Name: a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression
Uploaded: 2019-10-06T12:30:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

Bu çalışma, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nün (NWO, 723.016.003) NWO-VIDI hibesi olan Avrupa Araştırma Konseyi ERC (proje n. 677313 BioCircuit) tarafından desteklenmiştir. programları, 024.001.035 & 024.003.013), İnsan Sınır Bilim Programı Hibe RGP0032/2015, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı Grant 723106 altında Avrupa Araştırma Konseyi ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Hibe 200021_182019.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

PDMS tabanlı çok katmanlı mikroakışkan bir cihaz sunulmuştur ve IVTT reaksiyonlarını uzun süre devam ettirme yeteneği gösterilmiştir. Bu özel örnek için uygun olsa da, bu teknoloji birçok diğer uygulamalar için kullanılabilir. Sıvı akışı üzerindeki ek kontrol - ürünleri çıkarırken reaksiyon reaktiflerini sürekli olarak yenileme yeteneği ile eşleştirilmiştir - sürekli sentez reaksiyonları, çeşitli dinamik davranışların araştırılması ve eşzamanlı tek bir reaksiyonun birden fazla varyasyonunun iletimi.
PDMS tabanlı cihazların nispeten basit üretim sürecine rağmen, bunların kullanımı kapsamlı bir donanım kurulumu gerektirir. Vana dizileri, basınç regülatörleri, basınç pompaları, kuluçka makineleri ve soğutma ünitelerinden oluşan üretimden kullanıma geçiş temel değildir ve önemli bir ilk yatırım gerektirir. Buna ek olarak, bu aygıtlarla sürekli olarak kurulum ve başarılı denemeler yapabilme yeteneği önemli bir zaman yatırımı gerektirir; bu makalenin ele almayı hedeflediği bir nokta. Ancak, bir kez yerine, tüm kurulum çeşitli amaçlar için değiştirilebilir. Ayrıca, donanım kurulumu çok sayıda modüler elemandan oluşur ve bunların her biri daha karmaşık mikroakışkan cihaz tasarımlarının kullanılabilir hale getirilebilmesi için genişletilebilir. Ayrıca, modüler tasarım benzer işleyen alternatifler tarafından donanım bileşenlerinin değiştirilmesine olanak sağlar, kullanıcıların burada açıklanan belirli kurulum ile sınırlı değildir gibi48,49.
Tek tek aygıtlar arasında ve dış koşullardaki değişkenlik (basınç dalgalanmaları gibi) bu aygıtları kullanırken denemeler yaparken yanlışlıklara neden olabilir. Bu sorunu gidermek için, her denemeden önce sistemin kalibrasyonu yapılmalı dır ve bu da reaktörlerin her biri için benzersiz bir Yenileme Oranı sağlamaktadır. Kalibrasyon cihazdan cihaza ve deneyden deneye varyasyonları ele alırken, bu zaman alıcı bir süreçtir ve kusursuz değildir. Farklı viskozitelere sahip sıvılar aynı basınca maruz kaldığında aynı oranda akmaz ve bu nedenle birden fazla reaktifle kalibrasyon un gerçekleştirilmesi aynı Yenileme Oranlarınıvermeyebilir. Bu etki, reaktifleri peristolarak mikroakışkan cihaza pompalamak için üç kontrol kanalı kullanılarak zayıflatılır, ancak verilen basıncı değiştirerek akışı düzenlemenin aksine. Viskozitede eşitsizliğinin çok büyük olduğu durumlarda son çare olarak, birden fazla kalibrasyon deneyi gerçekleştirerek her bir reaktif için benzersiz bir Yenileme Oranı uygulanabilir.
Mikroakışkan cihaza reaktifler enjekte etmek için peristaltik bir pompa kullanımı, farklı viskozitelere sahip çözümler kullanmanın etkilerini zayıflatır, ancak aynı zamanda ikincil bir sorun oluşturur. Mikroakışkan cihaza sıvı pompalamak için ayrı adımlar kullanılması, enjeksiyonların tek bir reaktöre çözündeğin, tek bir pompa çevrimi gerçekleştirirken enjekte edilen hacimle sınırlı olduğu anlamına gelir. Araştırmamızda kalibrasyon sırasında belirlenen bu değer yaklaşık %1'e eşittir ve bu da tek bir pompa döngüsünün reaktör hacminin yaklaşık %1'ini (yaklaşık 0,1 nL) yerinden ettiğini gösterir. Bu nedenle, reaktör hacminin %30'unun yerinden edilmesi için 30 pompa çevriminin uygulanması gerekirken, IVTT reaksiyon çözeltisinin 23 pompa döngüsü ekleniyor ve sadece 7 pompa çevrimi DNA veya ultra saf su ekleniyor. Araştırmamız için yeterli olsa da, alternatif deneysel protokoller daha fazla sayıda benzersiz reaktif eklemeye çalışırken, daha düşük bir Yenileme Fraksiyonukullanmaya veya bir reaktöre tek bir reaktifin daha küçük hacimlerini eklemeye çalışırken sorunlarla karşılaşabilir. Bu gibi durumlarda, mikroakışkan cihaz tasarımı reaktörlere daha büyük hacim sağlamak için uyarlanabilir. Böyle bir örnek Niederholtmeyer ve ark36bildirilir.
En önemlisi, bu makalenin içinde özetlenen cihaz, tepkilerin uzun süre ler boyunca sürdürülmesini ve sabit durum transkripsiyon ve çeviri oranlarıyla sonuçlanmasına olanak tanır. Reaktörlere periyodik olarak yeni reaktifler enjekte edilerek - ve reaksiyonu (by) ürünleri kaldırarak - reaksiyonlar sürdürülür ve karmaşık dinamik davranışlar izlenebilir. Bu şekilde, bir platform oluşturuldu - bir dereceye kadar - hücresel ortamı taklit eder. Ayrıca, bu platform enjeksiyonlar arasındaki dönemi ve enjeksiyonların özel bileşimini uyarlayarak sistem dinamiğinin araştırılmasını sağlar. Sonuç olarak, bu çok katmanlı mikroakışkan cihazlar, karmaşık dinamik davranışlar sergileyen yeni sentetik ağların karakterizasyonu ve optimizasyonu için güçlü bir araçtır.

Hücreler karmaşık dinamik düzenleyici ağlar1,2kullanarak kendi ortamlarını algılamak ve yanıt edebiliyoruz. Sentetik biyoloji alanında hücrelerin işlevselliğini genişletebilir biyolojik sistemler tasarlamak için bu ağları oluşturan doğal olarak oluşan bileşenlerin bilgimizi kullanır3,4. Buna karşılık, mevcut devrelerin basitleştirilmiş, sentetik analoglarını veya doğal olarak meydana gelen davranışlar sergileyen ileri mühendislik biyolojik sistemleri tasarlayarak yaşamı yöneten doğal ağları daha iyi anlamamızı da mümkündür. Bu tür biyolojik sistemlerin de novo mühendislik yeni genetik devreler veya sinyal yolları rasyonel bir şekilde, iyi tanımlanmış parçalar5,6kullanılarak tasarlanmış bir aşağıdan yukarıya bir şekilde gerçekleştirilir. Ağların rasyonel tasarımının biyolojik olarak ilgili sistemlerin tasarımı ile birleştirilmesi, biyolojik düzenleyici sistemlerin derinlemesine karakterizasyonuve incelenmesini çeşitli soyutlama düzeyleriyle mümkün kılar7.
Elowitz ve Leibler8 ve Gardner ve ark.9'un öncü çalışmaları sentetik genetik ağların hücresel konaklara başarılı bir şekilde girişini gösteren ilk çalışmalardır. Takip eden on yıl içinde, çok sayıda araştırmacı hücrelere sentetik devrelerin giriş ile ilgili çeşitli sınırlamalar ortaya çıkmasına rağmen bu ilk başarıları üzerine inşa etmeye devam etmiş7,10,11 ,12. İdeal olarak, hücresel konaklar içine sentetik devrelerin giriş modüler bir şekilde meydana gelmelidir. Ne yazık ki, hücresel ortamın karmaşıklığı bu özellikle zor hale getirir, birçok parça ve ağların fonksiyonu ile son derece bağlam bağımlı12,13,14. Sonuç olarak, ağlar genellikle sentetik devrenin işlevini etkileyebilecek yerli ana bilgisayar bileşeni ile istenmeyen etkileşimler yaşarlar. Benzer şekilde, eksojen ağın bileşenleri ev sahibi süreçleri inhibe edebilir, ana bilgisayar içinde paylaşılan kaynaklar için rekabet, ve büyüme kinetik etkisi15,16,17. Sonuç olarak, sentetik ağların in vivo bir ortamda ki davranışını rasyonel bir şekilde tasarlamak ve tahmin etmek için, tüm ana bilgisayar ve devreye özgü dinamiklerin kapsamlı bir modeli18gereklidir.
Sentetik ağların karakterizasyonu için hücresel ana bilgisayarların kullanımına uygun bir alternatif in vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) teknolojilerinin uygulanmasıdır. Sentetik ağlar için bir test yatağı olarak hareket eden reaksiyonlar, gen ekspresyonunu sağlamak için gerekli tüm bileşenleri içeren çözeltilerde gerçekleştirilir19,20,21. Bu şekilde, bir biyolojik ilgili, yapay da olsa, çevre içinde sentetik ağlar test edilebilir oluşturulur22,23,24,25,26, 27,28. IVTT çözümleri kullanmanın en büyük avantajı, araştırmacıların her reaksiyonun kesin bileşimini ayarlayabilmeleri ile kullanıcı tarafından belirtilen koşullar altında reaksiyon lar gerçekleştirebilme yeteneğidir2. Ayrıca, hücre içermeyen yaklaşım sentetik ağların yüksek iş yapma yoluyla test edilmesini sağlar, çünkü zaman alan hücresel klonlama adımlarını gerçekleştirme ihtiyacını ortadan kaldırır. Sonuç olarak, ardışık tasarım süresi - inşa - test döngüleri önemli ölçüdeazalır 29,30,31,32. Tasarım döngüsü, Gibson montajı gibi hücresiz klonlama tekniklerini kullanarak yeni ağları hızla geliştirerek ve in vivo test için gerekli plazmidlerin aksine doğrusal DNA şablonlarından ağlar oluşturarak daha da hızlandırılabilir. polimeraz zincir reaksiyonları (PCR)33,34ile güçlendirilebilir.
Toplu reaksiyonlar, tüm reaksiyon bileşenlerinin birleştiği tek bir reaksiyon kabı gerektiren, IVTT reaksiyonlarının yapılabildiği en basit yöntemdir35. Bu tür reaksiyonlar protein ekspresyonu için yeterlidir ve temel devre testi bir ağın uzun vadeli dinamik davranışını incelemeye çalışırken yetersiz kalır. Toplu işlem boyunca reaktifler ya tükenir ya da transkripsiyon ve çeviri oranlarında sürekli bir düşüşe neden olur. Ayrıca, reaksiyonlar ilerledikçe yan ürünler, ağın doğru işleyişini engelleyebilecek veya tamamen engelleyebilecek biriktikçe. Sonuçta, toplu reaktörlerin kullanımı gözlemlenebilir dinamik davranışı sınırlar, negatif düzenleme özellikleuygulamakiçin zor olan 5,36.
IVTT sistemlerinin çok yönlülüğü, sürekli akıştan damlacık bazlı yöntemlere ve daha basit diyaliz yaklaşımlarına kadar uzun süreli IVTT reaksiyonlarının uygulanabileceği birden fazla alternatif yöntem e-sataşabilir. 37,38,39,40. Mikroakışkan cihazların uygulanması, kullanıcılara reaksiyonları üzerinde daha fazla kontrol sağlarken, iş bürünme ve maliyetleri en aza indirme35,41,42, her bir yaklaşım la kendi avantajları. Sürekli akış kullanımı kolayca ifade verimleri artırmak için optimize edilebilir ancak, etkili belirli reaksiyon ürünleri kaldırmak için yetersizlik dinamik davranış önemsiz olmayan çalışma yapar39. Damlacık tabanlı mikroakışkan sistemler istihdam ederken yeni ağların yüksek işlem tarama sağlarken, küçük hacimli toplu reaksiyonlar benzeyen damlacıklar reaksiyon sonuçları taze reaktifler tedarik zorluk43. Diyaliz bazlı reaktörler taze reaktiflerin piyasaya sürülmesinin yanı sıra bazı reaksiyon ürünlerinin çıkarılmasına izin verir, Ancak, RNA molekülleri ve daha büyük proteinler reaktör içinde birikir, membran gözenekleri ile yaymak için çok büyük olmak. Ayrıca, reaktifler büyük hacimli uzun süre ler için bu reaksiyonları sürdürmek için gereklidir30,44. 2013 yılında, Maerkl ve ark. uzun süreli IVTT reaksiyonları36,45yürütmek için özel olarak tasarlanmış çok katmanlı bir mikroakışkan cihaz sundu. Çok katmanlı mikroakışkan cihazların kullanımı sıvı akışı üzerinde doğrudan kontrol sağlar, akış yeniden yönlendirilmesi yanı sıra cihazın belirli bölgelerinde sıvı izolasyonu için izin46,47. Bu izole bölgeler, IVTT reaksiyonları yapIlebilen bağımsız nanolitre ölçekli reaksiyon odaları olarak işlev görebilir. Tek bir IVTT reaksiyonu boyunca, reaktöre taze reaktiflerin periyodik enjeksiyonları IVTT bileşenlerini ve DNA şablonlarını doldurmak için kullanılır. Aynı anda, eski reaksiyon çözeltisinin eşit hacimli, reaksiyon ürünleri kaldırarak yerinden edilir. Bu şekilde, bazal transkripsiyon ve çeviri oranlarının sabit durumda kaldığı, IVTT reaksiyonlarının ömrünü uzatarak ve zengin dinamik davranışların oluşmasına izin veren bir denge dışı ortam korunur. Araştırmacılar bu yaklaşımı uygulayarak, yeni genetik ağların ileriye mühendislik yardımcı, belirli bir devre içinde meydana gelen bireysel süreçlerin kinetik oranlarını araştırmak mümkün. Örneğin, Niederholtmeyer ve ark. bir genetik halka osilatör çeşitli unsurları karakterize etmek için bu yaklaşımı uyguladı, bunların kinetik oranlarını belirleyen36. Daha ileri çalışmalarda Yelleswarapu ve ark. toplu koşullar altında belirlenen sigma faktörü 28 'in kinetik oranlarının (σ28)σ28tabanlı osilatörün davranışını tanımlamak için yetersiz olduğunu ve akış tabanlı verilerin eklenmesinin ağ davranışı geliştirilmiş model tahminleri22.
Bu makalenin amacı, uzun süreli IVTT reaksiyonları gerçekleştirebilen çok katmanlı mikroakışkan cihazların imalatı için tam bir protokol sunmaktır. Buna ek olarak, bu el yazması uzun süreli IVTT reaksiyonları gerçekleştirmek için gerekli tüm donanım ve yazılım açıklanacaktır. Mikroakışkan cihazın harekete alınması - orada sıvıların akışını kontrol etmek için gerekli - tüp uzunlukları ile mikroakışkan cihazlara doğrudan bağlanmak pnömatik vanalar bir dizi kullanılarak elde edilir. Buna karşılık, pnömatik vanalar özel olarak üretilmiştir sanal kontrol arayüzü üzerinden kontrol edilir. Mikroakışkan cihazların içindeki sıvı akışı, ticari olarak kullanılabilen basınç düzenleme sistemi tarafından sağlanan sürekli basınç kullanılarak elde edilir. IVTT reaksiyonları genellikle 29 °C ile 37 °C arasında gerçekleştirilir ve reaksiyonlar sırasında sıcaklığı düzenlemek için bir mikroskop kuluçka makinesi kullanılır. Ancak IVTT karışımının işlevselliği 4 °C'nin üzerinde depolandığında yavaş yavaş bozulur. Bu nedenle, bu el yazması mikroakışkan cihaziçine enjeksiyondan önce IVTT karışımı soğutmak için kullanılan off-chip soğutma sistemi genişletecektir. Sonuç olarak, bu el yazması, diğer araştırmacıların bu teknolojiyi göreceli olarak kopyalayabilmeleri için mikroakışkan akış reaktörü kullanarak uzun süreli IVTT reaksiyonlarını başarıyla gerçekleştirmek için gereken prosedürlerin kapsamlı bir özetini sunmaktadır. Kolay -lığı.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20063.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 40 XT</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 726 MIF Developer</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Positive Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>109634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>ECN 631-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mr Dev 600</td>
			<td>Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Free Heat Sink Grease</td>
			<td>Circuit Works</td>
			<td>CW7270</td>
			<td>Thermal Compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Silicon Materials</td>
			<td>-</td>
			<td>&#60;1-0-0&#62; orientation, 100 mm diameter, 525 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Microchem Corp. (Newton, MA)</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>01317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 channel digital input/output module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-504</td>
			<td>8x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compression fitting</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>FIT-V06X10</td>
			<td>Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller end module</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connecting tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td>AAD04103</td>
			<td>0.02&#34; ID, 0.06&#34; OD, Tygon Tubing (ND-100-80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Device connector pins</td>
			<td>Unimed SA (Lausanne, Switserland)</td>
			<td>200.010-A</td>
			<td>AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethernet Controller</td>
			<td>WAGO Kontakttechnik GmbH</td>
			<td>750-881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female bus connector</td>
			<td>Encitech</td>
			<td>DTCK15-DBS-K</td>
			<td>15 pole female bus connector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid reservoirs</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>Fluiwell-4C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluigent pressure system</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-EZ</td>
			<td>0 - 345 mbar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hg short arc lamp</td>
			<td>Advanced Radiation Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td>HP61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid coolant</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>LIQ-705CL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stubs</td>
			<td>Instech Laboratories, Inc.</td>
			<td>LS23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to barb connectors</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45505-32</td>
			<td>3/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Software</td>
			<td>de Greef Lab, Eindhoven University of Technology</td>
			<td colspan="2">https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcamera</td>
			<td>The Imaging Source</td>
			<td>DMK 42AUC03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-513000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus T6P 50045757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma asher</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>K1050X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS puncher</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>Accu-Pucnh MP10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>1301005001-5F</td>
			<td>0.005&#34; ID, 1/32&#34; OD, Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier element</td>
			<td>European Thermodynamics</td>
			<td>APH-127-10-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services, Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask Design</td>
			<td>Maerkl Lab, EPFL</td>
			<td>https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic valve array</td>
			<td>FESTO</td>
			<td>-</td>
			<td>1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power adapter</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>ADT-EX004S</td>
			<td>110/220V AC Power Adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06417-21</td>
			<td>#24 AWG Thin Wall PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punching pin</td>
			<td>SYNEO</td>
			<td>CR0320245N21R4</td>
			<td>OD: 0.032&#34; (0.8128 mm), ID: 0.024&#34; (0.6090 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Tubing</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>HOS-06CL</td>
			<td>6 mm ID, 10 mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge blades</td>
			<td>GEM Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tubing</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>-</td>
			<td>Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor cable</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TA-29</td>
			<td>Cable with bead thermistor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV exposure system</td>
			<td>ABM, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>Near UV Exposure System, 350W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Vacuumbrand GmbH</td>
			<td>MD1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooled cold plate block</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>PLT-UN40F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water cooler</td>
			<td>Koolance, Inc.</td>
			<td>EX2-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>M-prove</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression

Araştırmacılar daha büyük ve daha karmaşık sentetik genetik düzenleyici devreler geliştirmeyi amaçladÄ±kça hücre temelli sentetik biyolojinin sÄ±nÄ±rlamalarÄ± giderek daha belirgin hale geliyor. In vivo sentetik genetik düzenleyici ağların analizi zaman alıcı dır ve çevresel kontrol eksikliğinden muzdariptir, eksojen sentetik bileşenler ev sahibi süreçleri ile etkileşime girerek istenmeyen davranışlara yol açar. Bu sorunların üstesinden gelmek için, yeni devrelerin hücresiz karakterizasyonu daha yaygın hale gelmektedir. In vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) karışımları deneysel ortamın düzenlenmesine olanak sağlar ve her benzersiz sistem için optimize edilebilir. Burada sunulan protokoller, uzun süre ler için IVTT reaksiyonlarını sürdürmek için kullanılabilen çok katmanlı bir mikroakışkan cihazın imalatını ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Kaynakların zaman içinde tükendiği ve (by-) ürünlerin biriktiği toplu reaksiyonların aksine, mikroakışkan cihazların kullanımı kaynakların yenilenmesine ve reaksiyon ürünlerinin çıkarılmasına olanak sağlar. Bu şekilde hücresel ortam, gen devrelerinin dinamik davranışlarının uzun süre araştırılabildiği denge dışı bir ortam korunarak taklit edilir. Çok katmanlı mikroakışkan cihazdan tam olarak yararlanmak için, IVTT reaksiyonlarını otomatikleştirmek için donanım ve yazılım entegre edilmiştir. IVTT reaksiyonlarını burada sunulan mikroakışkan platformla birleştirerek, karmaşık ağ davranışlarını kapsamlı bir şekilde analiz etmek mümkün olur ve hücresel süreçleri düzenleyen mekanizmalar hakkında anlayışımızı ilerletebilirsiniz.

Watch this Scientific Journal Video about A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression at JoVE.com

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

PdMS tabanlı, çok katmanlı, mikroakışkan bir cihazın in vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) reaksiyonlarının uzun süreler boyunca gerçekleştirilmesine olanak sağlayan üretim süreci anlatılmaktadır. Ayrıca, bu reaksiyonları uzun süre ler boyunca otomatikleştirmek ve korumak için gereken donanım ve yazılıma kapsamlı bir genel bakış sağlanır.

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Sentetik gen ağlarının prototiplemesi, hücre içermeyen gen ekspresyon sistemlerinin kullanımı ile büyük ölçüde geliştirilir. Protokolümüz çok katmanlı mikroakışkan akış reaktörü için üretim sürecini açıklar ve böyle bir cihazın GFP'nin uzun süreli hücresiz ifade için kullanılabileceğini göstermektedir. Mikroakışkan akış reaktörleri ile birlikte hücre içermeyen protein ifadeleri sentetik biyolojik cihazların tasarımı için hızlı prototipleme platformu sağlar.Bu tüm kurulum son derece çok yönlüdür ve yüksek düzeyde kontrol gerektiren herhangi bir biyokimyasal veya kimyasal reaksiyonun iletimi için uyarlanabilir. Hücresiz reaksiyon çözeltisinin stabilitesini sağlamak çok önemlidir ve elde edilmesi zordur. Yeterli soğutma sağlamaya odaklanmayı ve bu protokolde belirtilen boruları kullanmayı unutmayın.Deneysel platformun üretilmesi ve hazırlanması, görsel yardımlar olmadan takip edilmesi zor bir süreç olan çok sayıda tek tek bileşenin bağlantısını gerektirir. Başlamak için, mikroakışkan cihazı imal etmek ve bu cihaz için kritik valfleri kontrol etmek için kullanılacak pnömatik kontrol ve akış basıncı regülasyonkurmak için eşlik eden metin protokolü izleyin. Off-chip soğutma kurmak için, bir Peltier elemanın soğuk yüzüne PTFE boru bir uzunluk bobin ile başlamak ve bant ile bobin güvenli.PTFE borunun bir ucunun akış katmanı basınç kontrol sisteminin rezervuarlarına bağlı olduğundan ve diğer ucunun Peltier yüzeyinden en fazla bir santimetre çıkıntı yaptığından emin olun. Bir sonraki ekleme PTFE boru çıkıntılı sonuna PEEK boru beş ila 10 santimetre uzunluğunda. Peltier elementinin sıcak yüzüne yeterli miktarda termal bileşik uygulayın ve su bloğunun soğuk plakasına yerleştirin.Boru, Peltier elemanı ve soğutma bloğunun her zaman birbiriyle doğrudan temas halinde olduğundan emin olun. Daha sonra Peltier elemanını bir seri veri günü konektörü kullanarak sıcaklık kontrol cihazına bağlayın, böylece Peltier'e verilen voltaj düzenlenebilir. Ardından, Peltier yüzeyine güvenli bir şekilde bir termistör yerleştirin ve çıkışını sıcaklık kontrol örüne bağlayın.Su soğutucuyu açtıktan sonra, peltier'e verilen gerilimi sıcaklık dört santigrat derecede sabit olana kadar uyarlayın. Mikroakışkan cihazın her kontrol kanalı için bir metre uzunluğunda standart boru uzunluğu kesti. Bir ucunda, bir 23 göstergesi, yarım inç Luer saplama pin ve diğer ucunda paslanmaz çelik bağlantı pimi takın takın.Luer sapı bir erkek Luer 3/32 inç dikenli naylon konektör bağlayın ve poliüretan boru uzunluğu içine konektör ünbarb takın. Daha sonra bu poliüretan boruyu doğrudan solenoid kapakçıklardan birine takın. Sonraki bir şırınga için 23 gauge yarım inç Luer saplama ekleyin ve standart boru üç ila dört santimetre uzunluğunda parça içine bu takın.Bu borunun açık ucunu ultra saf su deposuna yerleştirin ve şırıngayı ultra saf suyla doldurun. Burada gösterildiği gibi mikroakışkan cihazın her kontrol kanalını numaralandırma. 4'ten 29'a kadar olan kanallar için, ilgili tüpü bulun ve metal pimi şırıngaya bağlı borunun açık ucuna takın.Daha sonra kontrol kanalı borusu içine yarım uzunluğu dolduruldu kadar su enjekte. Ardından, şırıngadan boruyu kesin ve paslanmaz çelik konektör pimini mikroakışkan cihazın ilgili deliğine takın. Tüm denetim kanalları için bu adımı yineleyin.Şimdi, tüm solenoid vanaları açmak için kontrol arabirimini kullanın. Bu, kontrol kanalı tüpündeki sıvıyı mikroakışkan cihaza zorlayarak ve cihaz içindeki tüm membran tabanlı vanaları kapatarak basınçlendirecektir. Soğutulmamış reaktiflerin her biri için mikroakışkan cihaz girişlerine rezervuar çıkışı bağlamak için standart boru bir metre uzunluğunda kesti.Tüpün bir ucunu alın ve bunu rezervuarın tabanına ulaşmasını sağlayarak rezervuara takın. Rezervuar boru çıkışı, hava geçirmez bir sızdırmazlık elde edilebilmek için sıkılmalıdır. Ardından, borunun açık ucuna paslanmaz bir bağlantı pimi takın.Daha sonra, bir mililitreşile şırınga sonuna 23 gauge yarım inç Luer saplama takın. Luer sapı için standart boru kısa bir uzunluk ekleyin. Borunun ucunu istenilen reaktif çözeltisine yerleştirin ve şırıngayı reaktifle doldurun.Daha sonra paslanmaz çelik konektör pimini şırıngaya bağlı poliüretan boruya takın ve boruyu reaktifle doldurun. Küçük reaksiyon hacimleri kullanırken, reaktif rezervuara girmez ve borunun kendisi rezervuar görevi göremez. Bittiğinde, şırıngayı kesin ve konektör pimini mikroakışkan cihazın akış katmanı giriş deliklerinden birine takın.Daha sonra reaktifleri mikroakışkan cihaza zorlamak için basınç düzenleyici yazılımı kullanarak rezervuarların her birine basınç uygulayın. Peltier setinin yüzey sıcaklığı dört dereceye kadar açık olduğundan emin olun. Peltier ve cihaz girişi arasındaki soğutulmamış hacmi en aza indirmek için soğutma kurulumuna mümkün olduğunca mikroakışkan cihaza yakın monte edin.Sonra bir mililitreşşır 23 gauge yarım inç Luer saplama için standart boru kısa bir uzunlukta sonuna bağlı bağlayın. Şırıngayı doldurmak için soğutulmuş reaktifi çekin. Daha sonra PEEK boruyu bağ borusu aracılığıyla şırıngaya bağlayın ve reaktifi PEEK tüpünden PTFE tüpüne zorlayarak şırıngaya sabit basınç uygulayın.Son olarak PEEK tüpünün şırıngadan bağlantısını kesin ve doğrudan mikroakışkan cihazın akış kanalı girişlerine takın. Basınç uygulandığında, soğutulmuş reaktif mikroakışkan cihaza zorlanır. Mikroakışkan cihazın mikroskop aşamasında tüm kontrol ve akış tabakası boruları takılı olduğundan emin olun ve kuvözdeki tüm açıklıkları kapatın.Bir sonraki kuvözdeki ortam sıcaklığını 29 dereceye ayarlayın. Daha sonra soğutma sisteminin açık olduğundan ve denemeyi başlatmadan önce dört dereceye ayarlandığını emin olun. Akış kanalı basınç regülatörüne uygulanan basınçların 800 milibar'a ayarlanıp yazılım kullanılarak ayarlanıp, her bir akış kanalının çıkış basıncını 20 ile 100 milibar arasında ayarlayıp ayarlamadığını kontrol edin.Kontrol kanalı solenoid valflere uygulanan basınçların dokuzdan 29'a kadar kanallar için 1'den sekize kadar ve üç çubuklu kanallar için bir çubuk olup olmadığını kontrol edin. Ardından, kanal 29'a basınç basarak cihazın çıkışını kapatın ve aynı anda kontrol kanallarını 1'den 3'e ve 15'ten 28'e kadar basınçlandırma. Ardından, seçili tek bir reaktifin cihaza akmasına izin vermek için çoklayıcının kontrol kanallarını seçici olarak basınçtan arındırın.Havanın uzaklaştırılmasını izlemek için mikroskobu kullanın ve daha sonra tüm reaktiflerin hava kabarcıkları çıkarmadan doğru şekilde akmasını sağlayın. Sağlanan yazılım paketini kullanarak, eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi kalibrasyon işlemiyle ilgili veri alanlarını ayarlayın. Daha sonra kalibrasyon protokolünü çalıştırarak tek bir giriş adımı nda her reaktörden çıkan sıvı hacmini belirleyin.Kalibrasyon deneyinin analizini tamamlamak ve mikroakışkan cihazdaki her bir halka reaktörünün yenileme oranını belirlemek için kontrol yazılımı tarafından sunulan adımları takip edin. Son olarak, sanal denetim arabirimi içinde istenen deneme için gerekli değerleri ayarlayın. Denetim arabirimindeki deneme yap düğmesine basarak deneysel protokolü başlatın.Bir kalibrasyon deneyi sırasında reaktörler, her seyreltmeden sonra yoğunluğu kaydedilen bir florofor ile doldurulur. Seyreltme başına floresan yoğunluğundaki azalma, belirlenen giriş adımlarında yer değiştiren reaktör halkasının hacmini ortaya çıkarır. Bu birim yenileme oranı olarak adlandırılır.Ortalama yenileme oranı ve standart sapma kırmızı her seyreltme adımı için gösterilir. Sekiz reaktörden yedisi çok benzer davranışlar sergilerken, bir reaktör yedinci seyreltme döngüsünden sonra dalgalanmalar gösteriyor. Bu, her reaktörün benzersiz yenileme oranlarına duyulan ihtiyacı vurgular.Burada gösterilen uzun süreli in vitro transkript ve çeviri reaksiyonu her 14.6 dakikada bir reaktör hacminin %30'una sahipti. Boşluk olarak kullanılan mikroakışkan cihazın iki reaktörü. Diğer tüm reaktörler in vitro transkripsiyon ve çeviri reaksiyon çözeltisi %75'ini ve ultra saf su veya 2,5 nanomolar lineer DNA şablonlarının %25'ini deGFP proteininin ekspresyonuna göre kodlayan lardan oluşuyordu.DNA'nın eklendiği dört reaktörde de GFP ekspresyonu vardı. Bir reaktör daha düşük floresan sinyali gösterir. Bu, akıştaki eşitsizlikten kaynaklanabilir ve bu da reaktöre daha az DNA girmesiyle veya reaktör boyutlarındaki farklılıklara bağlı olarak ortaya çıkabilir.14 saat sonra, DNA içeren reaktörlerin sinyalinde ani bir artış görülür. Bu mikroakışkan cihazın akış tabakası giren bir hava kabarcığı neden olur. Akışın yeniden başlamasıyla, deney önceki floresan yoğunluğuna geri döner.Hücresiz reaksiyon çözümleri yeterince soğutulmadığı sürece zaman içinde bozulmaya maruz kalırlar, kritik öneme sahip bu protokolde açıklanan soğutma işlemini yaparlar. Platformun çok yönlülüğü nedeniyle, biyokimyasal ve kimyasal reaksiyonlar çeşitli hassas ve kontrollü bir şekilde yapılabilir. Mikroakışkan akış reaktörlerinin uygulanması, çift genetik devreprototipleme için art arda tasarım geliştirme test döngülerini hızlandırmıştır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Çok organ Chip - Uzun vadeli Çok doku kokültürü için mikroakışkan Platformu

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Ventilli Katmanlı mikroakışkan Cihazlar için çok adımlı Değişken Yükseklik Fotolitografi

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Parçacıkların Mekansal Takip için Çoklanmış Elektronik Algılama ile mikroakışkan Platformu

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A Performance-testing Platform for a Conduction Micropump with an FR-4 Copper-clad Electrode Plate

Performans Test platformu ve tel Micropump FR-4 bakır kaplı elektrot plaka ile için

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Kök saç Morfoloji Arabidopsis fidan bir iki katlı mikrosıvısal platformda görüntüleme

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Boyuna Imaging'de Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Boş hücre Protein ifade kullanarak hızla büyüyen bakteri Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...