Name: a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction
Uploaded: 2019-08-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af NIH Research Grants R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484 og et FORSVARS forskningsstipendium W81XWH-16-1-0482.

1. Saml og lyse celler
<ol><li>Grow 293T celler ved hjælp af Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) med 10% føtal kvægserum, 2 mM glutamin og 1% antibiotika. Inkuber kulturer ved 37 °C under 5% CO2. Bemærk: cellernes vækst tilstand kan påvirke stabiliteten af efterfølgende eksperimenter.</li>
	<li>Udvid cellerne i kulturen, indtil de når 80 \ u201290% sammenløbet.</li>
	<li>Bland 345 μL cellelyse reagens (Se tabel over materialer) med 25 μl 20x proteasehæmmer cocktail, 2...

<ol>
	<li>Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome:+Evaluation+of+drug+targets+in+clinical+trials+suggests+major+shifts+in+molecular+class+and+indication.">The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).</li><li>O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics.">Chemical genetics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).</li><li>McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+elucidation+of+protein-small+molecule+interactions.">Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (5), 667-673 (2013).</li><li>Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+target+isolation+for+novices:+affinity-based+strategies.">Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (6), 616-623 (2010).</li><li>Sleno, L., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+methods+for+drug+target+discovery.">Proteomic methods for drug target discovery.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).</li><li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li><li>Strickland, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+analysis+of+protein-ligand+binding+interactions+in+complex+biological+mixtures+using+the+stability+of+proteins+from+rates+of+oxidation.">Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation.</a> Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+cancer+drugs+in+living+cells+by+thermal+profiling+of+the+proteome.">Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome.</a> Science. 346 (6205), 1255784 (2014).</li><li>Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+identification+and+validation+of+protein+targets+of+natural+products+without+chemical+modification.">Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).</li><li>Pai, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS)+for+small-molecule+target+identification.">Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification.</a> Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).</li><li>Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+therapeutic+targeting+of+human+cancer+cell+motility.">Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility.</a> Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+autophagy+enhancer+as+a+therapeutic+agent+against+metabolic+syndrome+and+diabetes.">A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).</li><li>Schulte, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+blockade+of+ASCT2-dependent+glutamine+transport+leads+to+antitumor+efficacy+in+preclinical+models.">Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models.</a> Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).</li><li>Skrott, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol-abuse+drug+disulfiram+targets+cancer+via+p97+segregase+adaptor+NPL4.">Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4.</a> Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosidin2+targets+conserved+exocyst+complex+subunit+EXO70+to+inhibit+exocytosis.">Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).</li><li>Chin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolite+alpha-ketoglutarate+extends+lifespan+by+inhibiting+ATP+synthase+and+TOR.">The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR.</a> Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).</li><li>Robinson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+identifies+disulfiram+as+a+potential+therapeutic+for+triple-negative+breast+cancer+cells:+interaction+with+IQ+motif-containing+factors.">High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors.</a> Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).</li><li>Aghajan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+screen+for+enhancers+of+rapamycin+identifies+a+specific+inhibitor+of+an+SCF+family+E3+ubiquitin+ligase.">Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+staining.">Coomassie blue staining.</a> Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).</li><li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+human+immunophilin+FKBP-12+complexes+with+FK506+and+rapamycin.">Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).</li><li>Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+direct+protein+targets+of+small+molecules.">Identification of direct protein targets of small molecules.</a> ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).</li><li>Park, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Multiple+Cryptococcal+Fungicidal+Drug+Targets+by+Combined+Gene+Dosing+and+Drug+Affinity+Responsive+Target+Stability+Screening.">Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+promotes+beta-catenin+citrullination+and+inhibits+Wnt+signaling+in+cancer.">Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).</li></ol>

DART giver mulighed for identifikation af små molekyle mål ved at udnytte den beskyttende effekt af proteinbinding mod nedbrydning. DART kræver ingen kemisk modifikation eller immobilisering af det lille molekyle26. Dette gør det muligt at bruge små molekyler til at bestemme deres direkte bindende protein mål. Standard vurderingskriterier for den klassiske dart metode omfatter gel farvning, massespektrometri og Western blotting12,13....

Identifikation af små molekyle målproteiner er afgørende for den mekanistiske forståelse og udvikling af potentielle terapeutiske stoffer1,2,3. Affinitets kromatografi, som en klassisk metode til at identificere målproteiner af små molekyler, har givet gode resultater4,5. Men denne metode har begrænsninger, i at kemisk modifikation af små molekyler ofte resulterer i reduceret eller ændret bindende specificitet eller affinitet. For at overvinde disse begrænsninger, er flere nye strategier for nylig blevet udviklet og anvendt til at identificere de små molekyle mål uden kemisk modifikation af de små molekyler. Disse direkte metoder til identifikation af etiket frie små molekyler omfatter Drug affinitet lydhør Target stabilitet (dart)6, stabilitet af proteiner fra oxidations hastigheder (sprox)7, cellulære termisk Shift assay (cetsa)8 ,9og termisk proteom profilering (TPP)10. Disse metoder er meget fordelagtige, fordi de bruger naturlige, umodificerede små molekyler og kun stole på direkte bindende interaktioner for at finde Target proteiner11.
Blandt disse nye metoder, dart er en forholdsvis enkel metode, der nemt kan vedtages af de fleste Labs12,13. DART afhænger af konceptet om, at ligand-bundne proteiner udviser modificeret modtagelighed for Enzymatisk nedbrydning i forhold til ubundne proteiner. Det nye målprotein kan påvises ved undersøgelse af det ændrede bånd i SDS-PAGE gel gennem væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS/MS). Denne tilgang er blevet gennemført med succes for at identificere tidligere ukendte mål for naturlige produkter og narkotika14,15,16,17,18, 19. det er også kraftfuld som et middel til at screene eller validere binding af forbindelser til et bestemt protein20,21. I denne undersøgelse præsenterer vi en forbedring af eksperimentet ved at overvåge ændringerne i protein stabiliteten med små molekyler og identificere protein-ligand bindende tilhørsforhold. Vi bruger mTOR-Rapamycin interaktion som et eksempel for at demonstrere vores tilgang.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Dilute to 20X with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>DMEM medium with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>statistical analysis and drawing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Version 1.52</td>
			<td>image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Cell Lysis Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction

Drug affinitet lydhør Target stabilitet (dart) er en robust metode til påvisning af nye små molekyle protein mål. Det kan bruges til at verificere kendte små molekyle-protein interaktioner og til at finde potentielle protein mål for naturlige produkter. Sammenlignet med andre metoder bruger dart indfødte, umodificerede, små molekyler og er enkel og nem at betjene. I denne undersøgelse forbedrede vi yderligere dataanalyse mulighederne i dart eksperimentet ved at overvåge ændringerne i protein stabiliteten og vurdere affiniteten af protein-ligand-interaktioner. Proteinet-ligand-interaktioner kan afbildes i to kurver: en proteolytisk kurve og en dosis afhængigheds kurve. Vi har brugt mTOR-Rapamycin interaktion som en eksemplarisk sag for etablering af vores protokol. Fra den proteolytiske kurve så vi, at proteolysen af mTOR ved pronasen blev hæmmet af tilstedeværelsen af Rapamycin. Dosis-afhængigheds kurven gjorde det muligt for os at estimere den bindende affinitet af Rapamycin og mTOR. Denne metode er sandsynligvis en kraftfuld og enkel metode til præcist at identificere nye målproteiner og til optimering af Drug Target engagement.

Eksperimentets flowdiagram er skitseret i figur 1. Resultatet af Coomassie blå farvning er vist i figur 2. Inkubation med det lille molekyle giver beskyttelse mod proteolyse. Tre bands, der synes at være beskyttet af inkubation med Rapamycin over køretøjets kontrol er fundet. De forventede resultater fra proteolytisk kurve eksperiment er vist i figur 3. Som en proof-of-princip, vi undersøgte den godt studeret protein mTOR, som ...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction at JoVE.com

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

I denne undersøgelse forbedrede vi dataanalyse mulighederne i dart eksperimentet ved at overvåge ændringerne i protein stabiliteten og anslå affiniteten af protein-ligand-interaktioner. Samspillet kan afbildes i to kurver: en proteolytisk kurve og en dosis afhængigheds kurve. Vi har brugt mTOR-Rapamycin interaktion som et eksemplarisk tilfælde.

En semi-kvantitativ stof affinitet lydhør Target stabilitet (dart) assay til at studere Rapamycin/mTOR interaktion

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Drug affinitet lydhør mål stabilitet, DARTS, er en robust metode til påvisning af nye små-molekyle protein mål. Det kan bruges til at kontrollere kendte små-molekyle protein interaktioner og til at finde potentielle protein mål for naturlige produkter. I denne undersøgelse forbedrer vi yderligere darts-eksperimentets dataanalysekapacitet ved at overvåge ændringerne i proteinstabiliteten og anslå affiniteten af protein-ligandinteraktioner.Protein-ligand interaktioner kan plottes mod to kurver, en proteolytisk kurve og en dosis-afhængighed kurve. Vi har brugt mTOR-rapamycin interaktion som en eksemplarisk sag for oprettelsen af vores protokol. Vokse 293T celler ved hjælp af DMEM med 10% føtal kvæg serum, to-millimolar glutamin, og 1% antibiotika.Inkuber kulturerne ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid. Når kulturen når 80 til 90%sammenløb, vaskes cellerne to gange med kold PBS. Brug en celleskraber til at samle cellerne i en passende mængde koldcellelysisbuffer og overfør lyscellerne til et 1,5 millimeter rør.Invertere til at blande lysis buffer og lysing celler godt og inkubere røret på is i 10 minutter. Centrifuge røret ved 18, 000 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 milliliterrør og hold den kølet på is.BCA-analysen udføres for at tilnærme proteinkoncentrationen af lysater og beregne fortyndingen af pronase baseret på proteinkoncentrationen. Først overføres lysatet til to 1,5 milliliterrør, 99 mikroliter hver. Tilsæt en mikroliter af små molekyle lageropløsning til hver aliquot af lysate og inkubere de to rør i 30 til 60 minutter ved stuetemperatur med omrystning.På is, etablere serielle fortyndinger af frisk optøet pronase opløsning i 1x TNC. Efter inkubationen med det lille molekyle opdeles hver aliquot i 20 mikroliter af prøver i fem rør. For at sikre den samme fordøjelsestid med bestemte intervaller på hver 30.For den ene kontrolgruppe skal du tilføje to mikroliter TNC-buffer. Efter fem til 20 minutter standse fordøjelsen af de seks rør ved tilsætning af to mikroliter af kold 20x proteasehæmmer cocktail med 30-sekunders intervaller. Bland godt og inkubere på is i 10 minutter.Hver prøve fortyndes med seks mikroliter 5x SDS-PAGE-læssebufferen, og prøverne koges i et vandbad ved 70 grader Celsius i 10 minutter. Nu, at udføre Western blot, belastning lige store mængder af protein i brøndene af en 8% SDS-PAGE gel, sammen med en passende molekylvægt markør. Kør gelen i 30 minutter ved 80 volt, juster derefter spændingen til 120 volt og fortsæt med at køre i en til to timer.Kontroller, at det lille molekyle kan binde direkte til de potentielle målproteiner. I denne protokol bekræftede inkubation med det lille molekyle beskyttelsen mod proteolyse. Tre bånd blev fundet at være beskyttet ved inkubation med rapamycin over køretøjets kontrol.Western blotting illustrerede tilstedeværelsen af mTOR-protein ved lave pronase-til-proteinforhold og dets reduktion og tab med stigende nøgletal. Proteolyse af mTOR ved pronase var tydeligt hæmmet af tilstedeværelsen af rapamycin, og tilsætning af rapamycin skabte et tydeligt skift i den proteolytiske kurve. Rapamycin-dosis-afhængig forbedret niveauet af mTOR, hvilket tyder på den stigende stabilitet af mTOR med rapamycin behandling.Kvantificering af målproteinbåndintensiteten tydede på, at mTOR er målproteinet for rapamycin. For at få den bedste trinvise effekt, dette eksperiment kan være nødvendigt at gentage flere gange for at opnå et passende udvalg af pronase over protein nøgletal.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differentialscanningskalometri - en metode til vurdering den termiske stabilitet og Kropsbygning af protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

En G-quadruplex DNA-affinitet tilgang til oprensning af enzymatisk aktivt G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle Flow strækker Assay gennemførelse for at studere Transport af molekyler langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatiske Biopanning af bakteriel Display biblioteker for peptid affinitet reagens opdagelse og analyse af resulterende isolater

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Et modificeret gær-et hybrid system til studier af heteromere proteinkompleks-DNA-interaktioner

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop immobiliseret Metal affinitet kromatografi, rekonstitution og analyse af en Polyhistidine mærkede Metalloenzyme for Undergraduate laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanopartikler System for Membran Protein-Protein Interaktion Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...