した設計の持続時間 - ビルド - テストサイクルは大幅に29、30、31、32を減少させました。ギブソンアセンブリなどの無細胞クローニング技術を駆使して新しいネットワークを迅速に設計し、生体内試験に必要なプラスミドとは異なる線形DNAテンプレートからネットワークを構築することで、設計サイクルをさらに加速することができます。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)33、34を介して増幅することができる。
バッチ反応は、IVTT反応を行うことができる最も簡単な方法であり、すべての反応成分が35を組み合わせた単一の反応容器を必要とする。このような反応は、タンパク質発現および基本的な回路試験には十分でありながら、ネットワークの長期的な動的挙動を研究する際には不十分であることが証明される。バッチ反応の過程で、試薬は枯渇するか、または転写および翻訳速度の連続的な減少をもたらす劣化を受ける。さらに、反応が進行するにつれて、ネットワークの正しい機能を妨害する(または完全に阻害する)副産物が蓄積する。最終的に、バッチリアクターの使用は観察可能な動的挙動を制限し、否定的な規制は5、36を実装することが特に困難である。
IVTTシステムの汎用性は、連続的な流れから液滴ベースの方法、およびより簡単な透析アプローチ2、30まで、長時間のIVTT反応を行うことができる複数の代替方法を可能にします。37、38、39、40.マイクロ流体デバイスのアプリケーションは、スループットを向上させ、コストを最小化しながら、ユーザーが反応を制御し、コストを35、41、42にし、それぞれの特定のアプローチを持つことを提供します独自の利点。連続的な流れの使用は、発現収量を増加させるために容易に最適化することができるが、特定の反応産物を効果的に除去することができないため、動的挙動の研究は非些細な39になる。液滴ベースのマイクロ流体システムを採用すると、新規ネットワークのハイスループットスクリーニングが可能になりますが、反応に新鮮な試薬を供給することの難しさは、小体積バッチ反応に似た液滴をもたらします43。透析ベースの反応器は、新鮮な試薬の導入だけでなく、いくつかの反応産物の除去を可能にしますが、RNA分子と大きなタンパク質は、膜の細孔を通して拡散するには大きすぎて、反応器内に蓄積します。さらに、これらの反応を長期にわたって持続させるためには、大量の試薬が必要とされ、30、44.2013年、Maerklらは、長期IVTT反応36、45を導行するために特別に設計された多層マイクロ流体デバイスを発表した。多層マイクロ流体装置の使用は、流体の流れを直接制御することを可能にし、流れのリダイレクトだけでなく、デバイス46、47の特定の領域における流体の分離を可能にする。これらの単離された領域は、IVTT反応を行うことができる独立したナノリットルスケール反応室として機能することができる。単一のIVTT反応の過程で、反応器への新鮮な試薬の定期的な注入はIVTT成分およびDNAテンプレートを補充するために使用される。同時に、古い反応溶液の等しい体積が変位し、反応産物を除去する。このようにして、基礎転写および翻訳速度が安定した状態にとどまり、IVTT反応の寿命を延ばし、豊かな動的挙動が起こる場合、平衡状態が維持されます。このアプローチを適用することにより、研究者は、特定の回路内で発生する個々のプロセスの運動速度を調べることができ、新しい遺伝的ネットワークのフォワードエンジニアリングを支援することができます。例えば、ニーダーホルトマイヤーらは、遺伝的リング発振器の様々な要素を特徴付けるこのアプローチを実施し、その運動速度を36に決定した。さらなる研究では、Yelleswarapuらは、バッチ条件下で決定されたシグマ因子28(σ28)の運動速度がσ28ベースの発振器の挙動を記述するのに不十分であり、フローベースのデータを追加したことを示した。ネットワーク動作のモデル予測の改善22.
この原稿の目的は、長期IVTT反応を行うことができる多層マイクロ流体デバイスの製造のための完全なプロトコルを提示することです。さらに、この原稿では、長時間のIVTT反応を実行するために必要なすべてのハードウェアとソフトウェアについて説明します。マイクロ流体装置の作動は、その中の流体の流れを制御するために必要であり、チューブの長さを介してマイクロ流体デバイスに直接接続する一連の空気弁を使用して達成される。次に、空気弁はカスタム造られた仮想制御インターフェイスによって制御される。マイクロ流体装置内の流体の流れは、市販の圧力調節システムによって提供される連続的な圧力を使用して達成される。IVTT反応は、典型的には29°Cと37°Cの間で行われ、顕微鏡インキュベーターは、反応中の温度を調節するために使用されます。しかし、IVTT混合物の機能性は、4°Cを超えて保存すると徐々に劣化する。したがって、この原稿は、マイクロ流体装置に注入する前にIVTT混合物を冷却するために使用されるオフチップ冷却システム上で拡大されます。結論として、この原稿は、他の研究者が相対的にこの技術を複製することができるように、マイクロ流体流動反応器を使用して長時間のIVTT反応を正常に実行するために必要な手順の包括的な概要を提供します。容易。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

細胞ベースの合成生物学の限界は、研究者がより大きく、より複雑な合成遺伝子調節回路の開発を目指すにつれて、ますます明らかになってきています。生体内の合成遺伝子調節ネットワークの分析は時間がかかり、環境制御の欠如に苦しんでおり、外因性合成成分が宿主プロセスと相互作用して望ましくない挙動を引き起こします。これらの問題を克服するために、新しい回路の無細胞特性化がより一般的になりつつある。インビトロ転写および翻訳(IVTT)混合物は実験環境の調節を可能にし、各独特なシステムのために最大限に活用することができる。ここで提示されるプロトコルは、長期間にわたってIVTT反応を維持するために利用できる多層マイクロ流体デバイスの製造について詳述する。時間の経過と共に資源が枯渇し(バイ)製品が蓄積するバッチ反応とは対照的に、マイクロ流体デバイスを使用することで、資源の補充と反応産物の除去が可能になります。このように、細胞環境は、遺伝子回路の動的挙動を長期間にわたって調べることができる非平衡環境を維持することによってエミュレートされる。多層マイクロ流体デバイスを十分に活用するために、ハードウェアとソフトウェアが統合され、IVTT反応を自動化しました。IVTT反応をここで紹介するマイクロ流体プラットフォームと組み合わせることで、複雑なネットワーク挙動を総合的に解析することが可能となり、細胞プロセスを調節するメカニズムの理解を深めることが可能になります。

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A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

PDMSベースの多層、マイクロ流体デバイスの製造プロセスは、インビトロ転写および翻訳(IVTT)反応を長期間にわたって行うことを可能にする。さらに、これらの反応を長期間自動化および維持するために必要なハードウェアとソフトウェアの包括的な概要を提供します。

長期無細胞遺伝子発現の伝導のための多層マイクロ流体プラットフォーム

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

合成遺伝子ネットワークのプロトタイピングは、無細胞遺伝子発現システムの使用により大幅に改善されています。我々のプロトコルは、多層マイクロ流体流動反応器の製造プロセスを記述し、そのような装置がGFPの長期無細胞発現に使用できることを示している。マイクロ流体フローリアクターと組み合わせた無細胞タンパク質表現は、合成生物学的デバイスの設計のための迅速なプロトタイピングプラットフォームを提供します。この全体のセットアップは非常に多目的であり、制御の高いレベルを必要とする任意の生化学的または化学反応の伝導に適合することができる。無細胞反応溶液の安定性を確保することは重要であり、達成することは困難である。十分な冷却を提供することに焦点を当て、このプロトコルで指定されたチューブを利用してください。実験プラットフォームの製造および準備には、多数の個々のコンポーネントの接続が必要であり、視覚補助なしで従うのが困難なプロセスである。まず、付属のテキストプロトコルに従ってマイクロ流体デバイスを製造し、このデバイスに重要なバルブを制御するために使用される空気圧制御および流圧調節を設定します。オフチップ冷却を設定するには、まず PTFE チューブの長さをペルチェ要素の冷たい面に巻き付け、テープでコイルを固定します。PTFEチューブの一方の端がフロー層の圧力制御システムの貯留層に接続され、もう一方の端がペルチェ表面から1センチメートル以下に突き出していることを確認します。次に、PTFEチューブの突出先にPEEKチューブの5〜10センチメートルの長さを挿入します。ペルチェ元素の熱い面に十分な量の熱化合物を塗布し、水ブロックの冷たいプレートに置きます。チューブ、ペルチェ要素、冷却ブロックが常に相互に直接接触していることを確認します。次に、ペルチェに供給される電圧を調整できるように、シリアルバスコネクタを使用してペルチェ素子を温度コントローラに接続します。その後、ペルチェ表面にサーミスタをしっかりと配置し、その出力を温度コントローラに接続します。水クーラーをオンにした後、温度が摂氏4度で安定するまでペルチェに供給される電圧を適合させます。マイクロ流体デバイスの各制御チャネルのために、長さ1メートルの標準的な管の長さをカット。一方の端に、23ゲージのピン、1つの半インチのルアースタブを挿入し、もう一方の端にステンレス製の接続ピンを挿入します。ルアースタブをオスのLuer 3/32インチの有刺鉄線ナイロンコネクタに接続し、コネクタのバーブをポリウレタンチューブの長さに挿入します。次に、このポリウレタンチューブをソレノイドバルブの1つに直接挿入します。次に、23ゲージの半インチルアースタブを注射器に取り付け、これを3〜4センチメートルの標準チューブに挿入します。このチューブのオープンエンドを超純水の貯水池に入れ、注射器に超純水を充填します。ここに示すようにマイクロ流体デバイスの各制御チャネルに番号を付けます。チャンネル 4 ~ 29 の場合、対応するチューブを探し、シリンジに取り付けられたチューブの開いた端に金属ピンを挿入します。その後、半分の長さが満たされるまで、コントロールチャネルチューブに水を注入します。次に、注射器からチューブを取り外し、ステンレス製のコネクタピンをマイクロ流体装置の対応する穴に挿入します。すべてのコントロール チャネルに対してこの手順を繰り返します。今、コントロールインターフェイスを使用して、ソレノイドバルブのすべてを開きます。これは、制御チャネルチューブ内の流体を加圧し、マイクロ流体装置に押し込み、デバイス内のすべての膜ベースのバルブを閉じます。各非冷却試薬のためにマイクロ流体装置の入口に貯蔵出口を接続するために標準的な管のメートルの長さを切った。チューブの一端を取り、これを貯水池に挿入して、チューブが貯水池の底部に到達することを確認します。気密シールが得られるように、貯留槽の出口を締め付ける必要があります。次に、チューブの開いた端にステンレス接続ピンを挿入します。次に、1ミリリットルのシリンジの端に23ゲージの半インチルアースタブを取り付けます。Luer スタブに標準チューブの短い長さを追加します。チューブの端を目的の試薬溶液に入れ、注射器に試薬を充填します。次に、ステンレス製のコネクタピンをシリンジに接続されたポリウレタンチューブに挿入し、試薬でチューブを充填します。少量の反応量を使用する場合、試薬はリザーバに入らず、チューブ自体がリザーバーとして機能します。完了したら、シリンジを取り外し、マイクロ流体デバイスのフロー層の入口穴の1つにコネクタピンを挿入します。次に、圧力調整ソフトウェアを使用して各リザーバに圧力をかけ、試薬をマイクロ流体デバイスに強制的に入れ加えます。ペルチェの表面温度を摂氏4度に設定して、水冷器とペルチェ元素をオンにします。冷却セットアップをマイクロ流体デバイスにできるだけ近づけて、ペルチェとデバイスの入口の間の冷却されていないボリュームを最小限に抑えます。その後、1ミリリットルのシリンジを23ゲージの半インチのルアースタブに接続し、短い長さの標準チューブを端に取り付けます。冷却される試薬を注射器に充填するために引き込む。次に、接続チューブを介してPEEKチューブをシリンジに接続し、PEEKチューブを介して試薬をPTFEチューブに強制する注射器に一定の圧力を加えます。最後に、PEEKチューブをシリンジから切り離し、マイクロ流体デバイスの流路入口に直接挿入します。圧力が加えられると、冷却された試薬はマイクロ流体装置に強制されます。マイクロ流体デバイスが、すべての制御およびフロー層チューブを取り付けた顕微鏡ステージで安全であることを確認し、インキュベーター上の開口部を閉じます。次に、インキュベーターの周囲温度を摂氏29度に設定します。次に、冷却システムがオンになっており、実験を行う前に摂氏4度に設定されていることを確認します。流路圧力調整器に加えられる圧力が800ミリバールに設定されていることを確認し、ソフトウェアを使用して、個々の流路の出力圧力を20~100ミリバールに設定します。制御チャネルソレノイドバルブに適用される圧力が、チャンネル1~8の1バーと、チャンネル9~29の3つのバーであることを確認します。次に、チャネル29を加圧して装置の出口を閉じ、同時に制御チャネル1から3および15〜28を減圧する。次に、マルチプレクサの制御チャネルを選択的に減圧して、選択した1つの試薬がデバイスに流れ込むことを可能にする。顕微鏡を使用して空気の除去を監視し、その後、すべての試薬が気泡を導入することなく正しく流れるようにします。付属のソフトウェアパッケージを使用して、付属のテキストプロトコルに記載されているように、キャリブレーションプロセスに関連するデータフィールドを設定します。続いて、キャリブレーションプロトコルを実行することにより、単一流入工程中に各反応器から変位する流体体積を決定する。制御ソフトウェアによって提示された手順に従って、キャリブレーション実験の分析を完了し、マイクロ流体装置内の各リングリアクタのリフレッシュ比を決定します。最後に、仮想コントロール インターフェイス内で目的の実験に必要な値を設定します。制御インターフェースの実験実行ボタンを押して実験プロトコルを開始します。キャリブレーション実験中に、反応器は各希釈後に強度が記録される蛍光色素で満たされます。希釈あたりの蛍光強度の低下は、設定された流入ステップ数に対して変位する原子炉リングの体積を明らかにする。このボリュームは、リフレッシュ率と呼びます。各希釈ステップの平均リフレッシュ比と標準偏差は赤で示されています。8基の原子炉のうち7基は非常によく似た振る舞いを示すが、1基の原子炉は7回目の希釈サイクル後の変動を示す。これにより、各リアクタの一意のリフレッシュ比の必要性が強調されます。ここに示す長時間のin vitro転写および翻訳反応は、14.6分ごとに30%の反応器容積が変位した。ブランクとして使用されるマイクロ流体装置の2つの反応器。他のすべての反応器は、75%のインビトロ転写および翻訳反応溶液と、deGFPタンパク質の発現をコードする超純水または2.5ナノモル線形DNAテンプレートの25%で構成された。DNAが添加された4つの原子炉すべてにおいて、明確なdeGFP発現があった。1つの反応器は、より低い蛍光信号を表示する。これは、フローの不均一化により、反応器に入るDNAが少なくなるか、原子炉の寸法のばらつきが原因である可能性があります。14時間後、DNAを含む反応器のシグナルに急激な増加が見られる。これは、マイクロ流体装置の流れ層に入る気泡によって引き起こされる。流れの再開時に、実験は以前の蛍光強度に戻る。無細胞反応溶液は、十分に冷却されない限り経時的に劣化を受け、このプロトコルに記載された冷却プロセスを極めて重要なものにする。プラットフォームの汎用性のために、様々な生化学的および化学反応を正確かつ制御された方法で行うことができます。マイクロ流体流動反応器の適用は二重の遺伝子回路のプロトタイプの連続的な設計のテスト周期を加速した。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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