Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

Эта работа была поддержана Европейским исследовательским советом, ERC (проект N. 677313 BioCircuit) Грант NWO-VIDI от Нидерландской организации научных исследований (NWO, 723.016.003), финансирование от Министерства образования, культуры и науки (гравитация программы, 024.001.035 и 024.003.013), Программа науки о границах человека Грант RGP0032/2015, Европейский исследовательский совет в рамках научно-исследовательской программы Европейского союза Horizon 2020 Грант 723106, а также Грант Швейцарского национального научного фонда 200021_182019.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Было представлено многослойное микрофлюидное устройство на базе PDMS, и было продемонстрировано его способность поддерживать реакции IVTT в течение длительных периодов времени. Хотя эта технология хорошо подходит для этого конкретного примера, она может быть использована для многих других приложений. Дополнительный контроль над потоком жидкости - в паре с возможностью непрерывного пополнения реагентов реакции при удалении (по)продукты - идеально подходит для непрерывного синтеза реакций, исследования различных динамических поведения, и одновременное проведение нескольких вариаций одной реакции.
Несмотря на относительно простой процесс изготовления устройств на основе PDMS, их использование требует обширной аппаратной настройки. Состоит из клапанных массивов, регуляторов давления, насосов давления, инкубаторов и холодильных установок, переход от изготовления к использованию не является элементарным и требует значительных первоначальных инвестиций. Кроме того, возможность последовательной настройки и проведения успешных экспериментов с этими устройствами требует значительных временных вложений; точка, которую эта рукопись направлена на адрес. Однако, как только на месте, вся установка может быть изменена для целого ряда целей. Кроме того, аппаратная установка включает в себя многочисленные модульные элементы, каждый из которых может быть расширен, чтобы позволить использовать более сложные микрофлюидные конструкции устройств. Кроме того, модульная конструкция позволяет заменить аппаратные компоненты аналогичным образом функционирующих альтернатив, таким образом, что пользователи не ограничиваются конкретной установки, описанной здесь48,49.
Вариабельность между отдельными устройствами и во внешних условиях (например, колебания давления) может привести к неточностям при проведении экспериментов с использованием этих устройств. Для решения этой проблемы перед каждым экспериментом должна быть проведена калибровка системы, обеспечивающая уникальное коэффициент обновления для каждого из реакторов. В то время как калибровка направлена на изменение устройства к устройству и эксперимент, это трудоемкий процесс, а не безупречный. Жидкости с различной вязкостию не будут течь с той же скоростью при воздействии одинакового давления, и как таковые выполняющие калибровку с несколькими реагентами не могут давать идентичные коэффициенты обновления. Этот эффект смягчается за счет использования трех каналов управления для перистальтно перекачивать реагенты в микрофлюидное устройство, в отличие от регулирования потока путем изменения только поставляемого давления. В крайнем случае в тех случаях, когда разница в вязкости очень велика, для каждого отдельного реагента можно внедрить уникальное коэффициент обновления, выполняя несколько экспериментов по калибровке.
Использование перистальтического насоса для введения реагентов в микрофлюидное устройство смягчает эффекты использования растворов с различной вязкосткой, однако это также создает второстепенную проблему. Использование дискретных шагов для перекачки жидкостей в микрофлюидное устройство означает, что разрешение инъекций в один реактор, ограничено объемом впрыскиваемых при выполнении одного цикла насоса. В рамках наших исследований это значение - определяется в ходе калибровки - примерно равно 1%, что свидетельствует о том, что один цикл насоса вытесняет примерно 1% от объема реактора (около 0,1 нл). Таким образом, вытеснение 30% объема реактора требует выполнения 30 циклов насоса, с 23 циклов насоса решения реакции IVTT добавляются, и только 7 циклов насоса ДНК или ультрачистой воды добавляются. Хотя для наших исследований достаточно, альтернативные экспериментальные протоколы могут столкнуться с проблемами при попытке добавить большее количество уникальных реагентов, использовать более низкий Освежающий фракции, или добавить меньшие объемы одного реагента в реактор. В таких случаях конструкция микрожидкости может быть адаптирована для обеспечения реакторов большим объемом. Пример такого приводится в Нидерхольтмайер и др.36.
Важно отметить, что устройство, описанное в этой рукописи, позволяет поддерживать реакции в течение длительных сроков, что приводит к стабильному состоянию транскрипции и ставок перевода. Периодически впрысывая новые реагенты в реакторы - и удаляя реакцию (по)продукты - реакции устойчивы и сложные динамические поведения могут контролироваться. Таким образом, была создана платформа, которая - в некоторой степени - имитирует клеточную среду. Кроме того, эта платформа позволяет исследовать динамику системы, адаптируя период между инъекциями и специфическим составом инъекций. В результате эти многослойные микрофлюидные устройства являются мощным инструментом для характеристики и оптимизации новых синтетических сетей, которые отображают сложное динамичное поведение.

Клетки способны чувствовать и реагировать на окружающую среду с помощью сложных динамических регуляторныхсетей1,2. Область синтетической биологии использует наши знания о естественных компонентов, входящих в эти сети для инженера биологических систем, которые могут расширить функциональность клеток3,4. И наоборот, можно также продолжить наше понимание природных сетей, регулирующих жизнь, проектируя упрощенные синтетические аналоги существующих схем или передние инженерные биологические системы, которые демонстрируют естественное поведение. Де Ново-инженерия таких биологических систем осуществляется снизу вверх моды, где новые генетические схемы или сигнальные пути инженерии в рациональной манере, используя четко определенные части5,6. Сочетание рационального проектирования сетей с проектированием биологически значимых систем позволяет углубленной характеристики и изучение биологических систем регулирования с различными уровнями абстракции7.
Первопроходцы Elowitz и Leibler8 и Gardner et al.9 первыми продемонстрировали успешное внедрение синтетических генетических сетей в клеточные хосты. В следующем десятилетии, многочисленные исследователи продолжают опираться на эти первоначальные успехи, несмотря на появление ряда ограничений в отношении введения синтетических схем в клетки7,10,11 ,12. В идеале внедрение синтетических схем в сотовые хосты должно происходить модульным способом. К сожалению, сложность клеточной среды делает это особенно сложным, с функцией многих частей и сетей в высокой степени контекст зависит12,13,14. В результате сети часто сталкиваются с нежелательными взаимодействиями с компонентами родного узла, которые могут повлиять на функцию синтетической цепи. Аналогичным образом, компоненты экзогенной сети могут препятствовать принимающим процессам, конкурировать за общие ресурсы внутри хоста и влиять на кинетику роста15,16,17. Следовательно, для того, чтобы рационально проектировать и прогнозировать поведение синтетических сетей в среде in vivo,требуетсякомплексная модель всей динамики, специфичной для хоста и цепи.
Целесообразной альтернативой использованию сотовых хостов для характеристики синтетических сетей является применение технологий транскрипции и перевода (IVTT). Выступая в качестве испытательного дна для синтетических сетей, реакции выполняются в решениях, включающих все компоненты, необходимые для обеспечения экспрессиигенов 19,20,21. Таким образом, создается биологически актуальная, хотя и искусственная среда, в рамках которой синтетические сети могут быть протестированы22,23,24,25,26, 27,28. Основным преимуществом использования решений IVTT является способность выполнять реакции в условиях, определенных пользователем, при этом исследователи способны настроить точный состав каждой реакции2. Кроме того, подход без клеток позволяет проводить высокопроизводительные испытания синтетических сетей, поскольку он устраняет необходимость выполнения трудоемких клеточных шагов клонирования. В результате продолжительность последовательной конструкции - сборки - циклов испытаний значительно сокращается29,30,31,32. Цикл проектирования может быть еще более ускорен за счет использования клеток свободного клонирования методов, таких как сборка Гибсон быстро инженер новых сетей, а также путем построения сетей из линейных шаблонов ДНК, которые - в отличие от плазмиды, необходимые для тестирования in vivo - может быть усилена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)33,34.
Реакция пакета самый простой метод которым реакции IVTT могут быть выполнены, требуя одиночного сосуда реакции wherein все компоненты реакции совмещены35. Такие реакции достаточны для экспрессии белка и базового тестирования цепи, но оказываются недостаточными при попытке изучить долгосрочное динамическое поведение сети. В ходе пакетной реакции реагенты либо истощаются, либо подвергаются деградации, что приводит к постоянному снижению частоты транскрипции и перевода. Кроме того, по мере развития реакций накапливаются побочные продукты, которые могут помешать - или полностью ингибировать - правильное функционирование сети. В конечном счете, использование пакетных реакторов ограничивает динамическое поведение, которое можно наблюдать, с отрицательным регулированием, особенно сложным для реализации5,36.
Универсальность систем IVTT позволяет несколько альтернативных методов, с помощью которых длительные реакции IVTT могут быть выполнены, начиная от непрерывного потока на основе капель методы, а также более простые подходы диализа2,30, 37,38,39,40. Применение микрофлюидных устройств предлагает пользователям повышенный контроль над их реакциями при одновременном увеличении пропускной связи и минимизации затрат35,41,42, с каждым конкретным подходом, имеющим свой собственных преимуществ. Использование непрерывного потока может быть легко оптимизирован для увеличения доходности выражения однако, неспособность эффективно удалить конкретные продукты реакции делает изучение динамического поведения нетривиальным39. В то время как использование капель на основе микрофлюидных систем позволяет высокой пропускной результате скрининга новых сетей, трудность поставки свежих реагентов для реакции приводит к капель, напоминающих небольшой объем пакетных реакций43. Реакторы на основе диализа позволяют вводить свежие реагенты, а также удаление некоторых продуктов реакции, однако, молекулы РНК и более крупные белки накапливаются в реакторе, будучи слишком большим, чтобы рассеиваться через мембранные поры. Кроме того, большие объемы реагентов необходимы для поддержания этих реакций в течение длительных периодов30,44. В 2013 году Maerkl et al. представили многослойное микрофлюидное устройство, разработанное специально для проведения длительных реакций IVTT36,45. Использование многослойных микрофлюидных устройств позволяет прямо контролировать поток жидкости, что позволяет перенаправить поток, а также изоляцию жидкости в определенных областях устройства46,47. Эти изолированные области могут функционировать как независимые нанолитровые камеры реакции, в которых могут быть выполнены реакции IVTT. В ходе одной реакции IVTT периодические инъекции свежих реагентов в реактор используются для пополнения компонентов ИВТт и шаблонов ДНК. Одновременно с ним вытесняется равный объем старого реакционного раствора, удаляя реакционные продукты. Таким образом, вне равновесия сохраняется среда, где базальная транскрипция и скорость перевода остаются в стабильном состоянии, продлевая срок службы ivTT реакций и позволяя происходить богатое динамическое поведение. Применяя этот подход, исследователи могут исследовать кинетические темпы отдельных процессов, происходящих в рамках конкретной цепи, помогая в передовой инженерии новых генетических сетей. Например, Niederholtmeyer et al. внедрили этот подход, чтобы охарактеризовать различные элементы осциллятора генетического кольца, определив кинетические показатели36. В дальнейших исследованиях, Yelleswarapu et al. показали, что кинетическая скорость сигмы фактора 28 (No28),определяемых в условиях партии, была недостаточной для описания поведения осциллятора на основе28евро, и что добавление данных на основе потока улучшенные прогнозы моделей сетевого поведения22.
Целью данной рукописи является представление полного протокола для изготовления многослойных микрофлюидных устройств, способных выполнять долгосрочные реакции IVTT. Кроме того, в данной рукописи будет описано все аппаратное и программное обеспечение, необходимое для выполнения длительных реакций IVTT. Активация микрофлюидного устройства, необходимого для контроля потока жидкостей в ней, достигается с помощью серии пневматических клапанов, которые подключаются непосредственно к микрофлюидным устройствам по длине труб. В свою очередь, пневматические клапаны управляются с помощью специально созданного виртуального интерфейса управления. Поток жидкости в микрофлюидных устройствах достигается с помощью непрерывного давления, которое обеспечивается коммерчески доступной системой регулирования давления. Реакции IVTT обычно выполняются между 29 и 37 градусами По Цельсию, а микроскопийный инкубатор используется для регулирования температуры во время реакций. Тем не менее, функциональность смеси IVTT постепенно ухудшается при хранении выше 4 градусов по Цельсию. Таким образом, эта рукопись будет расширяться на вне чипа системы охлаждения, используемой для охлаждения смеси IVTT до инъекции в микрофлюидное устройство. В заключение, эта рукопись обеспечивает всеобъемлющий обзор процедур, необходимых для успешного выполнения длительных реакций IVTT с использованием микрофлюидного реактора потока, так что другие исследователи смогут воспроизвести эту технологию с относительной Простота.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

Ограничения клеточной синтетической биологии становятся все более очевидными по мере того, как исследователи стремятся разработать более крупные и более сложные синтетические генетические регулятивные схемы. Анализ синтетических генетических регуляторных сетей in vivo занимает много времени и страдает от отсутствия экологического контроля, при этом экзогенные синтетические компоненты взаимодействуют с процессами пребывания, что приводит к нежелательному поведению. Чтобы преодолеть эти проблемы, безклеточная характеристика новых схем становится все более распространенным. В пробирке транскрипции и перевода (IVTT) смеси позволяют регулировать экспериментальную среду и могут быть оптимизированы для каждой уникальной системы. Представленные здесь протоколы подробно изготавливают изготовление многослойного микрофлюидного устройства, которое может быть использовано для поддержания реакции IVTT в течение длительного времени. В отличие от пакетных реакций, когда ресурсы истощаются с течением времени и (по-) продукты накапливаются, использование микрофлюидных устройств позволяет пополнить ресурсы, а также удаление реакционных продуктов. Таким образом, клеточная среда эмулируется путем поддержания вне равновесия среды, в которой динамическое поведение генных цепей может быть исследовано в течение длительных периодов времени. Чтобы полностью использовать многослойное микрофлюидное устройство, оборудование и программное обеспечение были интегрированы для автоматизации реакций IVTT. Объединив реакции IVTT с микрофлюидной платформой, представленной здесь, становится возможным всесторонне анализировать комплексное поведение сети, способя наше понимание механизмов, регулирующих клеточные процессы.

Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Описан процесс изготовления, многослойного, микрофлюидного устройства, позволяющего выполнять в пробирке транскрипцию и перевод (IVTT) в течение длительных периодов времени. Кроме того, предоставляется всеобъемлющий обзор аппаратного и программного обеспечения, необходимого для автоматизации и поддержания этих реакций в течение длительного времени.

Многослойная микрофлюидная платформа для проведения длительного выражения генов без клеток

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Прототипирование синтетических генных сетей значительно улучшается за счет использования систем экспрессии генов, свободных от клеток. Наш протокол описывает процесс изготовления многослойного реактора микрофлюидного потока и показывает, что такое устройство может быть использовано для длительного безклеточного выражения GFP. Безклеточные белковые выражения в сочетании с реакторами микрофлюидного потока обеспечивают быструю платформу прототипирования для проектирования синтетических биологических устройств.Вся эта установка является весьма универсальным и может быть адаптирована для проведения любых биохимических или химических реакций, требующих высокого уровня контроля. Обеспечение стабильности решения для реакции без клеток имеет решающее значение и трудно достичь. Не забудьте сосредоточиться на обеспечении достаточного охлаждения и использовать трубки, указанные в этом протоколе.Изготовление и подготовка экспериментальной платформы требует соединения многочисленных отдельных компонентов, процесс, который может быть трудно следовать без визуальных средств. Для начала следуйте сопроводительному текстовому протоколу, чтобы изготовить микрофлюидное устройство и настроить пневматическое регулирование управления и давления потока, которое будет использоваться для управления клапанами, критически важными для этого устройства. Чтобы настроить вне чип охлаждения, начните с катушки длины PTFE трубки на холодную сторону элемента Peltier и обеспечить катушки с лентой.Убедитесь, что один конец трубки PTFE подключен к резервуарам системы управления давлением слоя потока, а другой конец выступает не более чем на один сантиметр от поверхности Пелтиера. Затем вставьте длину от 5 до 10 сантиметров труб PEEK в выступающий конец трубки PTFE. Нанесите достаточное количество теплового соединения на горячее лицо элемента Пелтиера и поместите его на холодную плиту водяного блока.Убедитесь, что трубки, элемент Peltier и охлаждающий блок находятся в непосредственном контакте друг с другом в любой момент. Затем подключите элемент Peltier к регулятору температуры с помощью разъема серийного автобуса, чтобы напряжение, поставляемое в Peltier, можно было регулировать. Затем надежно поместите термистор на поверхность Пелтиера и соедините его выход с температурный контроллер.Включив охладитель воды, адаптируем напряжение, поставляемое в Пелтиер, до тех пор, пока температура не будет стабильной на уровне четырех градусов по Цельсию. Для каждого канала управления микрофлюидного устройства вырезать длину стандартных труб, что составляет один метр в длину. С одной стороны, вставьте штифт 23 калибра, один почерпяйма Luer заглушки и на другом конце вставить нержавеющей стали соединительный штифт.Подключите заглушку Luer к мужскому разъему Luer 3/32 дюйма из колючего нейлона и вставьте колючку разъема в длину полиуретановых труб. Затем вставьте эту полиуретановую трубку прямо в один из соленоидных клапанов. Затем прикрепите 23-дюймовый полудюймовый заглушку Luer к шприцу и вставьте это в трех-четырехметровый кусок стандартной трубки.Поместите открытый конец этой трубки в резервуар ультра чистой воды и заполнить шприц с ультра чистой водой. Номер каждого канала управления микрофлюидного устройства, как показано здесь. Для каналов от четырех до 29, найти соответствующие трубки и вставить металлический штифт в открытый конец трубки прилагается к шприцу.Затем ввините воду в трубы канала управления до тех пор, пока половина длины не будет заполнена. Затем отсоедините трубку от шприца и вставьте булавку разъема из нержавеющей стали в соответствующее отверстие микрофлюидного устройства. Повторите этот шаг для всех каналов управления.Теперь используйте интерфейс управления, чтобы открыть все соленоидные клапаны. Это будет оказывать давление на жидкость в пределах канала управления трубки заставляя его в микрофлюидное устройство и закрытие всех мембранных клапанов в устройстве. Для каждого из неохлажденых реагентов вырезать метр длиной стандартных труб для подключения розетки резервуара для микрофлюидных входов устройства.Возьмите один конец трубки и вставьте это в резервуар, гарантируя, что трубка достигает основания резервуара. Выход труб резервуара должен быть затянут так, чтобы герметичное уплотнение было достигнуто. Затем вставьте булавку нержавеющего соединения в открытый конец трубки.Затем прикрепите 23-дюймовый заглушку Luer к концу одного миллилитрового шприца. Добавьте короткую длину стандартных труб в заглушку Luer. Поместите конец трубки в желаемый раствор реагента и заполните шприц реагентом.Затем вставьте булавку разъема из нержавеющей стали в полиуретановые трубки, подключенные к шприцу, и заполните трубку реагентом. При использовании небольших объемов реакции реагент не войдет в резервуар, а сам тюбинг будет выступать в качестве резервуара. После завершения, отсоедините шприц и вставьте штифт разъема в одно из отверстий в входе слоя потока микрофлюидного устройства.Затем нанесите давление на каждый из резервуаров с помощью программного обеспечения регулятора давления, чтобы заставить реагенты в микрофлюидное устройство. Убедитесь, что охладитель воды и элементы Peltier были включены с температурой поверхности Peltier установлен на четыре градуса по Цельсию. Установка охлаждения как можно ближе к микрофлюидным устройствам, чтобы свести к минимуму неохлажденый объем между Peltier и входом устройства.Затем подключите один миллилитровый шприц к 23 калибра половины дюйма Luer заглушки с короткой длиной стандартных труб прилагается к концу. Нарисуйте в, чтобы быть охлажденным реагентом, чтобы заполнить шприц. Затем подключите трубки PEEK к шприцу через соединительной трубки и применяем постоянное давление на шприц, заставляя реагент через трубки PEEK и в трубки PTFE.Окончательно отключите трубку PEEK от шприца и вставьте его сразу в входы канала потока микрофлюидного прибора. При давлении охлажденный реагент будет зануден в микрофлюидное устройство. Убедитесь, что микрофлюидное устройство является безопасным на стадии микроскопа со всеми контроля и потока слоя трубки прилагается и закрыть любые отверстия на инкубаторе.Далее установите температуру окружающей среды инкубатора до 29 градусов по Цельсию. Затем убедитесь, что система охлаждения была включена и установлена на четыре градуса по Цельсию до начала эксперимента. Убедитесь, что давление, оказываемое на регулятор давления канала потока, установлено на уровне 800 миллибар и с помощью программного обеспечения установите выходное давление каждого отдельного канала потока до 20-100 миллибар.Убедитесь, что давление, применяемое к соленоидным клапанам канала управления, составляет один бар для каналов от одного до восьми и три бара для каналов с девяти по 29. Затем закройте розетку устройства, давя на канал 29 и одновременно разгерметизируйте каналы управления от 1 до 3 и с 15 по 28. Затем выборочно разгерметизируйте каналы управления мультиплексера, чтобы один выбранный реагент попал в устройство.Используйте микроскоп для мониторинга удаления воздуха и впоследствии убедитесь, что все реагенты текут правильно, не вводя пузырьки воздуха. Используя предоставленный пакет программного обеспечения, найте поля данных, связанные с процессом калибровки, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Впоследствии определите объем жидкости, перемещенной из каждого реактора в течение одного шага притока, выполняя протокол калибровки.Следуйте вместе с шагами, представленными программным обеспечением управления, чтобы завершить анализ эксперимента по калибровке и определить коэффициент обновления каждого кольцевого реактора в микрофлюидном устройстве. Наконец, установите необходимые значения для желаемого эксперимента в виртуальном интерфейсе управления. Инициировать экспериментальный протокол, нажав кнопку выполнения эксперимента в интерфейсе управления.Во время калибровочного эксперимента реакторы заполняются флюорофором, интенсивность которого регистрируется после каждого разбавления. Снижение интенсивности флуоресценции на разбавление показывает объем реакторного кольца, смещенного для установленного количества ступеней притока. Этот объем называют коэффициентом обновления.Среднее соотношение обновления и стандартное отклонение отображаются для каждого шага разбавления красным цветом. Семь из восьми реакторов показывают очень похожее поведение, однако один реактор показывает колебания после седьмого цикла разбавления. Это подчеркивает необходимость уникальных коэффициентов обновления для каждого из реакторов.Длительная стенограмма in vitro и реакция перевода, показанные здесь, имели 30% объема реактора, перемещенного каждые 14,6 минут. Два реактора микрофлюидного устройства, где используется в качестве заготовки. Все остальные реакторы состояли из 75% транскриптии in vitro и решения реакции перевода и 25% либо ультра чистой воды, либо 2,5 наномолярных линейных шаблонов ДНК, кодирующих для выражения белка deGFP.Во всех четырех реакторах, где была добавлена ДНК, было четкое выражение deGFP. Один реактор отображает более низкий сигнал флуоресценции. Это может быть вызвано несоответствием потока, приводящего к меньшему вводу ДНК в реактор, или изменениями размеров реактора.Через 14 часов в сигнале реакторов, содержащих ДНК, наблюдается внезапное увеличение. Это вызвано пузырьком воздуха, входящим в слой потока микрофлюидного устройства. После возобновления потока эксперимент возвращается к прежней интенсивности флуоресценции.Решения для реакции без клеток со временем подвергаются деградации, если они не достаточно охлаждаются, что делает процесс охлаждения, описанный в этом протоколе, критически важным. Благодаря универсальности платформы, различные биохимические и химические реакции могут быть проведены в точной и контролируемой манере. Применение реакторов микрофлюидного потока ускорило последовательные циклы испытаний конструкции сборки для прототипирования двойных генетических схем.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Сотовый Сжатие как Robust, микрофлюидных внутриклеточного Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Микрофлюидных Платформа для измерения хемотаксис нейтрофилов из необработанного цельной крови

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-орган Chip - Микрожидкостных Платформа для долгосрочных Multi-ткани сокультивирования

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Многоступенчатая переменной высоты фотолитографии для Valved Многослойные микрожидком устройств

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Микрожидкостных Платформа с уплотненными электронным детектором для пространственного слежения частиц

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Performance-testing Platform for a Conduction Micropump with an FR-4 Copper-clad Electrode Plate

Тестирование производительности платформы для проведения микронасосом с пластиной электрода медью FR-4

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Изображения корневого волоска морфология Arabidopsis саженцев в два слоя Microfluidic платформа

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Microfluidic платформа для продольной Imaging в Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Ячейки бесплатно белка выражение с использованием быстро растущих бактерией Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...