Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet, ERC (projekt n. 677313 BioCircuit), ett NWO-VIDI-stipendium från den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO, 723.016.003), finansiering från undervisnings-, kultur-och vetenskapsministeriet (Gravity program, 024.001.035 & 024.003.013), Human Frontier Science program Grant RGP0032/2015, Europeiska forskningsrådet inom Europeiska unionens Horisont 2020 forsknings-och innovationsprogram Grant 723106, och en schweizisk National Science Foundation Grant 200021_182019.

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

En PDMS-baserade Multilayer mikroflödessystem enhet har presenterats, och dess förmåga att upprätthålla ivtt reaktioner under längre tid har visats. Även om väl lämpad för detta specifika exempel, kan denna teknik tänkas användas för många andra program. Den extra kontrollen över vätskeflödet-ihopkopplad med förmågan att kontinuerligt fylla på reaktionsreagens samtidigt som man tar bort (av) produkter-är idealisk för kontinuerliga syntes reaktioner, utredning av olika dynamiska beteenden och samtidig överledning av flera varianter av en enda reaktion.
Trots den relativt enkla tillverkningsprocessen av PDMS-baserade enheter kräver användningen av dessa en omfattande hårdvaruinstallation. Bestående av ventil kedjor, tryckregulatorer, tryck pumpar, inkubatorer och kylaggregat är övergången från tillverkning till användning inte elementär, och kräver en betydande initial investering. Dessutom kräver förmågan att konsekvent sätta upp och utföra lyckade experiment med dessa enheter en betydande tid-investeringar; en punkt som detta manuskript syftar till att ta itu med. Men en gång på plats, kan hela installationen ändras för en rad syften. Dessutom, hårdvara setup omfattar många modulära element, som var och en kan utökas för att tillåta mer komplexa mikroflödessystem enhet mönster som skall användas. Dessutom möjliggör den modulära designen utbyte av maskinvarukomponenter genom liknande fungerande alternativ, så att användarna inte är begränsade till den specifika inställning som beskrivs här48,49.
Variationer mellan enskilda enheter och i de yttre förhållandena (t. ex. tryckfluktuationer) kan resultera i felaktigheter när du utför experiment med hjälp av dessa enheter. För att lösa problemet bör en kalibrering av systemet utföras före varje experiment, vilket ger ett unikt uppdaterings förhållande för var och en av reaktorerna. Även om kalibreringen åtgärdar variationer mellan enhet och enhet och experiment till experiment, är det en tidskrävande process och inte felfri. Vätskor med olika viskositeter kommer inte att flöda med samma hastighet när de utsätts för samma tryck, och som sådan utför kalibreringen med flera reagenser kan inte ge identiska uppdaterings förhållanden. Denna effekt dämpas genom att använda tre styr kanaler för att peristaltiskt pumpa reagenser i mikroflödessystem enheten, i motsats till reglering av flödet genom att variera det levererade trycket endast. Som en sista utväg i fall där skillnaden i viskositet är mycket stor, kan ett unikt uppdaterings förhållande implementeras för varje enskild reagens genom att utföra flera kalibrerings experiment.
Användning av en Peristaltisk pump för att injicera reagenser i mikroflödessystem enheten dämpar effekterna av att använda lösningar med varierande viskositeter, men det skapar också ett sekundärt problem. Använda diskreta steg för att pumpa vätskor i mikroflödessystem enheten, innebär att upplösningen av injektioner i en enda reaktor, begränsas av volymen injiceras när du utför en enda pump cykel. Inom vår forskning är detta värde-fastställt under kalibreringen-ungefär lika med 1%, vilket indikerar att en enda pump cykel förflyttar cirka 1% av reaktor volymen (ca 0,1 nL). Som sådan, undantränger 30% av reaktor volymen kräver utförandet av 30 pumpcykler, med 23 pumpcykler av ivtt reaktions lösning tillsätts, och endast 7 pumpcykler av DNA eller ultrarent vatten som tillsätts. Även om det är tillräckligt för vår forskning, kan alternativa experimentella protokoll stöta på problem när man försöker lägga till ett större antal unika reagenser, använda en lägre uppdaterings fraktion, eller lägga till mindre volymer av en enda reagens till en reaktor. I sådana fall kan mikrofluidic-enhetens design anpassas för att ge reaktorer en större volym. Ett exempel på sådant rapporteras i Niederholtmeyer et al.36.
Det är avgörande att den anordning som beskrivs i detta manuskript medger att reaktioner kan upprätthållas under längre perioder, vilket leder till att transkription och omräkningskurser vid steady-state upprätthålls. Genom att regelbundet injicera nya reagenser i reaktorerna-och ta bort reaktionsprodukter (biprodukter)-är reaktionerna ihållande och komplexa dynamiska beteenden kan övervakas. På detta sätt har en plattform skapats som-i viss mån-härmar den cellulära miljön. Vidare, denna plattform möjliggör utforskning av systemets dynamik, genom att anpassa perioden mellan injektioner och den specifika sammansättningen av injektionerna. Som ett resultat, dessa Multilayer mikroflödessystem enheter är ett kraftfullt verktyg för karakterisering och optimering av nya syntetiska nätverk som visar komplexa dynamiskt beteende.

Celler kan känna och reagera på sin omgivning med hjälp av komplexa dynamiska reglerings nätverk1,2. Området syntetisk biologi utnyttjar vår kunskap om de naturligt förekommande komponenterna som omfattar dessa nätverk för att konstruera biologiska system som kan utöka funktionaliteten i cellerna3,4. Omvänt är det också möjligt att vidareutveckla vår förståelse av de naturliga nätverk som styr livet genom att designa förenklade, syntetiska analoger av befintliga kretsar eller genom frambyggnads biologiska system som uppvisar naturligt förekommande beteenden. De Novo Engineering av sådana biologiska system utförs i en bottom-up-mode där nya genetiska kretsar eller signalvägar är konstruerade på ett rationellt sätt, med hjälp av väldefinierade delar5,6. Genom att kombinera den rationella utformningen av nätverk med utformningen av biologiskt relevanta system kan man fördjupa karakteriseringen och studera biologiska regleringssystem med olika abstraktionsnivåer7.
De banbrytande verken av Elowitz och Leibler8 och Gardner et al.9 var de första att demonstrera det framgångsrika införandet av syntetiska genetiska nätverk i cellulära värdar. Under det följande decenniet har många forskare fortsatt att bygga vidare på dessa inledande framgångar trots uppkomsten av flera begränsningar när det gäller införandet av syntetiska kretsar i celler7,10,11 ,12. Helst bör införandet av syntetiska kretsar i cellulära värdar ske på ett modulärt sätt. Tyvärr gör komplexiteten i den cellulära miljön detta särskilt utmanande, med funktionen av många delar och nätverk är mycket kontextberoende12,13,14. Som ett resultat av nätverk upplever ofta oönskade interaktioner med infödda värd komponenter som kan påverka funktionen av den syntetiska kretsen. På samma sätt kan komponenterna i det exogena nätverket hämma värdprocesser, konkurrera om delade resurser inom värden och påverka tillväxtkinetik15,16,17. Följaktligen, för att rationellt utforma och förutsäga beteendet hos syntetiska nätverk i en in vivo miljö, krävs en omfattande modell av alla värd och krets-specifik dynamik18.
Ett lönsamt alternativ till användning av cellulära värdar för karakterisering av syntetiska nätverk är tillämpningen av in vitro-transkription och översättning (IVTT) teknik. Fungerar som en testbädd för syntetiska nätverk, reaktioner utförs i lösningar som omfattar alla de komponenter som krävs för att möjliggöra genuttryck19,20,21. På detta sätt skapas en biologiskt relevant, om än konstlad, miljö inom vilken syntetiska nät kan testas22,23,24,25,26, 27,28. En stor fördel med att använda IVTT Solutions är förmågan att utföra reaktioner under användarspecificerade förhållanden, med forskare som kan finjustera den exakta sammansättningen av varje reaktion2. Dessutom möjliggör den cell fria metoden testning av syntetiska nätverk med högt dataflöde, eftersom den eliminerar behovet av att utföra tidskrävande cellulära klonings steg. Som ett resultat, varaktigheten av successiva konstruktion-build-testcykler är signifikant reducerad29,30,31,32. Konstruktions cykeln kan påskyndas ytterligare genom att använda cellfria kloningstekniker som Gibson Assembly för att snabbt konstruera nya nätverk, och genom att bygga nätverk från linjära DNA-mallar som-till skillnad från de plasmider som krävs för in vivo-testning- kan amplifieras via polymeraskedjerereaktioner (PCR)33,34.
Batchreaktioner är den enklaste metoden med vilken IVTT-reaktioner kan utföras, vilket kräver ett enda reaktionskärl vari alla reaktions komponenter kombineras35. Sådana reaktioner är tillräckliga för proteinuttryck och grundläggande krets testning ännu inte visat sig vara otillräckliga när man försöker studera det långsiktiga dynamiska beteendet hos ett nätverk. Under loppet av en sats reaktion, reagenser är antingen utarmat eller genomgå nedbrytning vilket resulterar i en kontinuerlig minskning av transkriptionen och omräkningskurserna. Dessutom, som reaktioner framsteg biprodukter ackumuleras som kan störa-eller helt hämma-en korrekt funktion av nätet. I slutändan, användning av batch reaktorer begränsar dynamiskt beteende som kan observeras, med negativ reglering är särskilt utmanande att genomföra5,36.
Mångsidigheten hos ivtt-system möjliggör flera alternativa metoder genom vilka förlängda ivtt-reaktioner kan utföras, alltifrån kontinuerligt flöde till dropp-baserade metoder samt enklare dialys metoder2,30, 37,38,39,40. Tillämpningen av mikroflödessystem enheter ger användarna ökad kontroll över sina reaktioner samtidigt öka genomströmningen och minimera kostnaderna35,41,42, med varje specifik metod med sin egna fördelar. Användning av kontinuerligt flöde kan lätt optimeras för att öka uttrycks avkastningen men oförmåga att effektivt ta bort specifika reaktionsprodukter gör studiet av dynamiskt beteende icke-trivialt39. Medan anställa dropp baserade mikroflödessystem system möjliggör hög genomströmning screening av nya nätverk, svårigheten att leverera färska reagenser till reaktionen resulterar i droppar som liknar små volymer batchreaktioner43. Dialys baserade reaktorer möjliggöra införandet av färska reagenser samt avlägsnande av vissa reaktionsprodukter men, RNA-molekyler och större proteiner ackumuleras i reaktorn, är för stor för att diffusa genom membranet porer. Dessutom krävs stora mängder reagenser för att upprätthålla dessa reaktioner under längre perioder30,44. I 2013, Maerkl et al. presenterade en multi-Layered mikroflödessystem enhet som utformats speciellt för att genomföra förlängda ivtt reaktioner36,45. Användningen av flerskiktade mikroflödessystem enheter möjliggör direkt kontroll över vätskeflödet, vilket möjliggör omdirigering av flödet samt isolering av vätska i vissa regioner i anordningen46,47. Dessa isolerade regioner kan fungera som självständiga reaktions kammare med nanoliter-skala vari IVTT-reaktioner kan utföras. Under loppet av en enda IVTT-reaktion används periodiska injektioner av färska reagenser i reaktorn för att fylla på IVTT-komponenter och DNA-mallar. Samtidigt är en lika volym av den gamla reaktions lösningen förskjuten, ta bort reaktionsprodukter. På detta sätt bibehålls en miljö utanför jämvikt där de basala transkriberingen och omräkningskurserna kvarstår i steady-state, vilket förlänger livslängden för IVTT-reaktioner och tillåter att rika dynamiska beteenden uppstår. Genom att tillämpa detta tillvägagångssätt, forskare har möjlighet att undersöka den kinetiska frekvenser av de enskilda processer som förekommer inom en viss krets, medhjälp i framåt-Engineering av nya genetiska nätverk. Till exempel genomförde Niederholtmeyer et al. denna metod för att karakterisera olika delar av en genetisk ring oscillator, bestämning av kinetiska priser därav36. I ytterligare studier, Yelleswarapu et al. visade att de kinetiska talen av Sigma Factor 28 (σ28) bestäms under sats villkor var otillräckliga för att beskriva beteendet hos en σ28-baserad oscillator, och att tillägg av flödesbaserade data förbättrade modell förutsägelser för nätverksbeteendet22.
Målet med detta manuskript är att presentera ett komplett protokoll för tillverkning av Multilayer mikroflödessystem enheter som kan utföra långsiktiga ivtt reaktioner. Dessutom kommer detta manuskript beskriva all hårdvara och mjukvara som krävs för att utföra förlängda IVTT reaktioner. Aktivering av den mikrofluidiska anordningen-nödvändig för att kontrollera flödet av vätskor däri-uppnås med hjälp av en serie av pneumatiska ventiler som ansluts direkt till mikroflödessystem enheter via längder av slangar. De pneumatiska ventilerna styrs i sin tur via ett specialbyggt virtuellt styrgränssnitt. Vätskeflödet inom de mikrofluidiska anordningarna uppnås med hjälp av kontinuerligt tryck som tillhandahålls av ett kommersiellt tillgängligt tryckreglering system. IVTT-reaktioner utförs vanligtvis mellan 29 ° c och 37 ° c och ett Mikroskop inkubator används för att reglera temperaturen under reaktioner. Men funktionaliteten hos IVTT-blandningen försämras gradvis vid förvaring över 4 ° c. Som sådan kommer detta manuskript expandera på off-chip kylsystem som används för att kyla ivtt blandningen före injektion i den mikroflödessystem enheten. Sammanfattningsvis ger detta manuskript en omfattande översikt av de förfaranden som krävs för att framgångsrikt utföra förlängda ivtt reaktioner med hjälp av en mikroflödessystem flödes reaktor så att andra forskare kommer att kunna replikera denna teknik med relativ Lätthet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

Begränsningarna i cellbaserad syntetisk biologi blir allt tydligare eftersom forskarna strävar efter att utveckla större och mer komplexa syntetiska genetiska reglerings kretsar. Analysen av syntetiska genetiska reglerings nätverk in vivo är tidskrävande och lider av brist på miljökontroll, med exogena syntetiska komponenter interagerar med värdprocesser vilket resulterar i oönskat beteende. För att övervinna dessa frågor, cell-fri karakterisering av nya kretsar blir allt vanligare. In vitro-transkription och översättning (IVTT) blandningar möjliggör reglering av försöks miljön och kan optimeras för varje unikt system. De protokoll som presenteras här detalj tillverkning av en Multilayer mikroflödessystem enhet som kan utnyttjas för att upprätthålla ivtt reaktioner för långvarig varaktighet. Till skillnad från satsvis reaktioner, där resurserna är uttömda över tid och (av-) produkter ackumuleras, användning av mikroflödessystem enheter möjliggör påfyllning av resurser samt avlägsnande av reaktionsprodukter. På detta sätt emuleras den cellulära miljön genom att bibehålla en miljö utanför jämvikts miljön där det dynamiska beteendet hos gen kretsar kan undersökas under längre tidsperioder. För att fullt ut utnyttja Multilayer mikroflödessystem enheten, hårdvara och mjukvara har integrerats för att automatisera ivtt reaktionerna. Genom att kombinera ivtt reaktioner med den mikroflödessystem plattform som presenteras här, blir det möjligt att heltäckande analysera komplexa nätverk beteenden, främja vår förståelse av de mekanismer som reglerar cellulära processer.

Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Tillverkningsprocessen av en PDMS-baserad, Multilayer, mikroflödessystem enhet som möjliggör in vitro-transkription och översättning (ivtt) reaktioner som skall utföras under längre perioder beskrivs. Dessutom tillhandahålls en omfattande översikt över den maskinvara och programvara som krävs för att automatisera och underhålla dessa reaktioner för långvariga varaktigheter.

En Multilayer Microfluidic plattform för ledning av långvarig cell-fri genuttryck

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Prototyping syntetiska gennätverk förbättras avsevärt genom användning av cellfria genuttryck system. Vårt protokoll beskriver tillverkningsprocessen för multilayer microfluidic flöde reaktor och visar att en sådan anordning kan användas för långvarig cell-fritt uttryck av GFP. Cellfria proteinuttryck i kombination med mikrofluidiska flödesreaktorer ger rapid prototyping-plattformen för konstruktion av syntetiska biologiska anordningar.Hela denna setup är mycket mångsidig och kan anpassas för ledning av alla biokemiska eller kemiska reaktioner som kräver höga nivåer av kontroll. Att säkerställa stabiliteten i den cellfria reaktionslösningen är kritiskt och svårt att uppnå. Var noga med att fokusera på att ge tillräcklig kylning och utnyttja slangen som anges i detta protokoll.För att fabricera och förbereda den experimentella plattformen krävs anslutningen av ett flertal enskilda komponenter, en process som kan vara svår att följa utan visuella hjälpmedel. Till att börja med följer du med i det medföljande textprotokollet för att fabricera den mikrofluidiska enheten och för att ställa in den pneumatiska regleringen av regleringen av regler och flödestryck som kommer att användas för styrning av de ventiler som är kritiska för denna enhet. För att ställa in off-chip kylning, börja med att spole en längd av PTFE slangar på den kalla ansikte en Peltier element och säkra spolen med tejp.Se till att den ena änden av PTFE-slangen är ansluten till reservoarer av flödesskiktets tryckregleringssystem och att den andra änden sticker ut högst en centimeter från Peltierytan. Nästa sätt in en fem till 10 centimeter längd AV PEEK slangar i den utskjutande änden av PTFE slangar. Applicera en tillräcklig mängd termisk förening på Peltier-elementets heta ansikte och placera den på vattenblockets kalla platta.Se till att slangen, Peltier element, och kylblock är i direkt kontakt med varandra hela tiden. Nästa ansluta Peltier elementet till temperaturregulatorn med hjälp av en seriell buss kontakt så att spänningen levereras till Peltier kan regleras. Sedan, säkert placera en termistor på Peltier ytan och anslut sin utgång till temperaturregulatorn.Efter att ha vridit på vattenkylaren, anpassa spänningen som tillförs till Peltier tills temperaturen är stabil vid fyra grader Celsius. För varje kontrollkanal av den mikrofluidiska enheten skär en längd av standard slangar som är en meter lång. I ena änden, sätt stiftet på en 23 gauge, en halv tum Luer stub och i den andra änden infoga en rostfri anslutningstapp.Anslut Luer stub till en manlig Luer 3/32 tum taggad nylon kontakt och sätt in hullingen av kontakten i en längd av polyuretan slangar. Sätt sedan in denna polyuretan slang direkt i en av magnetventilerna. Nästa bifoga en 23 gauge halv tum Luer stub till en spruta och sätt in detta i en tre till fyra centimeter lång bit av standard slangar.Placera den öppna änden av detta rör i en reservoar av ultra rent vatten och fyll sprutan med ultra rent vatten. Numrera varje kontrollkanal av den mikrofluidiska enheten som visas här. För kanalerna fyra till 29, hitta motsvarande slangar och sätt in metalltappen i den öppna änden av slangarna som är fäst vid sprutan.Spruta sedan in vatten i kontrollkanalens slang tills halva längden har fyllts. Därefter kopplar du bort slangen från sprutan och för in anslutningsstiftet i rostfritt stål i motsvarande hål på den mikrofluidiska enheten. Upprepa det här steget för alla kontrollkanalerna.Nu, använd kontrollgränssnittet för att öppna alla magnetventiler. Detta kommer att pressa vätskan inom kontrollkanalen slangar tvinga den till mikrofluidic enheten och stänga alla membran-baserade ventiler inom enheten. För var och en av de okylda reagenserna skär en meters längd av standardslangar för att ansluta reservoarens utlopp till de mikrofluidiska apparatinloppen.Ta ena änden av slangen och sätt in detta i reservoaren se till att slangen når basen av reservoaren. Reservoarens slangutlopp bör dras åt så att en lufttät tätning uppnås. Sätt sedan in en rostfri anslutningstapp i den öppna änden av slangen.Därefter fäster du en 23 gauge halv tum Luer stub i slutet av en milliliter spruta. Lägg till en kort längd av standardrör till Luer stub. Placera änden av slangen i önskad reagenslösning och fyll sprutan med reagensen.För sedan in den rostfria kontaktstiftet i polyuretanslangen som är kopplad till sprutan och fyll slangen med reagensen. Vid användning av små reaktionsvolymer kommer reagensen inte in i reservoaren och slangen i sig kommer att fungera som reservoaren. När du är klar, koppla bort sprutan och sätt in kontaktstiftet i ett av flödesskiktet inloppshål av mikrofluidiska enheten.Applicera sedan tryck på var och en av reservoarerna med hjälp av tryckregulatorns programvara för att tvinga in reagenserna i den mikrofluidiska enheten. Se till att vattenkylaren och Peltier element har påslagen med yttemperaturen på Peltier inställd på fyra grader Celsius. Montera kylinställningen så nära den mikrofluidiska enheten som möjligt för att minimera den okylda volymen mellan Peltier och enhetens inlopp.Anslut sedan en en milliliter spruta till en 23 gauge halv tum Luer stub med en kort längd av standard slangar fäst vid slutet. Dra in den för att vara kyld reagens för att fylla sprutan. Anslut därefter PEEK-slangen till sprutan via bindslangen och applicera konstant tryck på sprutan som tvingar reagensen genom PEEK-slangen och in i PTFE-slangen.Koppla slutligen bort PEEK-slangen från sprutan och för in den direkt i av flödeskanalens inlopp av den mikrofluidiska enheten. När tryck appliceras kommer det kylda reagenset att tvingas in i den mikrofluidiska enheten. Se till att den mikrofluidiska enheten sitter säkert på mikroskopet scenen med alla kontroll och flödesskikt slangar bifogas och stänga eventuella öppningar på inkubatorn.Nästa ställa in omgivningstemperaturen i inkubatorn till 29 grader Celsius. Försäkra sedan att kylsystemet har satts på och är inställt på fyra grader Celsius innan experimentet inleds. Kontrollera att de tryck som tillämpas på flödeskanaltrycksregulatorn är inställda på 800 millibar och med hjälp av programvaran, ställ in utmatningstrycket för varje enskild flödeskanal till mellan 20 och 100 millibar.Kontrollera att tryck som appliceras på magnetventilerna för styrkanalen är en stapel för kanalerna ett till åtta och tre bar för kanalerna nio till 29. Därefter stänger du enhetens utlopp genom att trycksättning kanal 29 och samtidigt trycks ned styrkanalerna ett till och med tre och 15 till och med 28. Tryck sedan selektivt ned multiplexerns styrkanaler för att låta ett enda valt reagens flöda in i enheten.Använd mikroskopet för att övervaka avlägsnandet av luft och se därefter till att alla reagenser flyter korrekt utan att luftbubblor införs. Med hjälp av det tillhandahållna programvarupaketet ställer du in datafälten som rör kalibreringsprocessen enligt beskrivningen i det medföljande textprotokollet. Därefter bestämma fluidvolymen förskjutna från varje reaktor under ett enda inflöde steg genom att verkställa kalibreringsprotokollet.Följ med stegen som presenteras av kontrollprogramvaran för att slutföra analysen av kalibreringsexperimentet och för att bestämma uppdateringsförhållandet för varje ringreaktor i den mikrofluidiska enheten. Slutligen anger du de värden som krävs för önskat experiment inom gränssnittet för virtuell kontroll. Initiera det experimentella protokollet genom att trycka på knappen utföra experiment i kontrollgränssnittet.Under ett kalibreringsexperiment fylls reaktorerna med en fluorofore vars intensitet registreras efter varje utspädning. Minskningen av fluorescensintensiteten per utspädning avslöjar volymen på reaktorringen som förskjuts för det inställda antalet inflödessteg. Denna volym benämns uppdateringsförhållandet.Genomsnittligt uppdateringsförhållande och standardavvikelse visas för varje utspädningssteg i rött. Sju av de åtta reaktorerna visar mycket liknande uppförande, however en reaktor visar fluktuationer, efter den sjunde utspädningen cyklar. Detta belyser behovet av unika uppdateringsförhållanden för var och en av reaktorerna.Den långvariga in vitro-avskrift och översättning reaktion som visas här hade 30%av reaktorvolymen förskjutna var 14,6 minuter. Två reaktorer av den mikrofluidiska enheten där de används som ämnen. Alla andra reaktorer omfattade 75%in vitro-transkription och översättningsreaktionslösning och 25%av antingen ultra rent vatten eller 2,5 nanomolar linjära DNA mallar kodning för uttryck av deGFP protein.I alla fyra reaktorer där DNA lades till fanns det tydliga deGFP-uttryck. En reaktor visar en lägre fluorescenssignal. Detta kan orsakas av skillnader i flöde som resulterar i mindre DNA in i reaktorn eller på grund av variationer i reaktorn dimensioner.Efter 14 timmar ses en plötslig ökning i signalen av de reaktorer som innehåller DNA. Detta orsakas av en luftbubbla som kommer in i flödesskiktet för den mikrofluidiska enheten. Vid återupptagande av flödet återgår experimentet till sin tidigare fluorescensintensitet.Cellfria reaktionslösningar utsätts för nedbrytning över tiden om de inte kyls ned tillräckligt, gör den kylprocess som beskrivs i detta protokoll av avgörande betydelse. På grund av plattformens mångsidighet kan en mängd biokemiska och kemiska reaktioner genomföras på ett exakt och kontrollerat sätt. Tillämpningen av mikrofluidiska flödesreaktorer har påskyndat successiva konstruktionsbygge testcykler för prototyper dubbel genetiska kretsar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Hög genomströmning Protein Expression Generator Med en mikroflödessystem plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell Klämma som en robust, mikroflödes Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Mikroflödes Plattform för Mätning Neutrophil Chemotaxis från Cement helblod

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-orgeln Chip - En mikroflödes Plattform för Långsiktig Flervävnads Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Multi-steg varierande höjd Fotolitografi för Ventilförsedda Multilayer Mikrofluidikanordningar

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikroflödes Plattform med Multiplex elektronisk detektering för rumslig Spårning av partiklar

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Performance-testing Platform for a Conduction Micropump with an FR-4 Copper-clad Electrode Plate

En individprövning plattform för en överledning Micropump med en FR-4 koppar-klädda elektrod platta

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging rotahåret morfologi av Arabidopsis plantor i en två-lagers mikroflödessystem plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

En mikroflödessystem plattform för längsgående Imaging i Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cellfria Protein uttryck med den snabbt växande bakterien Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...