Name: a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction
Uploaded: 2019-08-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי מחקר NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, ומענק מחקר של משרד ההגנה W81XWH-16-1-0482.

1. לאסוף ולקבל תאים
<ol><li>לגדל תאים 293T באמצעות מדיום שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% סרום עוברי, 2 מ"מ גלוטמין ו 1% אנטיביוטיקה. תרבות הדגירה ב 37 ° c תחת 5% CO2. הערה: מצב הגדילה של התאים עלול להשפיע על היציבות של הניסויים הבאים.</li>
	<li>הרחב את התאים בתרבות עד שנגיע ל-80 \ u201290% זרימה.</li>
	<li>מערבבים 345 μL של פ?...

<ol>
	<li>Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome:+Evaluation+of+drug+targets+in+clinical+trials+suggests+major+shifts+in+molecular+class+and+indication.">The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).</li><li>O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics.">Chemical genetics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).</li><li>McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+elucidation+of+protein-small+molecule+interactions.">Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (5), 667-673 (2013).</li><li>Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+target+isolation+for+novices:+affinity-based+strategies.">Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (6), 616-623 (2010).</li><li>Sleno, L., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+methods+for+drug+target+discovery.">Proteomic methods for drug target discovery.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).</li><li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li><li>Strickland, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+analysis+of+protein-ligand+binding+interactions+in+complex+biological+mixtures+using+the+stability+of+proteins+from+rates+of+oxidation.">Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation.</a> Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+cancer+drugs+in+living+cells+by+thermal+profiling+of+the+proteome.">Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome.</a> Science. 346 (6205), 1255784 (2014).</li><li>Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+identification+and+validation+of+protein+targets+of+natural+products+without+chemical+modification.">Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).</li><li>Pai, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS)+for+small-molecule+target+identification.">Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification.</a> Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).</li><li>Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+therapeutic+targeting+of+human+cancer+cell+motility.">Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility.</a> Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+autophagy+enhancer+as+a+therapeutic+agent+against+metabolic+syndrome+and+diabetes.">A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).</li><li>Schulte, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+blockade+of+ASCT2-dependent+glutamine+transport+leads+to+antitumor+efficacy+in+preclinical+models.">Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models.</a> Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).</li><li>Skrott, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol-abuse+drug+disulfiram+targets+cancer+via+p97+segregase+adaptor+NPL4.">Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4.</a> Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosidin2+targets+conserved+exocyst+complex+subunit+EXO70+to+inhibit+exocytosis.">Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).</li><li>Chin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolite+alpha-ketoglutarate+extends+lifespan+by+inhibiting+ATP+synthase+and+TOR.">The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR.</a> Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).</li><li>Robinson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+identifies+disulfiram+as+a+potential+therapeutic+for+triple-negative+breast+cancer+cells:+interaction+with+IQ+motif-containing+factors.">High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors.</a> Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).</li><li>Aghajan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+screen+for+enhancers+of+rapamycin+identifies+a+specific+inhibitor+of+an+SCF+family+E3+ubiquitin+ligase.">Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+staining.">Coomassie blue staining.</a> Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).</li><li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+human+immunophilin+FKBP-12+complexes+with+FK506+and+rapamycin.">Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).</li><li>Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+direct+protein+targets+of+small+molecules.">Identification of direct protein targets of small molecules.</a> ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).</li><li>Park, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Multiple+Cryptococcal+Fungicidal+Drug+Targets+by+Combined+Gene+Dosing+and+Drug+Affinity+Responsive+Target+Stability+Screening.">Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+promotes+beta-catenin+citrullination+and+inhibits+Wnt+signaling+in+cancer.">Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).</li></ol>

חצים מאפשר זיהוי מטרות מולקולה קטנה על ידי ניצול ההשפעה המגנה של כריכת חלבון נגד השפלה. חצים אינו דורש כל שינוי כימי או השתק של המולקולה הקטנה26. זה מאפשר מולקולות קטנות לשמש כדי לקבוע מטרות החלבון המחייב שלהם ישירה. קריטריוני הערכה סטנדרטיים לשיטת החצים הקלאסיים כוללים כתמים ...

זיהוי מולקולה קטנה היעד חלבונים הוא חיוני הבנה מכניסטית ופיתוח של תרופות טיפוליות פוטנציאליות1,2,3. אהדה כרומטוגרפיה, כשיטה קלאסית לזיהוי חלבונים היעד של מולקולות קטנות, הניב תוצאות טובות4,5. עם זאת, שיטה זו יש מגבלות, בשינוי כימי זה של מולקולות קטנות לעתים קרובות גורמת מופחת או שונה ספציפיות הקשירה או אהדה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, כמה אסטרטגיות חדשות פותחו לאחרונה ויישם כדי לזהות את מטרות המולקולה הקטנה ללא שינוי כימי של מולקולות קטנות. אלה שיטות ישירות לזיהוי היעד של מולקולות קטנות ללא תוויות כוללות עמידות בפני התרופה ביציבות היעד (חצים)6, יציבות של חלבונים משיעורי חמצון (sprox)7, הטלפון התרמי משמרת תרמית (cetsa)8 ,9, ו התרמי פרופיל פרוטדום (tpp)10. שיטות אלה הן יתרון מאוד כי הם משתמשים טבעיים, מולקולות קטנות שאינן בשימוש ולהסתמך רק על אינטראקציות כריכה ישירה למצוא חלבונים היעד11.
בין אלה שיטות חדשות, חצים היא מתודולוגיה פשוטה יחסית שיכולה בקלות להיות מאומצת על ידי רוב מעבדות12,13. החצים תלויים במושג כי חלבונים ליגטיים להפגין שונה רגישות השפלה אנזימטית ביחס לחלבונים לא מאוגדים. חלבון היעד החדש יכול להיות מזוהה על ידי בחינת הלהקה שונה ב SDS-דף ג ' ל באמצעות ספקטרומטריה כרומטוגרפיה נוזלית המסה (LC-MS/MS). גישה זו יושמה בהצלחה לזיהוי של מטרות לא ידועות בעבר של מוצרים טבעיים ותרופות14,15,16,17,18 , 19. הוא גם חזק כאמצעי למסך או לאמת קשירה של תרכובות לחלבון מסוים20,21. במחקר זה, אנו מציגים שיפור לניסוי על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים עם מולקולות קטנות וזיהוי ליגולי חלבונים וכריכה. אנו משתמשים באינטראקציה mTOR-rapamycin כדוגמה כדי להדגים את הגישה שלנו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Dilute to 20X with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>DMEM medium with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>statistical analysis and drawing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Version 1.52</td>
			<td>image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Cell Lysis Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction

זיקה לסמים יציבות היעד (משחק דארטס) היא שיטה איתנה לזיהוי מטרות מולקולות קטנות של חלבון מולקולה. ניתן להשתמש בו כדי לאמת אינטראקציות קטנות ומולקולות של חלבונים ולמצוא מטרות חלבון פוטנציאליות עבור מוצרים טבעיים. לעומת שיטות אחרות, חצים משתמש יליד, לא שונה, מולקולות קטנות הוא פשוט וקל לתפעול. במחקר זה, אנו משפרים עוד יותר את יכולות ניתוח הנתונים של הניסוי חצים על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים והערכת הזיקה של חלבונים ליגוניים ואינטראקציות. ניתן להתוות את החלבון-ligand אינטראקציות לשתי עקומות: עקומת פרוטחרדה ועקומת תלות במינון. השתמשנו באינטראקציה של mTOR-rapamycin כמקרה מופתי להקמת הפרוטוקול שלנו. מתוך עקומת נגד חרדה ראינו כי פרוטפוליזיס של mTOR על ידי בינוי היה מעוכב על ידי נוכחות של rapamycin. עקומת תלות המינון אפשרה לנו להעריך את הזיקה המחייב של rapamycin ו mTOR. שיטה זו עשויה להיות שיטה רבת עוצמה ופשוטה לזיהוי מדויק של חלבונים ביעד הרומן ולמיטוב האירוסין של מטרת הסמים.

תרשים הזרימה של הניסוי מתואר באיור 1. התוצאה של כתמים כחולים Coomassie מוצג באיור 2. הדגירה עם המולקולה הקטנה מקנה הגנה מפני פרוטפוליזיס. שלוש להקות שנראות כהגנה על ידי דגירה עם rapamycin על השליטה ברכב נמצאים. התוצאות הצפויות מניסוי עקומת פרוטחרדה מוצגים <strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction at JoVE.com

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

במחקר זה, הצלחנו לשפר את יכולות ניתוח הנתונים של הניסוי חצים על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים והערכת האהדה של ליגוניות חלבונים ואינטראקציות. ניתן להתוות את האינטראקציות לשתי עקומות: עקומת פרוטחרדה ועקומת תלות במינון. השתמשנו באינטראקציה של mTOR-rapamycin כמקרה מופתי.

יחסי למחצה כמותית של התרופה מגיב יציבות היעד (חצים) שיטת לימוד האינטראקציה Rapamycin/mTOR

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

זיקה לסמים מגיבה ליציבות היעד, DARTS, היא שיטה חזקה לגילוי מטרות חלבון חדשניות של מולקולה קטנה. ניתן להשתמש בו כדי לאמת אינטראקציות ידועות של חלבונים במולקולה קטנה ולמצוא מטרות חלבון פוטנציאליות למוצרים טבעיים. במחקר זה, אנו משפרים עוד יותר את יכולות ניתוח הנתונים של ניסוי DARTS על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבון והערכת הזיקה של אינטראקציות חלבון-ליגנד.ניתן להתוות את אינטראקציות החלבון-ליגנד מול שתי עקומות, עקומה פרוטאוליטית ועקומת תלות במינון. השתמשנו באינטראקציה mTOR-rapamycin כמקרה למופת להקמת הפרוטוקול שלנו. לגדל תאים 293T באמצעות DMEM עם 10% סרום חזיר עוברי, גלוטמין שני מילימולרים, ו 1% אנטיביוטיקה.דגירה התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. כאשר התרבות מגיעה 80 עד 90%confluence, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS קר. השתמש מגרד תאים כדי לאסוף את התאים לתוך כמות מתאימה של מאגר תות תאים קרים ולהעביר את התאים lysing לתוך צינור 1.5 מילימטר.להפוך לערבב את חיץ תיזה ותאי lysing היטב דגירה הצינור על קרח במשך 10 דקות. צנטריפוגה הצינור ב 18, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש של 1.5 מיליליטר ומצננים על קרח.בצע בדיקת BCA כדי להעריך את ריכוז החלבון של ליזטים ולחשב את דילול הפרונסה בהתבסס על ריכוז החלבון. ראשית, להעביר את lysate לשני צינורות 1.5 מיליליטר, 99 microliters כל אחד. הוסף מיקרוליטר אחד של פתרון מלאי מולקולה קטנה לכל aliquot של ליט ולהדגר את שני הצינורות במשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר עם רועד.על הקרח, להקים דילול סדרתי של פתרון פרונס מופשר טרי ב 1x TNC. בעקבות הדגירה עם המולקולה הקטנה, מחלקים כל אליט ל-20 מיקרוליטרים של דגימות בחמישה צינורות. כדי להבטיח את אותו זמן עיכול, במרווחים ספציפיים של כל 30 שניות, להוסיף שני microliters של פתרונות pronase מוכן לדגימות בהתאם.עבור קבוצת הבקרה אחת, הוסף שני מיקרוליטרים של מאגר TNC. לאחר חמש עד 20 דקות, לעצור את העיכול של ששת הצינורות באמצעות תוספת של שני microliters של קוקטייל מעכבי פרוטאז קר 20x במרווחים של 30 שניות. מערבבים היטב ודגירה על קרח במשך 10 דקות.לדלל כל מדגם עם שישה microliters של חיץ טעינה 5x SDS-PAGE ולהרתיח את הדגימות באמבט מים ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. עכשיו, כדי לבצע כתם מערבי, לטעון כמויות שוות של חלבון לתוך הבארים של 8%SDS-PAGE ג'ל, יחד עם סמן משקל מולקולרי מתאים. הפעל את הג'ל במשך 30 דקות ב 80 וולט, ולאחר מכן להתאים את המתח ל 120 וולט ולהמשיך לרוץ במשך שעה עד שעתיים.ודא כי המולקולה הקטנה יכולה להיקשר ישירות לחלבוני היעד הפוטנציאליים. בפרוטוקול זה, הדגירה עם המולקולה הקטנה אישרה את ההגנה מפני פרוטאוליזה. שלוש להקות נמצאו מוגנות על ידי דגירה עם rapamycin על בקרת רכב.כתמים מערביים המחישו את נוכחותו של חלבון mTOR ביחסי פרונס לחלבון נמוכים ואת הפחתתו ואובדןו ביחסים הולכים וגדלים. פרוטאוליזה של mTOR על ידי פרונס היה מעוכב בבירור על ידי נוכחות של rapamycin ותוספת של rapamycin יצר שינוי ברור בעקומה פרוטאוליטית. Rapamycin מינון תלויה שיפרה את רמת mTOR, מה שמרמז על היציבות הגואה של mTOR עם טיפול rapamycin.כימות של התעצמות רצועת החלבון היעד הציע כי mTOR הוא חלבון היעד של rapamycin. על מנת לקבל את האפקט הטוב ביותר צעד אחר צעד, ניסוי זה עשוי להיות חוזר על עצמו מספר פעמים כדי להשיג מגוון מתאים של pronase על יחסי חלבון.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

גישה G-quadruplex זיקה-DNA עבור טיהור של enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop. מרותק למיטה כרומטוגרפיית זיקה מתכת, שיחזור ותייגת וזמינותו של Polyhistidine Metalloenzyme עבור המעבדה לתואר ראשון

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...