Name: a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction
Uploaded: 2019-08-27T14:00:00
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यह काम आंशिक रूप से NIH अनुसंधान अनुदान R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, और एक DOD अनुसंधान अनुदान W81XWH-16-1-0482 द्वारा समर्थित किया गया था.

1. लीजिए और lyse कोशिकाओं
<ol><li>10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 एमएम ग्लूटामाइन और 1% एंटीबायोटिक दवाओं के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) का उपयोग कर 293T कोशिकाओं हो जाना। 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ?...

<ol>
	<li>Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome:+Evaluation+of+drug+targets+in+clinical+trials+suggests+major+shifts+in+molecular+class+and+indication.">The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).</li><li>O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics.">Chemical genetics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).</li><li>McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+elucidation+of+protein-small+molecule+interactions.">Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (5), 667-673 (2013).</li><li>Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+target+isolation+for+novices:+affinity-based+strategies.">Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (6), 616-623 (2010).</li><li>Sleno, L., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+methods+for+drug+target+discovery.">Proteomic methods for drug target discovery.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).</li><li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li><li>Strickland, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+analysis+of+protein-ligand+binding+interactions+in+complex+biological+mixtures+using+the+stability+of+proteins+from+rates+of+oxidation.">Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation.</a> Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+cancer+drugs+in+living+cells+by+thermal+profiling+of+the+proteome.">Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome.</a> Science. 346 (6205), 1255784 (2014).</li><li>Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+identification+and+validation+of+protein+targets+of+natural+products+without+chemical+modification.">Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).</li><li>Pai, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS)+for+small-molecule+target+identification.">Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification.</a> Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).</li><li>Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+therapeutic+targeting+of+human+cancer+cell+motility.">Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility.</a> Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+autophagy+enhancer+as+a+therapeutic+agent+against+metabolic+syndrome+and+diabetes.">A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).</li><li>Schulte, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+blockade+of+ASCT2-dependent+glutamine+transport+leads+to+antitumor+efficacy+in+preclinical+models.">Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models.</a> Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).</li><li>Skrott, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol-abuse+drug+disulfiram+targets+cancer+via+p97+segregase+adaptor+NPL4.">Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4.</a> Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosidin2+targets+conserved+exocyst+complex+subunit+EXO70+to+inhibit+exocytosis.">Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).</li><li>Chin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolite+alpha-ketoglutarate+extends+lifespan+by+inhibiting+ATP+synthase+and+TOR.">The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR.</a> Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).</li><li>Robinson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+identifies+disulfiram+as+a+potential+therapeutic+for+triple-negative+breast+cancer+cells:+interaction+with+IQ+motif-containing+factors.">High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors.</a> Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).</li><li>Aghajan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+screen+for+enhancers+of+rapamycin+identifies+a+specific+inhibitor+of+an+SCF+family+E3+ubiquitin+ligase.">Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+staining.">Coomassie blue staining.</a> Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).</li><li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+human+immunophilin+FKBP-12+complexes+with+FK506+and+rapamycin.">Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).</li><li>Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+direct+protein+targets+of+small+molecules.">Identification of direct protein targets of small molecules.</a> ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).</li><li>Park, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Multiple+Cryptococcal+Fungicidal+Drug+Targets+by+Combined+Gene+Dosing+and+Drug+Affinity+Responsive+Target+Stability+Screening.">Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+promotes+beta-catenin+citrullination+and+inhibits+Wnt+signaling+in+cancer.">Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).</li></ol>

डार्ट्स गिरावट के खिलाफ प्रोटीन बाइंडिंग के सुरक्षात्मक प्रभाव का शोषण करके छोटे अणु लक्ष्यों की पहचान के लिए अनुमति देता है. छोटे अणु के किसी रासायनिक संशोधन या स्थिरीकरण की आवश्यकता नहीं है.</...

छोटे अणु लक्ष्य प्रोटीन की पहचान करने के लिए मशीनी समझ और संभावित चिकित्सीय दवाओं के विकास के लिए आवश्यक है1,2,3. छोटे अणुओं के लक्ष्य प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक शास्त्रीय विधि के रूप में एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी ने अच्छे परिणामदिए हैं 4,5. हालांकि, इस विधि की सीमाएं हैं, छोटे अणुओं के उस रासायनिक संशोधन में अक्सर कम या परिवर्तित बंधन विशिष्टता या समानता में परिणाम. इन सीमाओं को दूर करने के लिए, कई नई रणनीतियों हाल ही में विकसित किया गया है और छोटे अणुओं के रासायनिक संशोधन के बिना छोटे अणु लक्ष्यों की पहचान करने के लिए लागू किया गया है. लेबल मुक्त छोटे अणुओं के लक्ष्य की पहचान के लिए इन प्रत्यक्ष तरीकों दवा आत्मीयता उत्तरदायी लक्ष्य स्थिरता (DARTS)6, ऑक्सीकरण की दर से प्रोटीन की स्थिरता (SPROX)7, सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख (CETSA) 8 शामिल हैं ,9, और थर्मल प्रोटीओम प्रोफाइलिंग (TPP)10. ये विधियाँ अत्यधिक लाभप्रद हैं क्योंकि वे प्राकृतिक, असंशोधित छोटे अणुओं का उपयोग करते हैं और लक्ष्य प्रोटीन11को खोजने के लिए केवल प्रत्यक्ष बाध्यकारी अन्योन्यक्रियाओं पर निर्भर करते हैं।
इन नए तरीकों में , डार्ट्स एक अपेक्षाकृत सरल पद्धति है जिसे अधिकांश प्रयोगशालाओं12,13द्वारा आसानी से अपनाया जा सकता है . डार्ट्स अवधारणा पर निर्भर करता है कि ligand बाध्य प्रोटीन असीम प्रोटीन के सापेक्ष एंजाइमी गिरावट के लिए संशोधित संवेदनशीलता का प्रदर्शन. नए लक्ष्य प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस /एमएस) के माध्यम से एसडीएस-पेज जेल में परिवर्तित बैंड की परीक्षा द्वारा पता लगाया जा सकता है। प्राकृतिक उत्पादों और औषधियों के पूर्व अज्ञात लक्ष्यों की पहचान के लिए इस दृष्टिकोण को सफलतापूर्वक कार्यान्वित किया गया है14,15,16,17,18, 19. यह एक विशिष्ट प्रोटीन20,21के यौगिकों के बंधन की जांच या सत्यापन करने के साधन के रूप में भी शक्तिशाली है . इस अध्ययन में, हम छोटे अणुओं के साथ प्रोटीन स्थिरता में परिवर्तन की निगरानी और प्रोटीन-लिगंड बाध्यकारी सजातीयता की पहचान करके प्रयोग में सुधार प्रस्तुत करते हैं। हम अपने दृष्टिकोण को प्रदर्शित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में MTOR-rapamycin बातचीत का उपयोग करें।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Dilute to 20X with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>DMEM medium with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>statistical analysis and drawing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Version 1.52</td>
			<td>image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Cell Lysis Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction

दवा आत्मीयता उत्तरदायी लक्ष्य स्थिरता (DARTS) उपन्यास छोटे अणु प्रोटीन लक्ष्य का पता लगाने के लिए एक मजबूत तरीका है. यह ज्ञात छोटे अणु प्रोटीन बातचीत सत्यापित करने के लिए और प्राकृतिक उत्पादों के लिए संभावित प्रोटीन लक्ष्य खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य तरीकों के साथ तुलना में, DARTS देशी, असंशोधित, छोटे अणुओं का उपयोग करता है और सरल और संचालित करने के लिए आसान है. इस अध्ययन में, हमने प्रोटीन स्थिरता में परिवर्तनों की निगरानी करके और प्रोटीन-लिगन्ड अन्योन्यक्रियाओं की समानता का आकलन करके डार्ट्स प्रयोग की डेटा विश्लेषण क्षमताओं को और बढ़ाया है। प्रोटीन-लिगंड अन्योन्यक्रियाओं को दो वक्रों में प्लॉट किया जा सकता है: एक प्रोटीओलिटिक वक्र और एक खुराक-निर्भरता वक्र। हमने अपने प्रोटोकॉल की स्थापना के लिए एक अनुकरणीय मामले के रूप में MTOR-rapamycin बातचीत का उपयोग किया है। प्रोटीओलिटिक वक्र से हमने देखा कि प्रोनेस द्वारा एमडीओआर का प्रोटीओलिसिस रैपामाइसिन की उपस्थिति से बाधित था। खुराक निर्भरता वक्र हमें rapamycin और MTOR के बंधन संबंध का अनुमान लगाने की अनुमति दी. इस विधि को सही उपन्यास लक्ष्य प्रोटीन की पहचान करने के लिए और दवा लक्ष्य सगाई के अनुकूलन के लिए एक शक्तिशाली और सरल तरीका होने की संभावना है.

प्रयोग का प्रवाह चार्ट चित्र 1में रेखांकित किया गया है। Coomasie नीले धुंधला का परिणाम चित्र 2में दिखाया गया है. छोटे अणु के साथ इन्क्यूबेशन प्रोटीओलिसिस के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करता ?...

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A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

इस अध्ययन में, हमने प्रोटीन स्थिरता में परिवर्तनों की निगरानी करके और प्रोटीन-लिगंड अन्योन्यक्रियाओं की समानता का आकलन करके डार्ट्स प्रयोग की डेटा विश्लेषण क्षमताओं को बढ़ाया है। बातचीत दो घटता में प्लॉट किया जा सकता है: एक प्रोटीओलिटिक वक्र और एक खुराक निर्भरता वक्र. हमने एक अनुकरणीय मामले के रूप में MTOR-rapamycin बातचीत का उपयोग किया है।

Rapamycin/mTOR बातचीत के अध्ययन के लिए एक अर्द्ध मात्रक औषध आत्मीयता उत्तरदायी लक्ष्य स्थिरता (DARTS) परख

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

दवा आत्मीयता उत्तरदायी लक्ष्य स्थिरता, डार्ट्स, उपन्यास छोटे अणु प्रोटीन लक्ष्यों का पता लगाने के लिए एक मजबूत तरीका है। इसका उपयोग ज्ञात छोटे-अणु प्रोटीन इंटरैक्शन को सत्यापित करने और प्राकृतिक उत्पादों के लिए संभावित प्रोटीन लक्ष्यों को खोजने के लिए किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हम प्रोटीन स्थिरता में परिवर्तन की निगरानी और प्रोटीन-लिगांड इंटरैक्शन की आत्मीयता का आकलन करके डार्ट्स प्रयोग की डेटा विश्लेषण क्षमताओं को और बढ़ाते हैं।प्रोटीन-लिगांड इंटरैक्शन को दो घटता, एक प्रोटियोलिटिक वक्र और एक खुराक-निर्भरता वक्र के खिलाफ साजिश रची जा सकती है। हमने अपने प्रोटोकॉल की स्थापना के लिए एक अनुकरणीय मामले के रूप में mTOR-rapamycin बातचीत का उपयोग किया है। 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, दो मिलीमोलर ग्लूटामाइन, और 1% एंटीबायोटिक दवाओं के साथ डीएमईएम का उपयोग करके 293T कोशिकाएं बढ़ाएं।5% कार्बन डाइऑक्साइड के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों इनक्यूबेट । जब संस्कृति 80 से 90% संगम तक पहुंचती है, तो कोशिकाओं को ठंडे पीबीएस से दो बार धोएं। कोशिकाओं को उचित मात्रा में कोल्ड सेल लाइसिस बफर में इकट्ठा करने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें और लाइसिंग कोशिकाओं को 1.5 मिलीमीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।lysis बफर और लाइसिंग कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिलाने के लिए और 10 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब इनक्यूबेट । चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 18, 000 बार जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। सुपरनेट को एक नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर ठंडा रखें।lysates के प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए बीसीए परख करें और प्रोटीन एकाग्रता के आधार पर प्रोटीन के कमजोर पड़ने की गणना करें। सबसे पहले, lysate को दो 1.5 मिलीलीटर ट्यूब, 99 माइक्रोलीटर प्रत्येक में स्थानांतरित करें। lysate के प्रत्येक aliquot के लिए छोटे अणु स्टॉक समाधान के एक माइक्रोलीटर जोड़ें और मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर 30 से ६० मिनट के लिए दो ट्यूबों इनक्यूबेट ।बर्फ पर, 1x टीएनसी में हौसले से गल प्रोन्स समाधान के धारावाहिक कमजोर पड़ने की स्थापना। छोटे अणु के साथ इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक aliquot पांच ट्यूबों में नमूनों के 20 माइक्रोलीटर में विभाजित । एक ही पाचन समय सुनिश्चित करने के लिए, हर 30 सेकंड के विशिष्ट अंतराल पर, तदनुसार नमूनों के लिए तैयार प्रोनेज समाधान के दो माइक्रोलीटर जोड़ें।एक नियंत्रण समूह के लिए, टीएनसी बफर के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। पांच से 20 मिनट के बाद, 30 सेकंड के अंतराल पर ठंडे 20x प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के दो माइक्रोलीटर के अलावा के माध्यम से छह ट्यूबों के पाचन को रोकें। 10 मिनट के लिए बर्फ पर अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं।5x SDS-पेज लोडिंग बफर के छह माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक नमूने को पतला करें और नमूनों को 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में उबालें। अब, पश्चिमी दाग प्रदर्शन करने के लिए, एक उपयुक्त आणविक वजन मार्कर के साथ, एक 8% SDS-पेज जेल के कुओं में प्रोटीन की बराबर मात्रा में लोड करें । 80 वोल्ट पर 30 मिनट के लिए जेल चलाएं, फिर वोल्टेज को 120 वोल्ट में समायोजित करें और एक से दो घंटे तक दौड़ते रहें।सत्यापित करें कि छोटे अणु संभावित लक्ष्य प्रोटीन के लिए सीधे बांध सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, छोटे अणु के साथ इनक्यूबेशन प्रोटियोलिसिस के खिलाफ सुरक्षा की पुष्टि की। वाहन नियंत्रण पर रैपामाइसिन के साथ इनक्यूबेशन द्वारा तीन बैंड संरक्षित पाए गए ।पश्चिमी ब्लॉटिंग ने प्रोटीन अनुपात के लिए कम प्रोन्स पर mTOR प्रोटीन की उपस्थिति और बढ़ते अनुपात के साथ इसकी कमी और हानि को सचित्र किया । प्रोनेस द्वारा एमटीओर के प्रोटियोलिसिस को रैपामाइसिन की उपस्थिति से स्पष्ट रूप से बाधित किया गया था और रैपामाइसिन के अलावा प्रोटियोलिटिक वक्र में एक स्पष्ट बदलाव उत्पन्न हुआ था। रैपामाइसिन खुराक-निर्भर ने एमटीई के स्तर को बढ़ाया, रैपामाइसिन उपचार के साथ mTOR की बढ़ती स्थिरता का सुझाव दिया।लक्ष्य प्रोटीन बैंड तीव्रता के मात्राकरण ने सुझाव दिया कि एमटीईआरएपी रैपामाइसिन का लक्षित प्रोटीन है। सबसे अच्छा चरणवार प्रभाव प्राप्त करने के लिए, प्रोटीन अनुपात पर प्रोनेस की एक उपयुक्त श्रृंखला प्राप्त करने के लिए इस प्रयोग को कई बार दोहराया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCN1 और TRIP8b बीच प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के छोटे अणु inhibitors की पहचान के लिए विधि

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

अंतर स्कैनिंग उष्मामिति - थर्मल स्थिरता और प्रोटीन एंटीजन की रचना का आकलन के लिए एक विधि

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Enzymatically सक्रिय जी -4 Resolvase1 की शुद्धि के लिए एक जी quadruplex डीएनए आत्मीयता दृष्टिकोण

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

एक सरल, मजबूत, और उच्च प्रवाह एकल अणु डीएनए के साथ अणुओं के परिवहन के अध्ययन के लिए परख कार्यांवयन खींच प्रवाह

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

सेमी स्वचालित के लिए बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों के साथ पेप्टाइड समानता एजेंट खोज और परिणामस्वरूप अलग करने का विश्लेषण

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

हिेटोमोमेरिक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स-डीएनए इंटरेक्शन स्टडीज के लिए संशोधित खमीर-एक हाइब्रिड सिस्टम

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop मैटीरियल मेटल संबध क्रोमैटोग्राफी, पुनर्गठन और एक Polyhistidine की परख स्नातक प्रयोगशाला के लिए Metalloenzyme टैग

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

झिल्ली प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन विश्लेषण के लिए देशी सेल झिल्ली नैनोकण प्रणाली

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...