Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Europeu de investigação, ERC (projecto n. 677313 BioCircuit) uma subvenção NWO-VIDI da organização neerlandesa de investigação científica (NWO, 723.016.003), financiamento do Ministério da educação, cultura e ciência (Gravity programas, 024.001.035 & 024.003.013), o programa de ciência da fronteira humana Grant RGP0032/2015, o Conselho Europeu de investigação no âmbito da União Europeia Horizonte 2020 programa de investigação e inovação Grant 723106, e um Swiss National Science Foundation Grant 200021_182019.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Um dispositivo microfluídico multicamada baseado em PDMS foi apresentado, e sua capacidade de sustentar reações de IVTT por períodos prolongados de tempo foi demonstrada. Embora bem adaptado para este exemplo específico, esta tecnologia pode concebìvel ser usada para inúmeras outras aplicações. O controle adicional sobre o fluxo de fluido-emparelhado com a capacidade de repor continuamente os reagentes de reação enquanto removendo (por) produtos-é ideal para reações contínuas da síntese, a investigação de vários comportamentos dinâmicos, e o simultâneo condução de múltiplas variações de uma única reacção.
Apesar do processo de fabricação relativamente simples de dispositivos baseados em PDMS, o uso deles requer uma extensa configuração de hardware. Compreendendo matrizes da válvula, reguladores de pressão, bombas de pressão, incubadoras, e unidades refrigerando, a transição da fabricação ao uso não é elementar, e exige um investimento inicial significativo. Além disso, a capacidade de configurar consistentemente e realizar experimentos bem-sucedidos com esses dispositivos requer um tempo significativo de investimento; um ponto que este manuscrito pretende abordar. No entanto, uma vez no local, toda a configuração pode ser modificada para um intervalo de finalidades. Além disso, a configuração de hardware compreende inúmeros elementos modulares, cada um dos quais pode ser expandido para permitir que projetos de dispositivos microfluídico mais complexos sejam empregados. Além disso, o design modular permite a substituição de componentes de hardware por alternativas de funcionamento semelhante, de modo que os usuários não estão limitados à configuração específica descrita aqui48,49.
A variabilidade entre dispositivos individuais e nas condições externas (como flutuações de pressão) pode resultar em imprecisões ao realizar experimentos usando esses dispositivos. Para abordar esse problema, uma calibração do sistema deve ser realizada antes de cada experimento, proporcionando uma taxa de atualização única para cada um dos reatores. Embora a calibração aborda as variações de dispositivo para dispositivo e experiência para experimento, é um processo demorado e não impecável. Fluidos com viscosidades diferentes não fluirão com a mesma taxa quando expostos a uma pressão idêntica, e como tal realizando a calibração com vários reagentes pode não produzir proporções de atualizaçãoidênticas. Este efeito é atenuado através da utilização de três canais de controle para a bomba peristalticamente os reagentes para o dispositivo microfluídico, em oposição a regular o fluxo, variando a pressão fornecida apenas. Como último recurso nos casos em que a disparidade na viscosidade é muito grande, uma relação de atualização única pode ser implementada para cada reagente individual realizando experimentos de calibração múltipla.
O uso de uma bomba peristáltica para injetar reagentes no dispositivo microfluídicos atenua os efeitos de usar soluções com viscosidades de variação, porém igualmente cria um problema secundário. Usando etapas discretas para bombear líquidos no dispositivo microfluídicos, significa que a definição das injeções em um único reator, é limitada pelo volume injetado ao executar um único ciclo da bomba. Dentro de nossa pesquisa este valor-determinado durante a calibração-é aproximadamente igual a 1%, indicando que um único ciclo da bomba descoloca aproximadamente 1% do volume do reator (aproximadamente 0,1 nL). Como tal, deslocar 30% do volume do reator exige a execução de 30 ciclos da bomba, com 23 ciclos da bomba da solução da reação de ivtt que está sendo adicionado, e somente 7 ciclos da bomba do ADN ou da água ultrapura que estão sendo adicionados. Embora seja suficiente para nossa pesquisa, protocolos experimentais alternativos podem encontrar problemas ao tentar adicionar um número maior de reagentes exclusivos, usar uma fraçãode atualização mais baixa ou adicionar volumes menores de um único reagente a um reator. Em tais casos, o design do dispositivo microfluídico pode ser adaptado para fornecer reatores com um volume maior. Um exemplo de tal é relatado em Niederholtmeyer et al.36.
Crucialmente, o dispositivo delineado dentro deste manuscrito permite que as reações sejam sustentadas por durações prolongadas, resultando em taxas de transcrição e tradução de estado estacionário. Ao injetar periodicamente novos reagentes nos reatores-e removendo os produtos de reação (por)-as reações são sustentadas e comportamentos dinâmicos complexos podem ser monitorados. Desta forma, uma plataforma foi criada que-até certo ponto-imita o ambiente celular. Além disso, esta plataforma possibilita a exploração da dinâmica do sistema, adaptando o período entre as injeções e a composição específica das injeções. Como resultado, esses dispositivos microfluílicos multicamadas são uma ferramenta poderosa para a caracterização e otimização de novas redes sintéticas que exibem um comportamento dinâmico complexo.

As células são capazes de perceber e responder ao seu ambiente usando complexas redes reguladoras dinâmicas1,2. O campo da biologia sintética utiliza nosso conhecimento dos componentes que ocorrem naturalmente compreendendo essas redes para projetar sistemas biológicos que podem ampliar a funcionalidade das células3,4. Inversamente, também é possível aprofundar a nossa compreensão das redes naturais que regem a vida através da concepção simplificada, análogos sintéticos de circuitos existentes ou por sistemas biológicos de engenharia de encaminhamento que exibem comportamentos que ocorrem naturalmente. A engenharia de de novo de tais sistemas biológicos é executada em uma forma bottom-up onde os circuitos genéticos novos ou as vias de sinalização são projetados em uma maneira racional, usando as peças bem definidas5,6. A combinação do design racional das redes com o projeto de sistemas biologicamente relevantes possibilita a caracterização e o estudo em profundidade de sistemas reguladores biológicos com vários níveis de abstração7.
As obras pioneiras de Elowitz e Leibler8 e Gardner et al.9 foram as primeiras a demonstrar a introdução bem-sucedida de redes genéticas sintéticas em hospedeiros celulares. Na década seguinte, numerosos pesquisadores continuaram a desenvolver esses sucessos iniciais, apesar do surgimento de várias limitações em relação à introdução de circuitos sintéticos nas células7,10,11 ,12. Idealmente, a introdução de circuitos sintéticos em hospedeiros celulares deve ocorrer de forma modular. Infelizmente, a complexidade do ambiente celular torna isso particularmente desafiador, com a função de muitas partes e redes sendo altamente dependentes do contexto12,13,14. Como resultado, as redes muitas vezes experimentam interações indesejadas com componentry hospedeiro nativo que pode afetar a função do circuito sintético. Da mesma forma, os componentes da rede exógena podem inibir os processos de acolhimento, competir por recursos compartilhados dentro do hospedeiro e influenciar acinética de crescimento15,16,17. Consequentemente, a fim de projetar e prever racionalmente o comportamento das redes sintéticas em um ambiente in vivo, é necessário um modelo abrangente de todas as dinâmicas de acolhimento e de circuitos específicos18.
Uma alternativa viável ao uso de hospedeiros celulares para a caracterização de redes sintéticas é a aplicação de tecnologias in vitro de transcrição e tradução (IVTT). Atuando como testbed para redes sintéticas, as reações são realizadas em soluções que compreendem todos os componentes necessários para possibilitar a expressão gênica19,20,21. Dessa forma, um ambiente biologicamente relevante, embora artificial, é criado no qual as redes sintéticas podem ser testadas22,23,24,25,26, 27,28. Uma grande vantagem do uso de soluções de IVTT é a capacidade de realizar reações em condições especificadas pelo usuário, com pesquisadores capazes de sintonizar a composição exata de cada reação2. Além disso, a abordagem sem célula permite o teste de alta taxa de transferência de redes sintéticas, uma vez que elimina a necessidade de executar demoradas etapas de clonagem celular. Como resultado, a duração dos ciclos de design-Build-Test sucessivos é significativamente reduzida29,30,31,32. O ciclo de design pode ser ainda mais acelerado através da utilização de técnicas de clonagem livre de células, como o conjunto de Gibson para rapidamente projetar novas redes, e através da construção de redes de modelos de DNA linear que-ao contrário dos plasmímetros necessários para in vivo Testing- pode ser amplificado através de reações em cadeia da polimerase (PCR)33,34.
As reações em lote são o método mais simples pelo qual as reações de IVTT podem ser executadas, exigindo um único vaso de reação em que todos os componentes da reação são combinados35. Tais reações são suficientes para a expressão da proteína e o teste de circuito básico contudo provam insuficiente ao tentar estudar o comportamento dinâmico a longo prazo de uma rede. Ao longo de uma reação em lote, os reagentes são esgotados ou sofrem degradação, resultando em uma diminuição contínua das taxas de transcrição e tradução. Além disso, como as reações progridem subprodutos que podem interferir com-ou inibir completamente-o funcionamento correto da rede. Em última análise, o uso de reatores de lote limita o comportamento dinâmico que pode ser observado, sendo que a regulação negativa é particularmente desafiadora para implementar5,36.
A versatilidade de sistemas de ivtt permite métodos alternativos múltiplos por que as reações prolongadas de ivtt podem ser executadas, variando do fluxo contínuo aos métodos baseados gota assim como umas aproximações mais simples da diálise2,30, 37,38,39,40. A aplicação de dispositivos microfluídico oferece aos usuários maior controle sobre suas reações, aumentando a taxa de transferência e minimizando os custos35,41,42, com cada abordagem específica tendo sua próprias vantagens. O uso do fluxo contínuo pode facilmente ser aperfeiçoado para rendimentos crescentes da expressão entretanto, a inabilidade remover eficazmente produtos específicos da reação faz o estudo do comportamento dinâmico não-trivial39. Embora empregando sistemas microfluídico baseados em gotas permite a triagem de alta produtividade de novas redes, a dificuldade de fornecer reagentes frescos para a reação resulta nas gotas que se assemelham a pequenas reações em lote de volume43. Os reatores à base de diálise permitem a introdução de reagentes frescos, bem como a remoção de alguns produtos de reação no entanto, moléculas de RNA e proteínas maiores se acumulam dentro do reator, sendo muito grande para difundir através dos poros da membrana. Além disso, grandes volumes de reagentes são necessários para sustentar essas reações por períodos prolongados30,44. Em 2013, maerkl et al. apresentaram um dispositivo microfluídico multicamada projetado especificamente para a realização de reações de ivtt prolongadas36,45. O uso de dispositivos microfluídico multicamadas permite o controle direto do fluxo de fluido, permitindo o redirecionamento do fluxo, bem como o isolamento do fluido em regiões específicas do dispositivo46,47. Estas regiões isoladas podem funcionar como câmaras independentes da reação da nanolitro-escala onde as reações de IVTT podem ser executadas. Ao longo de uma única reação de IVTT, injeções periódicas de reagentes frescos no reator são usadas para reabastecer componentes de IVTT e modelos de DNA. Simultaneamente, um volume igual da solução de reação antiga é deslocado, removendo produtos de reação. Desta forma, um ambiente fora de equilíbrio é mantido onde as taxas de transcrição basal e de tradução permanecem em estado estacionário, prolongando a vida útil das reações de IVTT e permitindo que comportamentos dinâmicos ricos ocorram. Aplicando esta abordagem, os pesquisadores são capazes de investigar as taxas cinéticas dos processos individuais que ocorrem dentro de um circuito específico, auxiliando na engenharia para a frente de novas redes genéticas. Por exemplo, Niederholtmeyer et al. implementaram essa abordagem para caracterizar vários elementos de um oscilador de anel genético, determinando as taxas cinéticas dos mesmos36. Em outros estudos, Yelleswarapu et al. mostraram que as taxas cinéticas do fator Sigma 28 (σ28) determinadas em condições de lote foram insuficientes para descrever o comportamento de um oscilador baseado em σ28, e que a adição de dados baseados em fluxo Previsões de modelo melhoradas do comportamento de rede22.
O objetivo deste manuscrito é apresentar um protocolo completo para a fabricação de dispositivos microfluílicos multicamadas capazes de realizar reações de IVTT de longo prazo. Além disso, este manuscrito descreverá todo o hardware e software necessários para realizar reações de IVTT prolongadas. A atuação do dispositivo microfluídico-necessário para controlar o fluxo de fluidos nele-é alcançada usando uma série de Válvulas pneumáticas que se conectam diretamente aos dispositivos microfluílicos através de comprimentos de tubulação. Por sua vez, as válvulas pneumáticas são controladas através de uma interface de controle virtual personalizada. O fluxo de fluido dentro dos dispositivos microfluílicos é conseguido usando a pressão contínua que é fornecida por um sistema de regulação de pressão comercialmente disponível. As reações de IVTT são executadas tipicamente entre 29 ° c e 37 ° c e uma incubadora do microscópio é usada para regular a temperatura durante reações. No entanto, a funcionalidade da mistura IVTT gradualmente se degrada quando armazenada acima de 4 ° c. Como tal, este manuscrito se expandirá no sistema de resfriamento de chip usado para resfriar a mistura de IVTT antes da injeção no dispositivo microfluídico. Em conclusão, este manuscrito fornece uma visão geral abrangente dos procedimentos necessários para realizar com sucesso reações de IVTT prolongadas usando um reator de fluxo microfluídico, de tal forma que outros pesquisadores poderão replicar essa tecnologia com relativa Facilidade.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

As limitações da biologia sintética Cell-Based estão tornando-se cada vez mais aparentes enquanto os investigadores visam desenvolver circuitos reguladores genéticos sintéticos maiores e mais complexos. A análise das redes reguladoras genéticas sintéticas in vivo é demorada e sofre de falta de controle ambiental, com componentes sintéticos exógenos interagindo com processos hospedeiros resultando em comportamento indesejado. Para superar essas questões, a caracterização sem células de novos circuitos está se tornando mais prevalente. As misturas in vitro de transcrição e tradução (IVTT) permitem a regulação do ambiente experimental e podem ser otimizadas para cada sistema único. Os protocolos apresentados aqui detalham a fabricação de um dispositivo microfluídico multicamada que pode ser utilizado para sustentar reações de IVTT para durações prolongadas. Em contraste com as reações em lote, onde os recursos são esgotados ao longo do tempo e (por-) os produtos se acumulam, o uso de dispositivos microfluídico permite a reposição de recursos, bem como a remoção de produtos de reação. Dessa forma, o ambiente celular é emulado pela manutenção de um ambiente fora de equilíbrio em que o comportamento dinâmico dos circuitos de genes pode ser investigado durante longos períodos de tempo. Para explorar plenamente o dispositivo microfluídico multicamada, hardware e software foram integrados para automatizar as reações de IVTT. Ao combinar as reações do IVTT com a plataforma microfluíica aqui apresentada, torna-se possível analisar de forma abrangente comportamentos de rede complexos, promovendo a compreensão dos mecanismos que regulam os processos celulares.

Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Descreve-se o processo de fabricação de um dispositivo microfluídico baseado em PDMS, multicamada, que permite a realização de reações in vitro de transcrição e tradução (IVTT) durante períodos prolongados. Além disso, uma visão geral abrangente do hardware e software necessários para automatizar e manter essas reações para durações prolongadas é fornecida.

Uma plataforma Microfluídico multicamada para a condução de expressão gênica sem células prolongada

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A prototipagem de redes genéticas sintéticas é muito melhorada pelo uso de sistemas de expressão genética livre de células. Nosso protocolo descreve o processo de fabricação do reator de fluxo microfluido multicamadas e mostra que tal dispositivo pode ser usado para uma expressão prolongada livre de células de GFP. Expressões proteicas livres de células em combinação com reatores de fluxo microfluido fornecem a plataforma de prototipagem rápida para o design de dispositivos biológicos sintéticos.Toda esta configuração é altamente versátil e pode ser adaptada para a condução de quaisquer reações bioquímicas ou químicas que exijam altos níveis de controle. Garantir a estabilidade da solução de reação sem células é fundamental e difícil de alcançar. Certifique-se de se concentrar em fornecer resfriamento suficiente e utilizar o tubo especificado neste protocolo.Fabricar e preparar a plataforma experimental requer a conexão de inúmeros componentes individuais, um processo que pode ser difícil de seguir sem auxílios visuais. Para começar, acompanhe o protocolo de texto que acompanha a fabricação do dispositivo microfluido e a configuração do controle pneumático e da regulação da pressão de fluxo que será usado para controlar as válvulas críticas a este dispositivo. Para configurar o resfriamento off-chip, comece enrolando um comprimento de entubação PTFE na face fria de um elemento Peltier e fixar a bobina com fita.Certifique-se de que uma extremidade da tubulação PTFE esteja conectada aos reservatórios do sistema de controle de pressão da camada de fluxo e que a outra extremidade não se projete mais de um centímetro da superfície peltier. Em seguida, insira um comprimento de cinco a 10 centímetros de tubo PEEK na extremidade saliente da tubulação PTFE. Aplique uma quantidade suficiente de composto térmico na face quente do elemento Peltier e coloque-o sobre a placa fria do bloco de água.Certifique-se de que o tubo, o elemento Peltier e o bloco de resfriamento estejam em contato direto um com o outro o tempo todo. Em seguida, conecte o elemento Peltier ao controlador de temperatura usando um conector de barramento serial para que a tensão fornecida ao Peltier possa ser regulada. Em seguida, coloque com segurança um ormistor na superfície peltier e conecte sua saída ao controlador de temperatura.Depois de ligar o bebedouro, adapte a tensão fornecida ao Peltier até que a temperatura esteja estável a quatro graus Celsius. Para cada canal de controle do dispositivo microfluido corte um comprimento de tubulação padrão que tem um metro de comprimento. Em uma extremidade, insira o pino de um medidor de 23, um stub Luer de meia polegada e na outra extremidade insira um pino de conexão de aço inoxidável.Conecte o stub Luer a um conector de nylon farpado luer de 3/32 polegadas e insira a barb do conector em um comprimento de tubo de poliuretano. Em seguida, insira este tubo de poliuretano diretamente em uma das válvulas solenoides. Em seguida, conecte um trecho Luer de meia polegada de calibre 23 a uma seringa e insira-o em uma peça de tubo padrão de três a quatro centímetros de comprimento.Coloque a extremidade aberta deste tubo em um reservatório de água ultra pura e encha a seringa com água ultra pura. Número cada canal de controle do dispositivo microfluido como mostrado aqui. Para os canais quatro a 29, encontre a tubulação correspondente e insira o pino de metal na extremidade aberta da tubulação presa à seringa.Em seguida, injete água na tubulação do canal de controle até que metade do comprimento tenha sido preenchido. Em seguida, desconecte a tubulação da seringa e insira o pino do conector de aço inoxidável no orifício correspondente do dispositivo microfluido. Repita este passo para todos os canais de controle.Agora, use a interface de controle para abrir todas as válvulas solenoides. Isso pressurizará o fluido dentro da tubulação do canal de controle forçando-o para dentro do dispositivo microfluido e fechando todas as válvulas baseadas em membrana dentro do dispositivo. Para cada um dos reagentes não cozidos corte um comprimento de metro de tubulação padrão para conectar a saída do reservatório às entradas do dispositivo microfluido.Pegue uma extremidade da tubulação e insira isso no reservatório garantindo que o tubo atinja a base do reservatório. A saída de tubulação do reservatório deve ser apertada para que uma vedação hermética seja alcançada. Em seguida, insira um pino de conexão inoxidável na extremidade aberta da tubulação.Em seguida, conecte um stub Luer de meia polegada de calibre 23 até a extremidade de uma seringa de um mililitro. Adicione um curto comprimento de tubulação padrão ao stub Luer. Coloque a extremidade da tubulação na solução de reagente desejada e encha a seringa com o reagente.Em seguida, insira o pino do conector de aço inoxidável na tubulação de poliuretano conectada à seringa e encha o tubo com o reagente. Ao utilizar pequenos volumes de reação, o reagente não entrará no reservatório e o tubo em si funcionará como o reservatório. Quando terminar, desconecte a seringa e insira o pino do conector em um dos orifícios de entrada da camada de fluxo do dispositivo microfluido.Em seguida, aplique pressão em cada um dos reservatórios usando o software regulador de pressão para forçar os reagentes para o dispositivo microfluido. Certifique-se de que o refrigerador de água e os elementos Peltier tenham sido ligados com a temperatura da superfície do Peltier fixada em quatro graus Celsius. Monte a configuração de resfriamento o mais próximo possível do dispositivo microfluido para minimizar o volume não legal entre o Peltier e a entrada do dispositivo.Em seguida, conecte a uma seringa mililitro a um stub Luer de meia polegada de calibre 23 com um comprimento curto de tubulação padrão presa à extremidade. Desenhe o reagente para ser resfriado para encher a seringa. Em seguida, conecte a tubulação PEEK à seringa através da tubulação conjuntiva e aplique pressão constante na seringa forçando o reagente através da tubulação PEEK e na tubulação PTFE.Por fim, desconecte a tubulação PEEK da seringa e insira-a diretamente nas entradas do canal de fluxo do dispositivo microfluido. Quando a pressão é aplicada, o reagente resfriado será forçado a entrar no dispositivo microfluido. Certifique-se de que o dispositivo microfluido esteja seguro no estágio do microscópio com toda a tubulação de camada de controle e fluxo anexada e feche quaisquer aberturas na incubadora.Em seguida, coloque a temperatura ambiente da incubadora para 29 graus Celsius. Em seguida, assegure-se de que o sistema de resfriamento foi ligado e está definido para quatro graus Celsius antes de iniciar o experimento. Verifique se as pressões aplicadas ao regulador de pressão do canal de fluxo estão definidas para 800 milibares e usando o software, defina a pressão de saída de cada canal de fluxo individual entre 20 e 100 milibares.Verifique se as pressões aplicadas nas válvulas solenoides do canal de controle é uma barra para os canais de um a oito e três barras para os canais nove a 29. Em seguida, feche a tomada do dispositivo pressurizando o canal 29 e simultaneamente despressurize os canais de controle de um a três e de 15 a 28. Em seguida, despressurize seletivamente os canais de controle do multiplexer para permitir que um único reagente selecionado flua para dentro do dispositivo.Use o microscópio para monitorar a remoção do ar e, posteriormente, garantir que todos os reagentes fluam corretamente sem introduzir bolhas de ar. Usando o pacote de software fornecido, configure os campos de dados relacionados ao processo de calibração conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Determine posteriormente o volume de fluido deslocado de cada reator durante uma única etapa de entrada executando o protocolo de calibração.Acompanhe as etapas apresentadas pelo software de controle para concluir a análise do experimento de calibração e determinar a razão de atualização de cada reator de anel no dispositivo microfluido. Por fim, defina os valores necessários para o experimento desejado dentro da interface de controle virtual. Inicie o protocolo experimental pressionando o botão de teste de execução na interface de controle.Durante um experimento de calibração, os reatores são preenchidos com um fluoróforo cuja intensidade é registrada após cada diluição. A diminuição da intensidade de fluorescência por diluição revela o volume do anel do reator deslocado para o número definido de etapas de entrada. Este volume é chamado de razão de atualização.A relação média de atualização e o desvio padrão são mostrados para cada passo de diluição em vermelho. Sete dos oito reatores mostram comportamento muito semelhante, no entanto um reator mostra flutuações após o sétimo ciclo de diluição. Isso destaca a necessidade de relações de atualização únicas para cada um dos reatores.A transcrição in vitro prolongada e a reação de tradução mostrada aqui tiveram 30% do volume do reator deslocado a cada 14,6 minutos. Dois reatores do dispositivo microfluido onde usado como espaços em branco. Todos os outros reatores consistiram em 75% de transcrição in vitro e solução de reação de tradução e 25% de água ultra pura ou 2,5 modelos de DNA linear nanomolar codificando para a expressão da proteína degfp.Em todos os quatro reatores onde o DNA foi adicionado, havia uma clara expressão de DEGFP. Um reator exibe um sinal de fluorescência inferior. Isso pode ser causado pela disparidade no fluxo, resultando em menos DNA entrando no reator ou devido a variações nas dimensões do reator.Após 14 horas, um aumento repentino é visto no sinal dos reatores contendo DNA. Isso é causado por uma bolha de ar que entra na camada de fluxo do dispositivo microfluido. Após a retomada do fluxo, o experimento retorna à intensidade anterior da fluorescência.As soluções de reação sem células estão sujeitas à degradação ao longo do tempo, a menos que sejam suficientemente resfriadas, faça com que o processo de resfriamento descrito neste protocolo de importância crítica. Devido à versatilidade da plataforma, uma variedade de reações bioquímicas e químicas pode ser conduzida de forma precisa e controlada. A aplicação de reatores de fluxo microfluido acelerou ciclos sucessivos de projeto de construção de ciclos de teste para prototipagem de circuitos genéticos duplos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

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Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Bioengenharia

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Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Plataforma microfluídica para medição de quimiotaxia de neutrófilos não transformados Sangue Total

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