Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av European Research Council, ERC (prosjekt n. 677313 BioCircuit) en NWO-VIDI stipend fra Nederland organisasjon for Scientific Research (NWO, 723.016.003), finansiering fra departementet for utdanning, kultur og vitenskap (Gravity programmer, 024.001.035 & 024.003.013), Human Frontier Science program Grant RGP0032/2015, European Research Council under EUs Horizon 2020 forskning og innovasjon program Grant 723106, og en Swiss National Science Foundation Grant 200021_182019.

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

En PDMS-basert flerlags mikrovæskebasert enhet har blitt presentert, og dens evne til å opprettholde IVTT reaksjoner i lengre perioder har blitt demonstrert. Selv om denne teknologien er velegnet for dette spesifikke eksempelet, kan den tenkes brukes til en rekke andre programmer. Den ekstra kontrollen over væskestrømmen-sammen med evnen til kontinuerlig å etterfylle reaksjons reagenser mens du fjerner (av) produkter-er ideell for kontinuerlig syntese reaksjoner, etterforskningen av ulike dynamiske atferd, og samtidig gjennomføring av flere varianter av en enkelt reaksjon.
Til tross for relativt enkel fabrikasjon prosessen av PDMS baserte enheter, bruk av disse krever en omfattende hardware oppsett. Bestående ventil arrays, trykk regulatorer, trykk pumper, inkubatorer, og kjøling enheter, overgangen fra fabrikasjon til bruk er ikke elementære, og krever en betydelig innledende investering. I tillegg er evnen til å konsekvent sette opp og utføre vellykkede eksperimenter med disse enhetene krever en betydelig tid-investering; et punkt som dette manuskriptet tar sikte på å ta opp. Men, en gang på plass, hele oppsettet kan endres for en rekke formål. Videre består maskinvareoppsettet av mange modulære elementer, som hver kan utvides for å gi mer komplekse mikrovæskebasert enhets design som skal benyttes. I tillegg gjør den modulære designen utskifting av maskinvarekomponenter ved tilsvarende fungerende alternativer, slik at brukerne ikke er begrenset til det spesifikke oppsettet som er beskrevet her48,49.
Variasjon mellom individuelle enheter, og i ytre forhold (for eksempel trykksvingninger) kan føre til unøyaktigheter når du utfører eksperimenter ved hjelp av disse enhetene. For å løse dette problemet, bør en kalibrering av systemet utføres før hvert eksperiment, og gir et unikt oppdaterings forhold for hver av reaktorer. Mens kalibreringen tar for seg enhets-til-enhet-og eksperiment-til-eksperiment-variantene, er det en tidkrevende prosess og ikke feilfri. Væsker med ulik viskositeter vil ikke flyte med samme hastighet når de utsettes for identiske trykk, og som sådan utføre kalibreringen med flere reagenser kan ikke gi identiske refresh prosenter. Denne effekten dempes ved å bruke Trekontroll kanaler for peristaltically å pumpe reagensene inn i den mikrovæskebasert enheten, i motsetning til å regulere strømningen ved å variere det med følgende trykket. Som en siste utvei i tilfeller der forskjellene i viskositet er svært stor, kan et unikt oppdaterings forhold implementeres for hver enkelt reagens ved å utføre flere kalibrerings eksperimenter.
Bruken av en peristaltisk pumpe for å injisere reagenser i mikrovæskebasert enheten attenuates virkningene av å bruke løsninger med varierende viskositeter, men det skaper også et sekundært problem. Ved hjelp av diskrete trinn for å pumpe væsker inn i den mikrovæskebasert enheten, betyr det at oppløsningen av injeksjoner i en enkelt reaktor, er begrenset av volumet injisert når du utfører en enkelt pumpe syklus. Innenfor vår forskning denne verdien-bestemmes under kalibrering-er omtrent lik 1%, noe som indikerer at en enkelt pumpe syklus fortrenger ca 1% av reaktoren volum (ca 0,1 nL). Som sådan, fortrenge 30% av reaktoren volumet krever utførelse av 30 pumpe sykluser, med 23 pumpe sykluser av IVTT reaksjons løsning blir lagt til, og bare 7 pumpe sykluser av DNA eller ultrarent vann blir lagt til. Selv om det er tilstrekkelig for vår forskning, kan alternative eksperimentelle protokoller støte på problemer når du prøver å legge til større antall unike reagenser, bruke en lavere oppdaterings brøkeller legge til mindre volumer av en enkelt reagens i en reaktor. I slike tilfeller kan den mikrovæskebasert enheten design tilpasses for å gi reaktorer med et større volum. Et eksempel på dette er rapportert i Niederholtmeyer et al.36.
Enheten som er skissert i dette manuskriptet, gjør det avgjørende for at reaksjonene kan opprettholdes ved lengre tidsvarighet, noe som kan føre til transkripsjon og Oversettelses rater i steady state. Ved periodisk å injisere nye reagenser i reaktorer-og fjerne reaksjon (av) produkter-reaksjonene er vedvarende og komplekse dynamisk atferd kan overvåkes. På denne måten, en plattform har blitt opprettet som-til en viss grad-etterligner mobilnettet miljøet. Videre gjør denne plattformen utforskning av systemet dynamikk, ved å tilpasse perioden mellom injeksjoner og den spesifikke sammensetningen av injeksjoner. Som et resultat, disse flerlags mikrovæskebasert enheter er et kraftig verktøy for karakterisering og optimalisering av romanen syntetiske nettverk som viser komplekse dynamisk atferd.

Celler er i stand til å fornemme og reagere på sine omgivelser ved hjelp av komplekse dynamiske regulatoriske nettverk1,2. Feltet av syntetisk biologi utnytter vår kunnskap om de naturlig forekommende komponentene som består av disse nettverkene til ingeniør biologiske systemer som kan utvide funksjonaliteten til cellene3,4. Omvendt er det også mulig å videreutvikle vår forståelse av de naturlige nettverkene som styrer livet ved å designe forenklede, syntetiske analoger av eksisterende kretser eller ved Forward-engineering biologiske systemer som viser naturlig forekommende atferd. De Novo engineering av slike biologiske systemer er utført i en nedenfra og opp mote der romanen genetiske kretser eller signalering trasé er konstruert på en rasjonell måte, ved hjelp av veldefinerte deler5,6. Kombinere rasjonell utforming av nettverk med utformingen av biologisk relevante systemer gjør det i dybden karakterisering og studier av biologiske regulatoriske systemer med ulike nivåer av abstraksjon7.
De banebrytende verkene til Elowitz og Leibler8 og Gardner et al.9 var de første til å demonstrere vellykket innføring av syntetiske genetiske nettverk i mobilnettet verter. I det følgende tiåret har mange forskere fortsatt å bygge på disse innledende suksesser til tross for fremveksten av flere begrensninger i forbindelse med innføringen av syntetiske kretser i cellene7,10,11 ,12. Ideelt sett bør innføringen av syntetiske kretser i cellulære verter forekomme i en modulær måte. Dessverre gjør kompleksiteten i mobilnettet miljøet dette spesielt utfordrende, med funksjon av mange deler og nettverk blir svært sammenheng avhengig12,13,14. Som et resultat, nettverk ofte opplever uønsket interaksjon med native Host støpejernskomponenter som kan påvirke funksjonen av syntetisk krets. På samme måte kan komponenter i eksogene nettverk hemme verts prosesser, konkurrere om delte ressurser i verten og påvirke veksten Kinetics15,16,17. Følgelig, for å rasjonelt designe og forutsi atferden til syntetiske nettverk i et in vivo-miljø, kreves en omfattende modell av alle verts-og krets-spesifikk dynamikk18.
Et levedyktig alternativ til bruk av mobilnettet verter for karakterisering av syntetiske nettverk er anvendelsen av in vitro transkripsjon og oversettelse (IVTT) teknologier. Opptrer som en MontenegroGenericName for syntetiske nettverk, er reaksjoner utføres i løsninger som omfatter alle komponentene som kreves for å aktivere genuttrykk19,20,21. På denne måten, en biologisk relevant, om enn kunstig, miljø er opprettet innenfor hvilke syntetiske nettverk kan testes22,23,24,25,26, 27,28. En stor fordel med å bruke IVTT løsninger er evnen til å utføre reaksjoner under brukerdefinerte forhold, med forskere i stand til å tune den presise sammensetningen av hver reaksjon2. Videre gir celle fri tilnærming høy gjennomstrømming testing av syntetiske nettverk, siden det fjerner behovet for å utføre tidkrevende cellulære kloning trinn. Som et resultat, er varigheten av påfølgende design-Build-testsykluser betydelig redusert29,30,31,32. Utformingen syklusen kan bli ytterligere akselerert ved å utnytte celle-fri kloning teknikker som Gibson forsamlingen til raskt ingeniør romanen nettverk, og ved å konstruere nettverk fra lineære DNA maler som-i motsetning til plasmider kreves for in vivo testing- kan forsterkes via polymerase kjedereaksjoner (PCR)33,34.
Batch reaksjoner er den enkleste metoden som IVTT reaksjoner kan utføres, som krever et enkelt reaksjons fartøy hvor alle reaksjons komponentene er kombinert35. Slike reaksjoner er tilstrekkelig for protein uttrykk og grunnleggende krets testing men beviser utilstrekkelig når du prøver å studere den langsiktige dynamiske atferden til et nettverk. I løpet av en satsvis reaksjon, reagenser er enten utarmet eller gjennomgå degradering som resulterer i en kontinuerlig reduksjon av transkripsjon og oversettelse priser. Videre, som reaksjoner fremgang biprodukter akkumuleres som kan forstyrre-eller fullstendig hemme-riktig funksjon av nettverket. Til syvende og sist, bruk av batch reaktorer begrenser den dynamiske atferden som kan observeres, med negativ regulering er spesielt utfordrende å implementere5,36.
Allsidigheten til IVTT systemer muliggjør flere alternative metoder der forlenget IVTT reaksjoner kan utføres, alt fra kontinuerlig strømning til dråpe BAS ert metoder, samt enklere dialyse tilnærminger2,30, 37,38,39,40. Anvendelsen av mikrovæskebasert anordninger tilbyder brukernes forhøyet kontroll med deres reaksjonene stund i tiltagende det produksjon og minimere omkostningene35,41,42, med hver spesifikk adgang har dens egne fordeler. Bruk av kontinuerlig flyt kan enkelt optimaliseres for å øke uttrykket gir imidlertid, manglende evne til å effektivt fjerne konkrete reaksjons produkter gjør studiet av dynamisk atferd ikke-triviell39. Mens ansette dråpe BAS ert mikrovæskebasert systemer tillater høy gjennomstrømming screening av romanen nettverk, vanskeligheten med å forsyne friske reagenser til reaksjonen resulterer i dråper som ligner små volum satsvise reaksjoner43. Dialyse baserte reaktorer tillate innføring av friske reagenser, samt fjerning av noen reaksjons produkter imidlertid, RNA molekyler og større proteiner akkumuleres i reaktoren, blir for stor til å spre gjennom membranen porene. I tillegg er det nødvendig med store mengder reagenser for å opprettholde disse reaksjonene i lengre perioder30,44. I 2013, Maerkl et al. presentert en multi-lagdelt mikrovæskebasert enhet designet spesielt for å gjennomføre langvarig IVTT reaksjoner36,45. Bruk av flerlags mikrovæskebasert enheter tillater direkte kontroll over Fluid Flow, slik at for omdirigering av flyt samt isolering av væske i bestemte regioner av enheten46,47. Disse isolerte regioner kan fungere som uavhengige nanoliter-skala reaksjons kamre hvor IVTT reaksjoner kan utføres. I løpet av en enkelt IVTT-reaksjon brukes periodiske injeksjoner av friske reagenser i reaktoren til å etterfylle IVTT-komponenter og DNA-maler. Samtidig er et likt volum av den gamle reaksjons løsningen forskjøvet, og fjerner reaksjons produkter. På denne måten er en ut-av-likevekt miljøet opprettholdes der basal transkripsjon og oversettelsen priser forblir i steady-state, forlenge levetiden til IVTT reaksjoner og tillater rik dynamisk atferd oppstår. Ved å anvende denne tilnærmingen, forskere er i stand til å undersøke kinetisk utbredelsen av de enkelte prosessene som forekommer i en bestemt krets, hjelpe i frem-engineering av romanen genetiske nettverk. For eksempel, Niederholtmeyer et al. implementert denne tilnærmingen til å karakterisere ulike elementer av en genetisk ring Oscillator, bestemme kinetisk priser derav36. I videre studier, Yelleswarapu et al. viste at kinetisk utbredelsen av Sigma faktor 28 (σ28) bestemmes under batch forhold var utilstrekkelig for å beskrive atferden til en σ28-basert Oscillator, og at tillegg av Flow-baserte data forbedret modell spådommer av nettverket oppførsel22.
Målet med dette manuskriptet er å presentere en komplett protokoll for fabrikasjon av flerlags mikrovæskebasert enheter i stand til å utføre langsiktige IVTT reaksjoner. I tillegg vil dette manuskriptet beskrive all maskinvare og programvare som kreves for å utføre langvarige IVTT reaksjoner. Aktivering av mikrovæskebasert enhet-nødvendig for å kontrollere flyten av væsker deri-oppnås ved hjelp av en serie av pneumatiske ventiler som kobles direkte til mikrovæskebasert enheter via lengder på slangen. De pneumatiske ventilene styres i sin tur via et spesialbygd, virtuelt kontroll grensesnitt. Fluid Flow innenfor mikrovæskebasert enheter oppnås ved hjelp av kontinuerlig trykk som er levert av et kommersielt tilgjengelig trykk reguleringssystem. IVTT reaksjoner utføres vanligvis mellom 29 ° c og 37 ° c, og en inkubator for mikroskop brukes til å regulere temperaturen under reaksjonene. Funksjonaliteten til IVTT-blandingen blir imidlertid gradvis dårligere når den oppbevares over 4 ° c. Som sådan vil dette manuskriptet utvides på off-chip kjølesystemet brukes til å kjøle IVTT blandingen før injeksjon i mikrovæskebasert enheten. Som konklusjon, dette manuskriptet gir en omfattende oversikt over prosedyrene som kreves for å kunne utføre langvarige IVTT reaksjoner ved hjelp av en mikrovæskebasert strømnings reaktor slik at andre forskere vil være i stand til å gjenskape denne teknologien med relative Letthet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

Begrensningene til cellebasert syntetisk biologi blir stadig tydeligere ettersom forskerne tar sikte på å utvikle større og mer komplekse, syntetiske, genetiske regulerings kretser. Analysen av syntetiske genetiske regulatoriske nettverk in vivo er tidkrevende og lider av en mangel på miljøkontroll, med eksogene syntetiske komponenter i samspill med verts prosesser som resulterer i uønsket atferd. For å overvinne disse problemene, celle-fri karakterisering av romanen kretser blir mer utbredt. In vitro transkripsjon og oversettelse (IVTT) blandinger tillate regulering av eksperimentell miljø og kan optimaliseres for hvert unikt system. Protokollene presenteres her detalj fabrikasjon av en flerlags mikrovæskebasert enhet som kan utnyttes til å opprettholde IVTT reaksjoner for langvarig varighet. I motsetning til de satsvise reaksjonene, der ressursene tømmes over tid og (ved-) produkter akkumuleres, tillater bruk av mikrovæskebasert enheter påfyll av ressurser, samt fjerning av reaksjons produkter. På denne måten er det cellulære miljøet emulert ved å opprettholde en ut-av-likevekt miljø der den dynamiske atferden til genet kretser kan undersøkes over lengre perioder. For å fullt ut utnytte flerlags mikrovæskebasert enhet, maskinvare og programvare har blitt integrert for å automatisere IVTT reaksjoner. Ved å kombinere IVTT reaksjoner med mikrovæskebasert plattformen presenteres her, blir det mulig å grundig analysere komplekse nettverk atferd, fremme vår forståelse av mekanismene som regulerer cellulære prosesser.

Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Det fabrikasjon forarbeide av en PDMS-basert, flerlags, mikrovæskebasert apparat det innrømmer inne vitro transkripsjon og oversettelse (IVTT) reaksjonene å bli utført over lengre perioder er beskrevet. Videre er det gitt en omfattende oversikt over maskinvare og programvare som kreves for å automatisere og vedlikeholde disse reaksjonene for langvarig varighet.

En flerlags Mikrovæskebasert plattform for gjennomføring av langvarig Cell-gratis Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Prototyping syntetiske gennettverk er sterkt forbedret ved bruk av cellefrie genuttrykkssystemer. Vår protokoll beskriver fabrikasjonsprosessen for flerlags mikrofluidisk strømningsreaktor og viser at en slik enhet kan brukes til langvarig cellefritt uttrykk for GFP. Cellefrie proteinuttrykk i kombinasjon med mikrofluidiske strømningsreaktorer gir den raske prototypingplattformen for utforming av syntetiske biologiske enheter.Hele dette oppsettet er svært allsidig og kan tilpasses ledning av biokjemiske eller kjemiske reaksjoner som krever høye nivåer av kontroll. Å sikre stabiliteten til den cellefrie reaksjonsløsningen er kritisk og vanskelig å oppnå. Pass på å fokusere på å gi tilstrekkelig kjøling og bruke slangen som er angitt i denne protokollen.Fabrikasjon og utarbeidelse av eksperimentell plattform krever tilkobling av mange individuelle komponenter, en prosess som kan være vanskelig å følge uten visuelle hjelpemidler. Til å begynne med følger du med i den medfølgende tekstprotokollen for å fremstille den mikrofluidiske enheten og for å sette opp den pneumatiske kontroll- og strømningstrykksreguleringen som skal brukes til å kontrollere ventilene som er kritiske for denne enheten. For å sette opp off-chip kjøling, begynne med å kveilet en lengde på PTFE rør på det kalde ansiktet av en Peltier element og fest spolen med tape.Kontroller at den ene enden av PTFE-slangen er koblet til reservoarene i strømningslagtrykkkontrollsystemet, og at den andre enden ikke stikker ut mer enn én centimeter fra Peltier-overflaten. Sett deretter inn en fem til 10 centimeter lang PEEK-slange i den utstående enden av PTFE-slangen. Påfør en tilstrekkelig mengde termisk forbindelse på det varme ansiktet til Peltier-elementet og legg den på den kalde platen på vannblokken.Sørg for at slangen, Peltier-elementet og kjøleblokken er i direkte kontakt med hverandre til enhver tid. Deretter kobler Du Peltier-elementet til temperaturregulatoren ved hjelp av en seriell busskontakt slik at spenningen som følger med Peltier, kan reguleres. Plasser deretter en termistor på Peltier-overflaten og koble utgangen til temperaturregulatoren.Etter å ha slått på vannkjøleren, tilpass spenningen som følger med Peltier til temperaturen er stabil ved fire grader Celsius. For hver kontrollkanal av mikrofluidisk enhet kuttet en lengde på standard rør som er en meter lang. I den ene enden setter du inn pinnen på en 23-gauge, en halv tomme Luer stub og i den andre enden setter inn en tilkoblingspinne i rustfritt stål.Koble Luer-stubben til en hannluer 3/32 tommers piggete nylonkontakt og sett inn piggen på kontakten i en lengde med polyuretanrør. Sett deretter denne polyuretanslangen direkte inn i en av magnetventilene. Deretter feste en 23 gauge halv tomme Luer stub til en sprøyte og sette dette inn i en tre til fire centimeter lang stykke standard rør.Plasser den åpne enden av denne slangen i et reservoar av ultra rent vann og fyll sprøyten med ultra rent vann. Nummerer hver kontrollkanal på mikrofluidisk enhet som vist her. For kanaler fire til 29 finner du den tilsvarende slangen og setter metallpinnen inn i den åpne enden av slangen festet til sprøyten.Injiser deretter vann i kontrollkanalslangen til halvparten av lengden er fylt. Deretter kobler du slangen fra sprøyten og setter kontaktpinnen i rustfritt stål inn i det tilsvarende hullet på mikrofluidisk enhet. Gjenta dette trinnet for alle kontrollkanalene.Nå bruker du kontrollgrensesnittet til å åpne alle magnetventilene. Dette vil presse væsken i kontrollkanalslangen som tvinger den inn i mikrofluidisk enhet og lukker alle membranbaserte ventiler i enheten. For hver av de ubeskyedde reagensene kutte en meter lengde av standard rør for å koble reservoaret utløpet til mikrofluidic enheten innløp.Ta den ene enden av slangen og sett dette inn i reservoaret, slik at slangen når bunnen av reservoaret. Beholderens røruttak skal strammes slik at en lufttett forsegling oppnås. Sett deretter inn en stift i den åpne enden av slangen.Deretter fester du en 23 gauge halv tommers Luer stub til slutten av en en en milliliter sprøyte. Legg til en kort lengde med standard rør til Luer stub. Plasser enden av slangen i ønsket reagensoppløsning og fyll sprøyten med reagensen.Sett deretter kontaktpinnen i rustfritt stål inn i polyuretanslangen som er koblet til sprøyten, og fyll slangen med reagensen. Ved bruk av små reaksjonsvolumer vil reagensen ikke komme inn i reservoaret, og selve slangen vil fungere som reservoar. Når du er ferdig, kobler du fra sprøyten og setter kontaktpinnen inn i et av strømningslaginntakene på mikrofluidisk enhet.Deretter legger du press på hvert av reservoarene ved hjelp av trykkregulatorprogramvaren for å tvinge reagensene inn i mikrofluidisk enhet. Sørg for at vannkjøleren og Peltier-elementene er slått på med overflatetemperaturen på Peltier satt til fire grader Celsius. Monter kjøleoppsettet så nær mikrofluidisk enhet som mulig for å minimere det ukjølte volumet mellom Peltier og enhetens innløp.Koble deretter den ene millilitersprøyten til en 23 gauge halv tommers Luer stub med en kort lengde av standard rør festet til enden. Trekk inn den avkjølede reagensen for å fylle sprøyten. Deretter kobler du PEEK-slangen til sprøyten via bindeslangen og legger konstant trykk på sprøyten som tvinger reagensen gjennom PEEK-slangen og inn i PTFE-slangen.Koble til slutt PEEK-slangen fra sprøyten og sett den direkte inn i strømningskanalinntakene på mikrofluidisk enhet. Når trykket påføres, vil den avkjølte reagensen bli tvunget inn i mikrofluidisk enhet. Sørg for at mikrofluidisk enhet er festet på mikroskopet scenen med all kontroll og strømningslag rør festet og lukke eventuelle åpninger på inkubatoren.Deretter setter du omgivelsestemperaturen til inkubatoren til 29 grader Celsius. Forsikre deg deretter om at kjølesystemet er slått på og er satt til fire grader Celsius før eksperimentet startes. Kontroller at trykket som brukes på strømningskanaltrykkregulatoren er satt til 800 millibar og bruker programvaren, sett utgangstrykket for hver enkelt strømningskanal til mellom 20 og 100 millibar.Kontroller at trykk på kontrollkanalen magnetventiler er en bar for kanaler en til åtte og tre bar for kanaler ni til 29. Lukk deretter utløpet på enheten ved å trykke på kanal 29 og samtidig trykke inn kontrollkanaler én til tre og 15 til 28. Deretter selektivt trykk på kontrollkanalene til multiplekseren slik at en enkelt valgt reagens kan strømme inn i enheten.Bruk mikroskopet til å overvåke fjerning av luft og deretter sørge for at alle reagenser flyter riktig uten å innføre luftbobler. Ved hjelp av den medfølgende programvarepakken definerer du datafeltene som er knyttet til kalibreringsprosessen, som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen. Deretter bestemmer du væskevolumet som er forskjøvet fra hver reaktor under ett enkelt tilsigtrinn ved å utføre kalibreringsprotokollen.Følg trinnene som presenteres av kontrollprogramvaren for å fullføre analysen av kalibreringseksperimentet og for å bestemme oppdateringsforholdet for hver ringreaktor i mikrofluidisk enhet. Til slutt angir du de nødvendige verdiene for ønsket eksperiment i det virtuelle kontrollgrensesnittet. Start eksperimentell protokoll ved å trykke på utfør eksperimentknappen i kontrollgrensesnittet.Under et kalibreringseksperiment fylles reaktorene med en fluorofor hvis intensitet registreres etter hver fortynning. Reduksjonen i fluorescensintensiteten per fortynning avslører volumet av reaktorringen forskjøvet for det innstilte antallet tilsigstrinn. Dette volumet kalles oppdateringsforholdet.Gjennomsnittlig oppdateringsforhold og standardavvik vises for hvert fortynningstrinn i rødt. Syv av de åtte reaktorene viser svært lik atferd, men en reaktor viser svingninger etter den syvende fortynningssyklusen. Dette understreker behovet for unike oppdateringsforhold for hver av reaktorene.Den langvarige in vitro transkripsjon og oversettelsereaksjon vist her hadde 30% av reaktorvolumet forskjøvet hvert 14.6 minutt. To reaktorer av mikrofluidisk enhet der det brukes som blanks. Alle de andre reaktorene besto av 75% in vitro transkripsjon og oversettelsereaksjonsløsning og 25% av enten ultra rent vann eller 2,5 nanomolar lineære DNA-maler koding for uttrykk for deGFP-proteinet.I alle fire reaktorer hvor DNA ble lagt til, var det klart deGFP-uttrykk. En reaktor viser et lavere fluorescenssignal. Dette kan skyldes ulikhet i flyt som resulterer i mindre DNA inn i reaktoren eller på grunn av variasjoner i reaktordimensjonene.Etter 14 timer ses en plutselig økning i signalet fra reaktorene som inneholder DNA. Dette skyldes at en luftboble kommer inn i strømningslaget på mikrofluidisk enhet. Ved gjenopptakelse av flyt, går eksperimentet tilbake til sin tidligere fluorescensintensitet.Cellefrie reaksjonsløsninger er gjenstand for nedbrytning over tid med mindre de er tilstrekkelig avkjølt, gjør kjøleprosessen beskrevet i denne protokollen av kritisk betydning. På grunn av plattformens allsidighet kan en rekke biokjemiske og kjemiske reaksjoner utføres på en presis og kontrollert måte. Anvendelsen av mikrofluidiske strømningsreaktorer har akselerert påfølgende design bygge testsykluser for prototyping doble genetiske kretser.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjelp av en Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell klemme som en robust, Microfluidic Intracellulær Levering Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Microfluidic plattform for måling Neutrofil Chemotaxis fra Ubehandlet Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-orgel Chip - En mikrofluid plattform for langsiktig Multi-vev coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-trinns variabel Høyde Fotolitografi for Valved Multilayer microfluidic enheter

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic Plattform med multiplekset Electronic Detection for Spatial Sporing av partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Performance-testing Platform for a Conduction Micropump with an FR-4 Copper-clad Electrode Plate

En Performance-testing plattform for en ledning Micropump med en FR-4 kobber-kledd elektrode Plate

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging roten håret morfologi av Arabidopsis frøplanter i en to-lags Microfluidic plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En Microfluidic plattform for langsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cellen gratis Protein uttrykk ved hjelp av den raskt voksende bakterie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...