Name: a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction
Uploaded: 2019-08-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المنح البحثية NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, ومنحة بحثية من قبل إدارة الوتّز W81XWH-16-1-0482.

1. جمع وخلايا الليس
<ol><li>تنمو خلايا 293T باستخدام دولبكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) مع 10٪ مصل البقر الجنين، 2 MM الجلوتامين والمضادات الحيوية 1٪. احتضان الثقافات في 37 درجة مئويةتحت 5٪ CO 2. ملاحظة: قد تؤثر حالة نمو الخلايا على استقرار التجارب اللاحقة.</li>
	<li>توسيع الخلايا في الثقافة حتى تصل إ?...

<ol>
	<li>Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome:+Evaluation+of+drug+targets+in+clinical+trials+suggests+major+shifts+in+molecular+class+and+indication.">The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).</li><li>O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics.">Chemical genetics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).</li><li>McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+elucidation+of+protein-small+molecule+interactions.">Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (5), 667-673 (2013).</li><li>Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+target+isolation+for+novices:+affinity-based+strategies.">Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (6), 616-623 (2010).</li><li>Sleno, L., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+methods+for+drug+target+discovery.">Proteomic methods for drug target discovery.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).</li><li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li><li>Strickland, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+analysis+of+protein-ligand+binding+interactions+in+complex+biological+mixtures+using+the+stability+of+proteins+from+rates+of+oxidation.">Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation.</a> Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+cancer+drugs+in+living+cells+by+thermal+profiling+of+the+proteome.">Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome.</a> Science. 346 (6205), 1255784 (2014).</li><li>Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+identification+and+validation+of+protein+targets+of+natural+products+without+chemical+modification.">Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).</li><li>Pai, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS)+for+small-molecule+target+identification.">Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification.</a> Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).</li><li>Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+therapeutic+targeting+of+human+cancer+cell+motility.">Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility.</a> Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+autophagy+enhancer+as+a+therapeutic+agent+against+metabolic+syndrome+and+diabetes.">A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).</li><li>Schulte, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+blockade+of+ASCT2-dependent+glutamine+transport+leads+to+antitumor+efficacy+in+preclinical+models.">Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models.</a> Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).</li><li>Skrott, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol-abuse+drug+disulfiram+targets+cancer+via+p97+segregase+adaptor+NPL4.">Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4.</a> Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosidin2+targets+conserved+exocyst+complex+subunit+EXO70+to+inhibit+exocytosis.">Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).</li><li>Chin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolite+alpha-ketoglutarate+extends+lifespan+by+inhibiting+ATP+synthase+and+TOR.">The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR.</a> Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).</li><li>Robinson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+identifies+disulfiram+as+a+potential+therapeutic+for+triple-negative+breast+cancer+cells:+interaction+with+IQ+motif-containing+factors.">High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors.</a> Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).</li><li>Aghajan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+screen+for+enhancers+of+rapamycin+identifies+a+specific+inhibitor+of+an+SCF+family+E3+ubiquitin+ligase.">Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+staining.">Coomassie blue staining.</a> Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).</li><li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+human+immunophilin+FKBP-12+complexes+with+FK506+and+rapamycin.">Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).</li><li>Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+direct+protein+targets+of+small+molecules.">Identification of direct protein targets of small molecules.</a> ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).</li><li>Park, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Multiple+Cryptococcal+Fungicidal+Drug+Targets+by+Combined+Gene+Dosing+and+Drug+Affinity+Responsive+Target+Stability+Screening.">Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+promotes+beta-catenin+citrullination+and+inhibits+Wnt+signaling+in+cancer.">Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).</li></ol>

DARTS يسمح لتحديد أهداف جزيء صغير عن طريق استغلال تأثير وقائي من البروتين ملزمة ضد التدهور. DARTS لا يتطلب أي تعديل كيميائي أو تجميد جزيء صغير26. وهذا يسمح للجزيئات الصغيرة لاستخدامها لتحديد أهدافالبروتين ملزمة مباشرة. معايير التقييم القياسية لطريقة السهام الكلاسيكية تشمل تلطيخ ه...

تحديد البروتينات المستهدفة جزيء صغير ضروري لفهم الميكانيكية وتطويرالأدوية العلاجية المحتملة 1،2،3. الكروماتوغرافيا التقارب، كطريقة كلاسيكية لتحديد البروتينات المستهدفة من الجزيئات الصغيرة، وقد أسفرت عن نتائج جيدة4،5. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لها قيود، في أن التعديل الكيميائي للجزيئات الصغيرة غالبا ما يؤدي إلى انخفاض أو تغيير خصوصية ملزمة أو تقارب. وللتغلب على هذه القيود، تم مؤخرا ً وضع وتطبيق عدة استراتيجيات جديدة لتحديد أهداف الجزيئات الصغيرة دون تعديل كيميائي للجزيئات الصغيرة. وتشمل هذه الطرق المباشرة لتحديد الهدف من الجزيئات الصغيرة خالية من الملصقات استقرار الهدف استجابة المخدرات (DARTS)6، واستقرار البروتينات من معدلات الأكسدة (SPROX)7، فحص التحول الحراري الخلوي (CETSA)8 ،9، والحرارية البروتيوم التنميط (TPP)10. هذه الأساليب هي مفيدة للغاية لأنها تستخدم جزيئات طبيعية صغيرة غير معدلة وتعتمد فقط على التفاعلات ملزمة مباشرة للعثور على البروتينات المستهدفة11.
من بين هذه الأساليب الجديدة، DARTS هو منهجية بسيطة نسبيا التي يمكن اعتمادها بسهولة من قبل معظم مختبرات12،13. يعتمد السهام على مفهوم أن البروتينات المرتبطة بالرباط تظهر قابلية معدلة للتحلل الأنزيمي بالنسبة للبروتينات غير المنضمة. ويمكن الكشف عن البروتين المستهدف الجديد عن طريق فحص النطاق المعدل في جل SDS-PAGE من خلال قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS/MS). تم تنفيذ هذا النهج بنجاح لتحديد الأهداف غير المعروفة سابقا من المنتجات الطبيعية والأدوية14،15،16،17،18، 19.كما أنها قوية كوسيلة لفحص أو التحقق من صحة ربط المركبات لبروتين معين20،21. في هذه الدراسة، نقدم تحسينا للتجربة من خلال رصد التغيرات في استقرار البروتين مع الجزيئات الصغيرة وتحديد الروابط ملزمة البروتين-ligand. نحن نستخدم mTOR- rapamycin التفاعل كمثال لإثبات نهجنا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Dilute to 20X with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>DMEM medium with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>statistical analysis and drawing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Version 1.52</td>
			<td>image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Cell Lysis Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction

استقرار الهدف المستجيب للأدوية (DARTS) هو طريقة قوية للكشف عن أهداف بروتين جزيء صغير جديدة. ويمكن استخدامه للتحقق من التفاعلات الصغيرة المعروفة بين الجزيئات والبروتين والعثور على أهداف البروتين المحتملة للمنتجات الطبيعية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، DARTS يستخدم الأصلي، غير المعدلة، جزيئات صغيرة وبسيطة وسهلة التشغيل. في هذه الدراسة، قمنا بزيادة تعزيز قدرات تحليل البيانات من تجربة DARTS من خلال رصد التغيرات في استقرار البروتين وتقدير تقارب التفاعلات البروتيني. يمكن رسم تفاعلات البروتين ligand في منحنىين: منحنى بروتيوليتيك ومنحنى الاعتماد على الجرعة. لقد استخدمنا التفاعل بين mTOR-rapamycin كحالة مثالية لوضع بروتوكولنا. من منحنى بروتيوليتيك رأينا أن البروتيوليز من mTOR من قبل بروناز كان يمنعها وجود رابامايسين. منحنى الاعتماد على الجرعة سمح لنا لتقدير التقارب ملزمة من رابامايسين وmTOR. ومن المرجح أن تكون هذه الطريقة طريقة قوية وبسيطة لتحديد البروتينات المستهدفة الجديدة بدقة ولتحسين المشاركة المستهدفة في مجال المخدرات.

ويرد مخطط تدفق التجربة في الشكل 1. وتظهر نتيجة تلطيخ الأزرق Coomassie في الشكل 2. الحضانة مع جزيء صغير يمنح الحماية ضد البروتيوليز. تم العثور على ثلاثة العصابات التي يبدو أنها محمية عن طريق الحضانة مع رابامايسين على السيطرة على المركبات. تظهر النتائج المتوقعة من ...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction at JoVE.com

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

في هذه الدراسة، عززنا قدرات تحليل البيانات من تجربة DARTS من خلال رصد التغيرات في استقرار البروتين وتقدير تقارب التفاعلات البروتيني. ويمكن رسم التفاعلات في منحنىين: منحنى بروتيوليتيك ومنحنى الاعتماد على الجرعة. لقد استخدمنا التفاعل بين mTOR-rapamycin كحالة مثالية.

شبه كمية المخدرات تقارب استجابة الهدف الاستقرار (DARTS) دراسة التفاعل راباميسين / mTOR

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

المخدرات تقارب استجابة الاستقرار المستهدف، DARTS، هو وسيلة قوية للكشف عن أهداف البروتين جزيء صغير رواية. ويمكن استخدامه للتحقق من التفاعلات المعروفة للبروتينات الصغيرة الجزيء والعثور على أهداف البروتين المحتملة للمنتجات الطبيعية. في هذه الدراسة، ونحن زيادة تعزيز قدرات تحليل البيانات من تجربة السهام من خلال رصد التغيرات في استقرار البروتين وتقدير تقارب التفاعلات البروتين ligand.يمكن رسم التفاعلات البروتين ligand ضد اثنين من المنحنيات، منحنى البروتينية ومنحنى الاعتماد على الجرعة. لقد استخدمنا التفاعل mTOR-rapamycin كحالة مثالية لإنشاء بروتوكول لدينا. تنمو الخلايا 293T باستخدام DMEM مع 10٪ مصل الأبقار الجنينية, الجلوتامين مليمولار, و 1٪ المضادات الحيوية.احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل الثقافة إلى 80 إلى 90٪ التقاء، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني الباردة. استخدام مكشطة الخلية لجمع الخلايا في كمية مناسبة من خلية الباردة تحلل العازلة ونقل الخلايا التحلل في أنبوب 1.5 ملليمتر.عكس لخلط العازلة تحلل وخلايا lysing جيدا واحتضان أنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 18،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. نقل المابير في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر والحفاظ على المبردة على الجليد.أداء BCA المقسّم إلى تقريب تركيز البروتين من اللساتات وحساب تخفيف pronase على أساس تركيز البروتين. أولاً، نقل الـ lysate إلى أنبوبين 1.5 ملليلتر، 99 ميكرولترر لكل منهما. إضافة ميكرولتر واحد من محلول الأسهم جزيء صغير إلى كل aliquot من lysate واحتضان أنبوبين لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز.على الجليد، وإنشاء المخففات المسلسل من محلول pronase المذاب حديثا في 1x TNC. بعد الحضانة مع جزيء صغير، وتقسيم كل aliquot إلى 20 ميكرولترات من العينات في خمسة أنابيب. لضمان نفس الوقت الهضم، على فترات محددة من كل 30 ثانية، إضافة اثنين microliters من حلول pronase أعدت للعينات وفقا لذلك.لمجموعة التحكم واحدة، إضافة اثنين microliters من المخزن المؤقت عبر الوطنية. بعد خمس إلى 20 دقيقة ، أوقف هضم الأنابيب الستة عن طريق إضافة اثنين من microliters من كوكتيل مثبطات البرودة 20x protease على فترات 30 ثانية. تخلط جيدا واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق.تخفيف كل عينة مع ستة ميكرولترات من 5x SDS-PAGE تحميل العازلة وغلي العينات في حمام مائي في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الآن، لأداء لطخة الغربية، تحميل كميات متساوية من البروتين في آبار هلام 8٪ SDS-PAGE، جنبا إلى جنب مع علامة الوزن الجزيئية المناسبة. تشغيل الجل لمدة 30 دقيقة في 80 فولت، ثم ضبط الجهد إلى 120 فولت ومواصلة تشغيل لمدة ساعة إلى ساعتين.تحقق من أن الجزيء الصغير يمكن أن يرتبط مباشرة بالبروتينات المستهدفة المحتملة. في هذا البروتوكول، الحضانة مع جزيء صغير أكد الحماية ضد تحلل البروتين. وتبين أن ثلاث نطاقات محمية بالاحتضان مع الراباميسين على مراقبة المركبات.وأوضح النشاف الغربية وجود بروتين mTOR في البروتين منخفضة إلى نسب البروتين والحد منه والخسارة مع زيادة النسب. Proteolysis من mTOR بواسطة pronase كان من الواضح أن منعت من وجود rapamycin وإضافة rapamycin ولدت تحولا واضحا في منحنى proteolytic. Rapamycin الجرعة تعتمد على تعزيز مستوى mTOR, مما يشير إلى ارتفاع استقرار mTOR مع العلاج راباميسين.ويشير القياس الكمي لكثافات نطاق البروتين المستهدف إلى أن mTOR هو البروتين المستهدف للراباميسين. من أجل الحصول على أفضل تأثير متدرج، قد يكون لهذه التجربة أن تتكرر عدة مرات للحصول على مجموعة مناسبة من pronase على نسب البروتين.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

الكالوري الضوئي التفاضلية - منهج في تقييم الثبات الحراري والتشكل من البروتين مستضد

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

نهج G-quadruplex الحمض النووي تقارب لتنقية نشط إنزيمي G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية تدفق تمتد مقايسة التنفيذ لدراسة نقل جزيئات على طول الحمض النووي

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

بيوبانينج شبه الآلي المكتبات عرض البكتيريا الببتيد تقارب كاشف اكتشاف وتحليل يعزل الناتجة

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

A الخميرة تعديل واحد نظام هجين ل هيتيروميريك البروتين مجمع دنا التفاعل الدراسات

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop المعطل تداولها تقارب معدنية اللوني، إعادة تشكيل ومقايسة من بوليهيستيديني معلم متالونزيمي للمختبرات الجامعية

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...