Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Consejo Europeo de Investigación, ERC (proyecto n. 677313 BioCircuit) una subvención NWO-VIDI de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO, 723.016.003), financiación del Ministerio de Educación, Cultura y Ciencia (Gravity 024.001.035 y 024.003.013), la Subvención del Programa de Ciencia de la Frontera Humana RGP0032/2015, el Consejo Europeo de Investigación en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea Grant 723106, y una beca de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias 200021_182019.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Se ha presentado un dispositivo microfluídico multicapa basado en PDMS y se ha demostrado su capacidad para mantener reacciones IVTT durante períodos prolongados de tiempo. Aunque es adecuada para este ejemplo específico, esta tecnología puede utilizarse para numerosas otras aplicaciones. El control adicional sobre el flujo de fluidos , junto con la capacidad de reponer continuamente los reactivos de reacción mientras se retiran (por)productos - es ideal para reacciones de síntesis continuas, la investigación de diversos comportamientos dinámicos y la conducción de múltiples variaciones de una sola reacción.
A pesar del proceso de fabricación relativamente sencillo de los dispositivos basados en PDMS, el uso de los mismos requiere una amplia configuración de hardware. Compuesto por matrices de válvulas, reguladores de presión, bombas de presión, incubadoras y unidades de refrigeración, la transición de la fabricación al uso no es elemental y requiere una inversión inicial significativa. Además, la capacidad de configurar y realizar experimentos exitosos con estos dispositivos de forma consistente requiere una inversión significativa en el tiempo; un punto que este manuscrito pretende abordar. Sin embargo, una vez en su lugar, toda la configuración se puede modificar para una gama de propósitos. Además, la configuración del hardware comprende numerosos elementos modulares, cada uno de los cuales se puede ampliar para permitir el empleo de diseños de dispositivos microfluídicos más complejos. Además, el diseño modular permite la sustitución de componentes de hardware por alternativas de funcionamiento similar, de modo que los usuarios no se limitan a la configuración específica descrita aquí48,49.
La variabilidad entre dispositivos individuales y en las condiciones externas (como las fluctuaciones de presión) puede dar lugar a imprecisiones al realizar experimentos con estos dispositivos. Para abordar este problema, se debe realizar una calibración del sistema antes de cada experimento, proporcionando una relación de actualización única para cada uno de los reactores. Mientras que la calibración aborda las variaciones de dispositivo a dispositivo y experimento a experimento, es un proceso que consume mucho tiempo y no es impecable. Los fluidos con viscosidades diferentes no fluirán con la misma velocidad cuando se exponen a una presión idéntica, y como tal realizar la calibración con múltiples reactivos puede no producir relaciones de actualización idénticas. Este efecto se atenúa mediante el uso de tres canales de control para bombear peristálticamente los reactivos en el dispositivo microfluídico, en lugar de regular el flujo variando únicamente la presión suministrada. Como último recurso en los casos en que la disparidad en la viscosidad es muy grande, se puede implementar una relación de actualización única para cada reactivo individual mediante la realización de múltiples experimentos de calibración.
El uso de una bomba peristáltica para inyectar reactivos en el dispositivo microfluídico atenúa los efectos del uso de soluciones con diferentes viscosidades, sin embargo, también crea un problema secundario. El uso de pasos discretos para bombear fluidos en el dispositivo microfluídico, significa que la resolución de las inyecciones en un solo reactor, está limitada por el volumen inyectado al realizar un solo ciclo de bomba. Dentro de nuestra investigación, este valor - determinado durante la calibración - es aproximadamente igual al 1%, lo que indica que un solo ciclo de bomba desplaza aproximadamente el 1% del volumen del reactor (aproximadamente 0,1 nL). Como tal, el desplazamiento del 30% del volumen del reactor requiere la ejecución de 30 ciclos de bomba, con 23 ciclos de bomba de la solución de reacción IVTT que se añaden, y sólo 7 ciclos de bomba de ADN o agua ultrapura que se añaden. Aunque son suficientes para nuestra investigación, los protocolos experimentales alternativos pueden encontrar problemas al intentar agregar un mayor número de reactivos únicos, utilizar una fracciónde actualización más baja o agregar volúmenes más pequeños de un solo reactivo a un reactor. En tales casos, el diseño del dispositivo microfluídico se puede adaptar para proporcionar a los reactores un volumen mayor. Un ejemplo de ello se informa en Niederholtmeyer et al.36.
Fundamentalmente, el dispositivo descrito dentro de este manuscrito permite que las reacciones se mantengan durante duraciones prolongadas, lo que resulta en tasas de transcripción y traducción en estado estacionario. Mediante la inyección periódica de nuevos reactivos en los reactores - y la eliminación de la reacción (por) productos - las reacciones son sostenidas y se pueden controlar comportamientos dinámicos complejos. De esta manera, se ha creado una plataforma que, hasta cierto punto, imita el entorno celular. Además, esta plataforma permite la exploración de la dinámica del sistema, adaptando el período entre las inyecciones y la composición específica de las inyecciones. Como resultado, estos dispositivos microfluídicos multicapa son una poderosa herramienta para la caracterización y optimización de nuevas redes sintéticas que muestran un comportamiento dinámico complejo.

Las células son capaces de detectar y responder a su entorno utilizando complejas redes reguladoras dinámicas1,2. El campo de la biología sintética utiliza nuestro conocimiento de los componentes naturales que componen estas redes para diseñar sistemas biológicos que puedan ampliar la funcionalidad de las células3,4. Por el contrario, también es posible profundizar en nuestra comprensión de las redes naturales que rigen la vida mediante el diseño de análogos sintéticos simplificados de los circuitos existentes o mediante sistemas biológicos de ingeniería directa que exhiben comportamientos naturales. La ingeniería de novo de estos sistemas biológicos se realiza de abajo hacia arriba donde nuevos circuitos genéticos o vías de señalización se diseñan de manera racional, utilizando partes bien definidas5,6. La combinación del diseño racional de las redes con el diseño de sistemas biológicamente relevantes permite la caracterización y el estudio en profundidad de los sistemas reguladores biológicos con varios niveles de abstracción7.
Las obras pioneras de Elowitz y Leibler8 y Gardner et al.9 fueron las primeras en demostrar la exitosa introducción de redes genéticas sintéticas en los huéspedes celulares. En la década siguiente, numerosos investigadores han continuado construyendo sobre estos éxitos iniciales a pesar de la aparición de varias limitaciones con respecto a la introducción de circuitos sintéticos en las células7,10,11 ,12. Idealmente, la introducción de circuitos sintéticos en los hosts celulares debe ocurrir de una manera modular. Desafortunadamente, la complejidad del entorno celular hace que esto sea particularmente difícil, con la función de muchas partes y redes altamente dependientes del contexto12,13,14. Como resultado, las redes a menudo experimentan interacciones no deseadas con componentes host nativos que pueden afectar a la función del circuito sintético. Del mismo modo, los componentes de la red exógena pueden inhibir los procesos de host, competir por recursos compartidos dentro del host e influir en la cinética de crecimiento15,16,17. En consecuencia, con el fin de diseñar y predecir racionalmente el comportamiento de las redes sintéticas en un entorno in vivo, se requiere un modelo integral de todas las dinámicas específicas del host y del circuito18.
Una alternativa viable al uso de hosts celulares para la caracterización de redes sintéticas es la aplicación de tecnologías de transcripción y traducción in vitro (IVTT). Actuando como banco de pruebas para redes sintéticas, las reacciones se realizan en soluciones que comprenden todos los componentes necesarios para permitir la expresión génica19,20,21. De esta manera, se crea un entorno biológicamente relevante, aunque artificial, en el que se pueden probar las redes sintéticas22,23,24,25,26, 27,28. Una ventaja importante del uso de soluciones IVTT es la capacidad de realizar reacciones en condiciones especificadas por el usuario, con investigadores capaces de ajustar la composición precisa de cada reacción2. Además, el enfoque sin células permite realizar pruebas de alto rendimiento de redes sintéticas, ya que elimina la necesidad de realizar pasos de clonación celular que consumen mucho tiempo. Como resultado, la duración del diseño sucesivo - construcción - ciclos de prueba se reduce significativamente29,30,31,32. El ciclo de diseño se puede acelerar aún más mediante la utilización de técnicas de clonación sin células como el ensamblaje De Gibson para diseñar rápidamente redes novedosas, y mediante la construcción de redes a partir de plantillas de ADN lineales que - a diferencia de los plásmidos necesarios para las pruebas in vivo - se puede amplificar a través de reacciones en cadena de polimerasa (PCR)33,34.
Las reacciones por lotes son el método más simple mediante el cual se pueden realizar reacciones IVTT, que requieren un único recipiente de reacción en el que todos los componentes de reacción se combinan35. Tales reacciones son suficientes para la expresión de proteínas y las pruebas de circuitos básicos, pero resultan insuficientes al intentar estudiar el comportamiento dinámico a largo plazo de una red. En el transcurso de una reacción por lotes, los reactivos se agotan o se degradan, lo que resulta en una disminución continua de las tasas de transcripción y traducción. Además, a medida que avanzan los subproductos de las reacciones, se acumulan que pueden interferir con - o inhibir por completo - el correcto funcionamiento de la red. En última instancia, el uso de reactores por lotes limita el comportamiento dinámico que se puede observar, con una regulación negativa particularmente difícil de implementar5,36.
La versatilidad de los sistemas IVTT permite múltiples métodos alternativos mediante los cuales se pueden realizar reacciones IVTT prolongadas, que van desde el flujo continuo hasta los métodos basados en gotas, así como enfoques de diálisis más simples2,30, 37,38,39,40. La aplicación de dispositivos microfluídicos ofrece a los usuarios un mayor control sobre sus reacciones al tiempo que aumenta el rendimiento y minimiza los costes35,41,42, con cada enfoque específico ventajas propias. El uso de flujo continuo se puede optimizar fácilmente para aumentar los rendimientos de expresión, sin embargo, la incapacidad para eliminar eficazmente productos de reacción específicos hace que el estudio del comportamiento dinámico no sea trivial39. Mientras que el empleo de sistemas microfluídicos basados en gotas permite el cribado de alto rendimiento de redes novedosas, la dificultad de suministrar nuevos reactivos a la reacción resulta en las gotas que se asemejan a reacciones por lotes de pequeño volumen43. Los reactores basados en diálisis permiten la introducción de reactivos frescos, así como la eliminación de algunos productos de reacción, sin embargo, las moléculas de ARN y proteínas más grandes se acumulan dentro del reactor, siendo demasiado grandes para difundir a través de los poros de membrana. Además, se requieren grandes volúmenes de reactivos para sostener estas reacciones durante períodos prolongados30,44. En 2013, Maerkl y otros presentaron un dispositivo microfluídico multicapa diseñado específicamente para la realización de reacciones IVTT prolongadas36,45. El uso de dispositivos microfluídicos multicapa permite el control directo sobre el flujo de fluidos, lo que permite la redirección del flujo, así como el aislamiento de fluido en regiones específicas del dispositivo46,47. Estas regiones aisladas pueden funcionar como cámaras de reacción independientes a escala de nanolitros en las que se pueden realizar reacciones IVTT. En el transcurso de una sola reacción IVTT, se utilizan inyecciones periódicas de reactivos frescos en el reactor para reponer componentes de IVTT y plantillas de ADN. Simultáneamente, se desplaza un volumen igual de la solución de reacción antigua, eliminando los productos de reacción. De esta manera, se mantiene un entorno fuera de equilibrio donde las tasas de transcripción y traducción basales permanecen en estado estacionario, prolongando la vida útil de las reacciones IVTT y permitiendo que se produzcan comportamientos dinámicos enriquecidos. Mediante la aplicación de este enfoque, los investigadores son capaces de investigar las tasas cinéticas de los procesos individuales que ocurren dentro de un circuito específico, ayudando en la ingeniería directa de nuevas redes genéticas. Por ejemplo, Niederholtmeyer y otros implementaron este enfoque para caracterizar varios elementos de un oscilador de anillo genético, determinando las tasas cinéticas delmismo 36. En estudios posteriores, Yelleswarapu y otros mostraron que las tasas cinéticas del factor de sigma 28(28) determinadas en condiciones de lote eran insuficientes para describir el comportamiento de un oscilador basado en el número28,y que la adición de datos basados en flujo predicciones de modelo mejoradas del comportamiento de la red22.
El objetivo de este manuscrito es presentar un protocolo completo para la fabricación de dispositivos microfluídicos multicapa capaces de realizar reacciones IVTT a largo plazo. Además, este manuscrito describirá todo el hardware y software necesarios para realizar reacciones IVTT prolongadas. El accionamiento del dispositivo microfluídico - necesario para controlar el flujo de fluidos en él - se logra mediante una serie de válvulas neumáticas que se conectan directamente a los dispositivos microfluídicos a través de longitudes de tubería. A su vez, las válvulas neumáticas se controlan a través de una interfaz de control virtual personalizada. El flujo de fluido dentro de los dispositivos microfluídicos se logra mediante presión continua que es proporcionada por un sistema de regulación de presión disponible comercialmente. Las reacciones IVTT se realizan típicamente entre 29 oC y 37 oC y se utiliza una incubadora de microscopio para regular la temperatura durante las reacciones. Sin embargo, la funcionalidad de la mezcla IVTT se degrada gradualmente cuando se almacena por encima de 4 oC. Como tal, este manuscrito se expandirá en el sistema de enfriamiento fuera de chip utilizado para enfriar la mezcla de IVTT antes de la inyección en el dispositivo microfluídico. En conclusión, este manuscrito proporciona una visión general completa de los procedimientos necesarios para realizar con éxito reacciones IVTT prolongadas utilizando un reactor de flujo microfluídico, de modo que otros investigadores podrán replicar esta tecnología con aflojar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

Las limitaciones de la biología sintética basada en células son cada vez más evidentes a medida que los investigadores tienen como objetivo desarrollar circuitos reguladores genéticos sintéticos más grandes y complejos. El análisis de las redes reguladoras genéticas sintéticas in vivo consume mucho tiempo y sufre de una falta de control ambiental, con componentes sintéticos exógenos que interactúan con los procesos del huésped dando como resultado un comportamiento no deseado. Para superar estos problemas, la caracterización sin células de los circuitos novedosos es cada vez más frecuente. Las mezclas de transcripción y traducción in vitro (IVTT) permiten la regulación del entorno experimental y se pueden optimizar para cada sistema único. Los protocolos presentados aquí detallan la fabricación de un dispositivo microfluídico multicapa que se puede utilizar para sostener reacciones IVTT durante duraciones prolongadas. A diferencia de las reacciones por lotes, donde los recursos se agotan con el tiempo y (por) se acumulan productos, el uso de dispositivos microfluídicos permite la reposición de recursos, así como la eliminación de productos de reacción. De esta manera, el entorno celular se emula manteniendo un entorno fuera de equilibrio en el que el comportamiento dinámico de los circuitos genéticos puede ser investigado durante largos períodos de tiempo. Para explotar al máximo el dispositivo microfluídico multicapa, el hardware y el software se han integrado para automatizar las reacciones IVTT. Mediante la combinación de reacciones IVTT con la plataforma microfluídica presentada aquí, se hace posible analizar exhaustivamente comportamientos complejos de la red, promoviendo nuestra comprensión de los mecanismos que regulan los procesos celulares.

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A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Se describe el proceso de fabricación de un dispositivo microfluídico multicapa basado en PDMS que permite realizar reacciones de transcripción y traducción in vitro (IVTT) durante períodos prolongados. Además, se proporciona una visión general completa del hardware y el software necesarios para automatizar y mantener estas reacciones durante duraciones prolongadas.

Una plataforma microfluídica multicapa para la conducción de la expresión génica sin células prolongada

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

La creación de prototipos de redes genéticas sintéticas se mejora considerablemente mediante el uso de sistemas de expresión génica libres de células. Nuestro protocolo describe el proceso de fabricación para el reactor de flujo microfluídico multicapa y muestra que dicho dispositivo se puede utilizar para la expresión prolongada libre de células de GFP. Las expresiones de proteínas libres de células en combinación con reactores de flujo microfluídico proporcionan la plataforma de prototipado rápido para el diseño de dispositivos biológicos sintéticos.Toda esta configuración es altamente versátil y se puede adaptar para la conducción de cualquier reacción bioquímica o química que requiera altos niveles de control. Garantizar la estabilidad de la solución de reacción libre de células es fundamental y difícil de lograr. Asegúrese de centrarse en proporcionar suficiente refrigeración y utilizar el tubo especificado en este protocolo.La fabricación y preparación de la plataforma experimental requiere la conexión de numerosos componentes individuales, un proceso que puede ser difícil de seguir sin ayudas visuales. Para empezar, siga el protocolo de texto adjunto para fabricar el dispositivo microfluídico y configurar el control neumático y la regulación de la presión de flujo que se utilizará para controlar las válvulas críticas para este dispositivo. Para configurar el enfriamiento fuera de chip, comience enrollando una longitud de tubo de PTFE en la cara fría de un elemento Peltier y asegure la bobina con cinta adhesiva.Asegúrese de que un extremo del tubo de PTFE esté conectado a los depósitos del sistema de control de presión de la capa de flujo y de que el otro extremo sobresalga no más de un centímetro de la superficie de Peltier. A continuación, inserte una longitud de cinco a 10 centímetros de tubo PEEK en el extremo saliente de la tubería de PTFE. Aplique una cantidad suficiente de compuesto térmico sobre la cara caliente del elemento Peltier y colóquelo en la placa fría del bloque de agua.Asegúrese de que el tubo, el elemento Peltier y el bloque de refrigeración estén en contacto directo entre sí en todo momento. A continuación, conecte el elemento Peltier al controlador de temperatura mediante un conector de bus serie para que se pueda regular la tensión suministrada al Peltier. A continuación, coloque de forma segura un termistor en la superficie Peltier y conecte su salida al controlador de temperatura.Después de encender el enfriador de agua, adapte la tensión suministrada al Peltier hasta que la temperatura sea estable a cuatro grados centígrados. Para cada canal de control del dispositivo microfluídico cortar una longitud de tubería estándar que es de un metro de largo. En un extremo, inserte el pasador de un talón Luer de 23 pulgadas, una media pulgada y, en el otro extremo, inserte un pasador de conexión de acero inoxidable.Conecte el talón Luer a un conector de nylon con púas Luer de 3/32 pulgadas macho e inserte la púa del conector en una longitud de tubo de poliuretano. A continuación, inserte este tubo de poliuretano directamente en una de las válvulas solenoides. A continuación, conecte un talón Luer de media pulgada de calibre 23 a una jeringa e insértelo en una pieza de tubo estándar de tres a cuatro centímetros de largo.Coloque el extremo abierto de este tubo en un depósito de agua ultra pura y llene la jeringa con agua ultra pura. Número cada canal de control del dispositivo microfluídico como se muestra aquí. Para los canales de cuatro a 29, busque el tubo correspondiente e inserte el pasador de metal en el extremo abierto del tubo unido a la jeringa.A continuación, inyecte agua en el tubo del canal de control hasta que se haya llenado la mitad de la longitud. A continuación, desconecte el tubo de la jeringa e inserte el pasador del conector de acero inoxidable en el orificio correspondiente del dispositivo microfluídico. Repita este paso para todos los canales de control.Ahora, utilice la interfaz de control para abrir todas las válvulas solenoides. Esto presurizará el fluido dentro del tubo del canal de control forzándolo en el dispositivo microfluídico y cerrando todas las válvulas basadas en membrana dentro del dispositivo. Para cada uno de los reactivos no refrigerados cortar una longitud de medidor de tubería estándar para conectar la salida del depósito a las entradas de dispositivo microfluídico.Tome un extremo del tubo e insértelo en el depósito asegurándose de que el tubo llegue a la base del depósito. La salida del tubo del depósito debe apretarse para que se logre un sello hermético. A continuación, inserte un pasador de conexión inoxidable en el extremo abierto del tubo.A continuación, coloque un talón Luer de media pulgada de calibre 23 al final de una jeringa de un mililitro. Añada una longitud corta de tubos estándar al talón Luer. Coloque el extremo del tubo en la solución de reactivo deseada y llene la jeringa con el reactivo.A continuación, inserte el pasador del conector de acero inoxidable en el tubo de poliuretano conectado a la jeringa y llene el tubo con el reactivo. Cuando se utilizan pequeños volúmenes de reacción, el reactivo no entrará en el depósito y el tubo en sí actuará como el depósito. Cuando haya terminado, desconecte la jeringa e inserte el pasador del conector en uno de los orificios de entrada de la capa de flujo del dispositivo microfluídico.A continuación, aplique presión a cada uno de los depósitos utilizando el software regulador de presión para forzar los reactivos en el dispositivo microfluídico. Asegúrese de que el enfriador de agua y los elementos Peltier se han encendido con la temperatura superficial del Peltier ajustada a cuatro grados Centígrados. Monte la configuración de refrigeración lo más cerca posible del dispositivo microfluídico para minimizar el volumen no refrigerado entre el Peltier y la entrada del dispositivo.A continuación, conecte la jeringa de un mililitro a un talón Luer de media pulgada de calibre 23 con una longitud corta de tubo estándar unido al extremo. Dibuje el reactivo a enfriar para llenar la jeringa. A continuación, conecte el tubo PEEK a la jeringa a través del tubo de conexión y aplique una presión constante a la jeringa forzando el reactivo a través del tubo PEEK y en el tubo de PTFE.Por último, desconecte el tubo PEEK de la jeringa e insértelo directamente en las entradas del canal de flujo del dispositivo microfluídico. Cuando se aplica presión, el reactivo refrigerado se forzará a entrar en el dispositivo microfluídico. Asegúrese de que el dispositivo microfluídico esté seguro en la etapa del microscopio con todos los tubos de control y capa de flujo conectados y cierre cualquier abertura en la incubadora.A continuación, establezca la temperatura ambiente de la incubadora en 29 grados centígrados. A continuación, asegúrese de que el sistema de refrigeración se ha encendido y se establece en cuatro grados Celsius antes de iniciar el experimento. Compruebe que las presiones aplicadas al regulador de presión del canal de flujo se establecen en 800 milibar y, utilizando el software, ajuste la presión de salida de cada canal de flujo individual a entre 20 y 100 milibar.Compruebe que las presiones aplicadas a las válvulas solenoides del canal de control son una barra para los canales uno a ocho y tres bar para los canales nueve a 29. A continuación, cierre la salida del dispositivo presurizando el canal 29 y despresurizar simultáneamente los canales de control del uno al tres y del 15 al 28. A continuación, despresuriza selectivamente los canales de control del multiplexor para permitir que un solo reactivo seleccionado fluya en el dispositivo.Utilice el microscopio para controlar la extracción de aire y, posteriormente, asegurarse de que todos los reactivos fluyan correctamente sin introducir burbujas de aire. Utilizando el paquete de software proporcionado, configure los campos de datos relacionados con el proceso de calibración como se describe en el protocolo de texto adjunto. Posteriormente, determine el volumen de fluido desplazado de cada reactor durante un único paso de entrada mediante la ejecución del protocolo de calibración.Siga los pasos presentados por el software de control para completar el análisis del experimento de calibración y determinar la relación de actualización de cada reactor de anillo en el dispositivo microfluídico. Por último, establezca los valores necesarios para el experimento deseado dentro de la interfaz de control virtual. Inicie el protocolo experimental pulsando el botón realizar experimento en la interfaz de control.Durante un experimento de calibración, los reactores se llenan con un fluoróforo cuya intensidad se registra después de cada dilución. La disminución de la intensidad de fluorescencia por dilución revela el volumen del anillo del reactor desplazado para el número establecido de pasos de entrada. Este volumen se denomina relación de actualización.La relación de actualización media y la desviación estándar se muestran para cada paso de dilución en rojo. Siete de los ocho reactores muestran un comportamiento muy similar, sin embargo, un reactor muestra fluctuaciones después del séptimo ciclo de dilución. Esto pone de relieve la necesidad de proporciones de actualización únicas para cada uno de los reactores.La prolongada transcripción in vitro y la reacción de traducción mostrada aquí tenían el 30% del volumen del reactor desplazado cada 14,6 minutos. Dos reactores del dispositivo microfluídico donde se utilizan como espacios en blanco. Todos los demás reactores comprendían una solución de reacción de transcripción y traducción in vitro del 75% y el 25% de agua ultra pura o 2,5 plantillas de ADN lineal nanomolares que codifican para la expresión de la proteína deGFP.En los cuatro reactores donde se añadió ADN, había una expresión clara de deGFP. Un reactor muestra una señal de fluorescencia inferior. Esto podría ser causado por la disparidad en el flujo que resulta en menos ADN que entra en el reactor o debido a variaciones en las dimensiones del reactor.Después de 14 horas, se observa un aumento repentino en la señal de los reactores que contienen ADN. Esto es causado por una burbuja de aire que entra en la capa de flujo del dispositivo microfluídico. Tras la reanudación del flujo, el experimento vuelve a su intensidad de fluorescencia anterior.Las soluciones de reacción sin células están sujetas a degradación con el tiempo a menos que estén lo suficientemente enfriadas, haga que el proceso de enfriamiento descrito en este protocolo de importancia crítica. Debido a la versatilidad de la plataforma, una variedad de reacciones bioquímicas y químicas se pueden llevar a cabo de una manera precisa y controlada. La aplicación de reactores de flujo microfluídico ha acelerado los sucesivos ciclos de prueba de construcción de diseño para la creación de prototipos de doble circuito genético.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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