Name: a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction
Uploaded: 2019-08-27T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado em parte por concessões da pesquisa de NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, e uma concessão da pesquisa de DOD W81XWH-16-1-0482.

1. coletar e lyse células
<ol><li>Cresça as células 293T usando o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina e 1% de antibióticos. Incubar culturas a 37 ° c 5% CO2. Nota: o estado de crescimento das células pode afectar a estabilidade dos experimentos subsequentes.</li>
	<li>Expandir células na cultura até atingir 80 \ u201290% confluência.</li>
	<li>Misturar 345 μL de reagente de lise celular (ver a tabela de materiais) com 25 ?...

<ol>
	<li>Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome:+Evaluation+of+drug+targets+in+clinical+trials+suggests+major+shifts+in+molecular+class+and+indication.">The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).</li><li>O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics.">Chemical genetics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).</li><li>McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+elucidation+of+protein-small+molecule+interactions.">Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (5), 667-673 (2013).</li><li>Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+target+isolation+for+novices:+affinity-based+strategies.">Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (6), 616-623 (2010).</li><li>Sleno, L., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+methods+for+drug+target+discovery.">Proteomic methods for drug target discovery.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).</li><li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li><li>Strickland, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+analysis+of+protein-ligand+binding+interactions+in+complex+biological+mixtures+using+the+stability+of+proteins+from+rates+of+oxidation.">Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation.</a> Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+cancer+drugs+in+living+cells+by+thermal+profiling+of+the+proteome.">Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome.</a> Science. 346 (6205), 1255784 (2014).</li><li>Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+identification+and+validation+of+protein+targets+of+natural+products+without+chemical+modification.">Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).</li><li>Pai, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS)+for+small-molecule+target+identification.">Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification.</a> Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).</li><li>Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+therapeutic+targeting+of+human+cancer+cell+motility.">Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility.</a> Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+autophagy+enhancer+as+a+therapeutic+agent+against+metabolic+syndrome+and+diabetes.">A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).</li><li>Schulte, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+blockade+of+ASCT2-dependent+glutamine+transport+leads+to+antitumor+efficacy+in+preclinical+models.">Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models.</a> Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).</li><li>Skrott, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol-abuse+drug+disulfiram+targets+cancer+via+p97+segregase+adaptor+NPL4.">Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4.</a> Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosidin2+targets+conserved+exocyst+complex+subunit+EXO70+to+inhibit+exocytosis.">Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).</li><li>Chin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolite+alpha-ketoglutarate+extends+lifespan+by+inhibiting+ATP+synthase+and+TOR.">The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR.</a> Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).</li><li>Robinson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+identifies+disulfiram+as+a+potential+therapeutic+for+triple-negative+breast+cancer+cells:+interaction+with+IQ+motif-containing+factors.">High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors.</a> Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).</li><li>Aghajan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+screen+for+enhancers+of+rapamycin+identifies+a+specific+inhibitor+of+an+SCF+family+E3+ubiquitin+ligase.">Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+staining.">Coomassie blue staining.</a> Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).</li><li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+human+immunophilin+FKBP-12+complexes+with+FK506+and+rapamycin.">Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).</li><li>Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+direct+protein+targets+of+small+molecules.">Identification of direct protein targets of small molecules.</a> ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).</li><li>Park, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Multiple+Cryptococcal+Fungicidal+Drug+Targets+by+Combined+Gene+Dosing+and+Drug+Affinity+Responsive+Target+Stability+Screening.">Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+promotes+beta-catenin+citrullination+and+inhibits+Wnt+signaling+in+cancer.">Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).</li></ol>

O DARTS permite a identificação de alvos pequenos da molécula explorando o efeito protetor da ligação da proteína de encontro à degradação. DARDOS não requer qualquer modificação química ou imobilização da pequena molécula26. Isto permite que as moléculas pequenas sejam usadas para determinar seus alvos de ligação direta da proteína. Os critérios de avaliação padrão para o método clássico dos dardos incluem a mancha do gel, a espectrometria maciça e o western blotting<su...

Identificar proteínas-alvo de pequenas moléculas é essencial para a compreensão mecanicista e o desenvolvimento de potenciais fármacos terapêuticos1,2,3. A cromatografia de afinidade, como método clássico para identificar as proteínas-alvo de pequenas moléculas, produziu bons resultados4,5. No entanto, este método tem limitações, em que a modificação química de pequenas moléculas geralmente resulta em especificidade ou afinidade de ligação reduzida ou alterada. Para superar essas limitações, várias novas estratégias foram recentemente desenvolvidas e aplicadas para identificar os alvos de pequenas moléculas sem a modificação química das pequenas molécula. Estes métodos diretos para a identificação do alvo de moléculas pequenas Label-Free incluem a estabilidade de alvo responsiva da afinidade da droga (dardos)6, estabilidade das proteínas das taxas de oxidação (SPROX)7, ensaio térmico celular do deslocamento (cetsa)8 ,9, e perfil térmico do proteoma (TPP)10. Estes métodos são altamente vantajosos porque usam moléculas pequenas naturais, não modificadas e confiam somente em interações diretas da ligação para encontrar proteínas do alvo11.
Entre esses novos métodos, dardos é uma metodologia comparativamente simples que pode ser facilmente adotada pela maioria dos laboratórios12,13. O DARTS depende do conceito de que as proteínas ligadas ao ligand demonstram suscetibilidade modificada à degradação enzimática em relação às proteínas não acopladas. A nova proteína alvo pode ser detectada pelo exame da faixa alterada em gel de SDS-PAGE através de cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS/MS). Esta abordagem tem sido implementada com sucesso para identificação de alvos previamente desconhecidos de produtos naturais e drogas14,15,16,17,18, 19. também é poderoso como um meio de tela ou validar a ligação de compostos a uma proteína específica20,21. Neste estudo, apresentamos uma melhoria no experimento, monitorando as mudanças na estabilidade protéica com pequenas moléculas e identificando afinidades vinculativas de proteínas ligantes. Utilizamos a interação mTOR-rapamicina como exemplo para demonstrar nossa abordagem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Dilute to 20X with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>DMEM medium with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>statistical analysis and drawing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Version 1.52</td>
			<td>image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Cell Lysis Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction

A estabilidade do alvo responsivo da afinidade da droga (dardos) é um método robusto para a deteção de alvos pequenos novos da proteína da molécula. Pode ser usado para verificar interações pequenas conhecidas da molécula-proteína e encontrar alvos potenciais da proteína para produtos naturais. Comparado com outros métodos, DARTS usa moléculas nativas, não modificadas, pequenas e é simples e fácil de operar. Neste estudo, aprimoramos ainda mais as capacidades de análise de dados do experimento DARTS, monitorando as mudanças na estabilidade protéica e Estimando a afinidade das interações proteína-ligand. As interações proteína-ligantes podem ser plotadas em duas curvas: uma curva proteolítica e uma curva de dependência de dose. Nós usamos a interação de mTOR-Rapamycin como um exemplo exemplar para o estabelecimento de nosso protocolo. A partir da curva proteolítica, vimos que a proteólise do mTOR por soros foi inibida pela presença de rapamicina. A curva dose-dependência nos permitiu estimar a afinidade de ligação da rapamicina e do mTOR. Este método é susceptível de ser um método poderoso e simples para identificar com precisão novas proteínas-alvo e para a otimização do engajamento alvo de drogas.

O fluxograma do experimento é delineado na Figura 1. O resultado da coloração azul de Coomassie é mostrado na Figura 2. A incubação com a pequena molécula confere proteção contra proteólise. Três bandas que parecem ser protegidas por incubação com rapamicina sobre o controle do veículo são encontradas. Os resultados esperados do experimento de curva proteolítica são mostrados na Figura 3. Como prova de princípio, e...

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A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Neste estudo, aprimoramos as capacidades de análise de dados do experimento DARTS, monitorando as mudanças na estabilidade protéica e Estimando a afinidade das interações proteína-ligand. As interações podem ser plotadas em duas curvas: uma curva proteolítica e uma curva de dependência de dose. Nós usamos a interação de mTOR-Rapamycin como um caso exemplar.

Um ensaio de estabilidade de alvo responsivo de afinidade de drogas semiquantitativa (DARTS) para o estudo da interação Rapamycin/mTOR

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

A estabilidade do alvo responsivo da afinidade medicamentosa, DARTS, é um método robusto para detecção de novos alvos proteicos de pequenas moléculas. Pode ser usado para verificar interações conhecidas de proteínas de pequenas moléculas e para encontrar potenciais alvos proteicos para produtos naturais. Neste estudo, melhoramos ainda mais as capacidades de análise de dados do experimento DARTS, monitorando as mudanças na estabilidade proteica e estimando a afinidade das interações proteína-ligante.As interações proteína-ligante podem ser plotadas contra duas curvas, uma curva proteolítica e uma curva de dependência de doses. Usamos a interação mTOR-rapamicina como um caso exemplar para o estabelecimento do nosso protocolo. Cultivar células 293T usando DMEM com soro bovino 10% fetal, glutamina de dois milimônios e antibióticos de 1%.Incubar as culturas a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono. Quando a cultura atingir 80 a 90% de confluência, lave as células duas vezes com PBS frio. Use um raspador de células para coletar as células em uma quantidade apropriada de tampão de lise celular fria e transferir as células de lise para um tubo de 1,5 milímetros.Inverta para misturar bem o tampão de lise e as células de lise e incubar o tubo no gelo por 10 minutos. Centrifugar o tubo a 18.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernante para um novo tubo de 1,5 mililitro e mantenha refrigerado no gelo.Realize o ensaio BCA para aproximar a concentração proteica de lises e calcular a diluição do pronase com base na concentração proteica. Primeiro, transfira o lysate para dois tubos de 1,5 mililitros, 99 microliters cada. Adicione um microliter de solução de estoque de pequenas moléculas a cada alíquota de lisato e incubar os dois tubos por 30 a 60 minutos em temperatura ambiente com agitação.No gelo, estabeleça diluições seriais da solução de pronase recém-descongelada em 1x TNC. Após a incubação com a pequena molécula, divida cada alíquota em 20 microlitrais de amostras em cinco tubos. Para garantir o mesmo tempo de digestão, em intervalos específicos de cada 30 segundos, adicione dois microliters das soluções de pronase preparadas às amostras em conformidade.Para um grupo de controle, adicione dois microliters de buffer TNC. Após cinco a 20 minutos, pare a digestão dos seis tubos através da adição de dois microliters de coquetel inibidor de protease frio de 20x em intervalos de 30 segundos. Misture bem e incubar no gelo por 10 minutos.Diluir cada amostra com seis microliters de 5x tampão de carga SDS-PAGE e ferver as amostras em um banho de água a 70 graus Celsius por 10 minutos. Agora, para executar a mancha ocidental, carregue quantidades iguais de proteína nos poços de um gel de 8%SDS-PAGE, juntamente com um marcador de peso molecular apropriado. Execute o gel por 30 minutos a 80 volts, depois ajuste a tensão para 120 volts e continue funcionando por uma a duas horas.Verifique se a pequena molécula pode se ligar diretamente às proteínas alvo potenciais. Neste protocolo, a incubação com a pequena molécula confirmou a proteção contra a proteólise. Três bandas foram encontradas protegidas por incubação com rapamicina sobre o controle do veículo.A mancha ocidental ilustrou a presença de proteína mTOR em baixas relações pronase/proteína e sua redução e perda com proporções crescentes. A proteólise do mTOR pela pronase foi claramente inibida pela presença de rapamicina e a adição de rapamicina gerou uma mudança óbvia na curva proteolítica. A dose de rapamicina aumentou o nível de mTOR, sugerindo a estabilidade crescente do mTOR com o tratamento da rapamicina.A quantificação das intensidades da banda proteica alvo sugeriu que o mTOR é a proteína alvo da rapamicina. Para obter o melhor efeito stepwise, este experimento pode ter que ser repetido várias vezes para obter uma faixa adequada de pronase sobre as relações proteicas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Bioquímica

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resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

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