Name: a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction
Uploaded: 2019-08-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана NIH научно-исследовательских грантов R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, а также ДОР научно-исследовательский грант W81XWH-16-1-0482.

1. Собирать и лиза клетки
<ol><li>Выращивайте 293T-клетки с помощью модифицированной среды «Орел» (DMEM) с 10% сывороткой крупного рогатого скота, глутамином 2 мМ и 1% антибиотиками. Инкубировать культуры при 37 градусах Цельсия под 5% CO2. ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние роста клеток может повлиять на ?...

<ol>
	<li>Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome:+Evaluation+of+drug+targets+in+clinical+trials+suggests+major+shifts+in+molecular+class+and+indication.">The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).</li><li>O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics.">Chemical genetics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).</li><li>McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+elucidation+of+protein-small+molecule+interactions.">Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (5), 667-673 (2013).</li><li>Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+target+isolation+for+novices:+affinity-based+strategies.">Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (6), 616-623 (2010).</li><li>Sleno, L., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+methods+for+drug+target+discovery.">Proteomic methods for drug target discovery.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).</li><li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li><li>Strickland, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+analysis+of+protein-ligand+binding+interactions+in+complex+biological+mixtures+using+the+stability+of+proteins+from+rates+of+oxidation.">Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation.</a> Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+cancer+drugs+in+living+cells+by+thermal+profiling+of+the+proteome.">Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome.</a> Science. 346 (6205), 1255784 (2014).</li><li>Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+identification+and+validation+of+protein+targets+of+natural+products+without+chemical+modification.">Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).</li><li>Pai, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS)+for+small-molecule+target+identification.">Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification.</a> Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).</li><li>Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+therapeutic+targeting+of+human+cancer+cell+motility.">Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility.</a> Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+autophagy+enhancer+as+a+therapeutic+agent+against+metabolic+syndrome+and+diabetes.">A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).</li><li>Schulte, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+blockade+of+ASCT2-dependent+glutamine+transport+leads+to+antitumor+efficacy+in+preclinical+models.">Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models.</a> Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).</li><li>Skrott, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol-abuse+drug+disulfiram+targets+cancer+via+p97+segregase+adaptor+NPL4.">Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4.</a> Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosidin2+targets+conserved+exocyst+complex+subunit+EXO70+to+inhibit+exocytosis.">Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).</li><li>Chin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolite+alpha-ketoglutarate+extends+lifespan+by+inhibiting+ATP+synthase+and+TOR.">The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR.</a> Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).</li><li>Robinson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+identifies+disulfiram+as+a+potential+therapeutic+for+triple-negative+breast+cancer+cells:+interaction+with+IQ+motif-containing+factors.">High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors.</a> Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).</li><li>Aghajan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+screen+for+enhancers+of+rapamycin+identifies+a+specific+inhibitor+of+an+SCF+family+E3+ubiquitin+ligase.">Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+staining.">Coomassie blue staining.</a> Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).</li><li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+human+immunophilin+FKBP-12+complexes+with+FK506+and+rapamycin.">Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).</li><li>Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+direct+protein+targets+of+small+molecules.">Identification of direct protein targets of small molecules.</a> ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).</li><li>Park, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Multiple+Cryptococcal+Fungicidal+Drug+Targets+by+Combined+Gene+Dosing+and+Drug+Affinity+Responsive+Target+Stability+Screening.">Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+promotes+beta-catenin+citrullination+and+inhibits+Wnt+signaling+in+cancer.">Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).</li></ol>

DARTS позволяет идентифицировать небольшие молекулы целей, используя защитный эффект связывания белка против деградации. DARTS не требует каких-либо химических модификаций или иммобилизации небольшой молекулы26. Это позволяет использовать небольшие молекулы для определения ...

Выявление малых молекул целевых белков имеет важное значение длямеханистического понимания и развития потенциальных терапевтических препаратов 1,2,3. Хроматография сродства, как классический метод определения целевых белков малых молекул, дала хорошие результаты4,5. Однако, этот метод имеет ограничения, в том, что химическая модификация малых молекул часто приводит к снижению или измененной связывания специфичности или сродства. Для преодоления этих ограничений недавно было разработано и применено несколько новых стратегий для выявления малых молекулных целей без химической модификации малых молекул. Эти прямые методы для целевой идентификации этикетки свободных малых молекул включают препарат сродство реагировать целевой стабильности (DARTS)6, стабильность белков от ставок окисления (SPROX)7, клеточный тепловой анализ (CETSA)8 ,9, и теплового протеома профилирования (TPP)10. Эти методы являются весьма выгодными, поскольку они используют природные, неизмененные небольшие молекулы и полагаться только на прямые связывающие взаимодействия, чтобы найти целевые белки11.
Среди этих новых методов, DARTS является сравнительно простой методологии, которая может быть легко принята в большинстве лабораторий12,13. DARTS зависит от концепции, что лиганд-связанных белков продемонстрировать модифицированную восприимчивость к ферментативной деградации по отношению к несвязанных белков. Новый целевой белок может быть обнаружен путем изучения измененной полосы в геле SDS-PAGE с помощью жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Этот подход был успешно реализован для выявления ранее неизвестных целей натуральных продуктов и лекарств14,15,16,17,18, 19. Он также является мощным в качестве средства для проверки или проверки связывания соединений с конкретным белком20,21. В этом исследовании мы представляем улучшение эксперимента путем мониторинга изменений в стабильности белка с небольшими молекулами и выявления белка-лиганд связывания сходства. Мы используем mTOR-rapamycin взаимодействия в качестве примера, чтобы продемонстрировать наш подход.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Dilute to 20X with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>DMEM medium with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>statistical analysis and drawing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Version 1.52</td>
			<td>image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Cell Lysis Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction

Препарат Affinity Responsive Target Stability (DARTS) является надежным методом обнаружения новых малых целей белка молекулы. Он может быть использован для проверки известных небольших молекулно-белковых взаимодействий и для поиска потенциальных целей белка для натуральных продуктов. По сравнению с другими методами, DARTS использует родные, неизмененные, маленькие молекулы и прост и прост в эксплуатации. В этом исследовании мы еще больше расширили возможности анализа данных эксперимента DARTS, отслеживая изменения в стабильности белка и оценивая сродство белково-лигандовых взаимодействий. Взаимодействия белково-лигандов могут быть построены на две кривые: протеолитическая кривая и кривая доза-зависимости. Мы использовали взаимодействие mTOR-rapamycin в качестве образцового аргумента для создания нашего протокола. Из протеолитической кривой мы увидели, что протеолиз mTOR pronase тормозится наличием рапамицина. Кривая доза-зависимость позволила оценить связывающее сродство рапамицина и mTOR. Этот метод, вероятно, будет мощным и простым методом для точного определения новых целевых белков и для оптимизации целевого взаимодействия с наркотиками.

Диаграмма потока эксперимента изложена на рисунке 1. Результат синего окрашивания Coomassie показан на рисунке 2. Инкубация с небольшой молекулой обеспечивает защиту от протеолиза. Три полосы, которые, как представляется, защищены инкубации с рапамицином на?...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction at JoVE.com

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

В этом исследовании мы расширили возможности анализа данных эксперимента DARTS, отслеживая изменения в стабильности белка и оценивая сродство белково-лигандовых взаимодействий. Взаимодействия могут быть построены на две кривые: протеолитическая кривая и кривая доза-зависимости. Мы использовали mTOR-rapamycin взаимодействия в качестве образцового случая.

Полуколичественный препарат affinity Ответственный Целевой стабильности (DARTS) спросить для изучения Rapamycin / mTOR взаимодействия

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Лекарственное сродство реагировать целевой стабильности, DARTS, является надежным методом для обнаружения новых малых молекул белка целей. Он может быть использован для проверки известных взаимодействий мало-молекулы белка и найти потенциальные цели белка для натуральных продуктов. В этом исследовании мы еще больше расширить возможности анализа данных эксперимента DARTS путем мониторинга изменений в стабильности белка и оценки сродства белково-лигандовых взаимодействий.Белково-лигандовые взаимодействия могут быть построены против двух кривых, протеолитической кривой и кривой зависимости от дозы. Мы использовали взаимодействие mTOR-рапамицин в качестве образцового случая для создания нашего протокола. Выращивайте 293T-клетки с помощью DMEM с 10%фетальной сывороткой крупного рогатого скота, двухмилимолянным глутамином и 1%антибиотиками.Инкубировать культуры при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислого газа. Когда культура достигает 80 до 90% слияния, мыть клетки дважды с холодной PBS. Используйте сотовый скребок, чтобы собрать клетки в соответствующее количество холодного буфера лиза клетки и передать лизирование клеток в 1,5-миллиметровую трубку.Инвертировать, чтобы смешать буфер лиза и лизирование клеток хорошо и инкубировать трубку на льду в течение 10 минут. Центрифуга трубки при 18 000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую трубку и держите охлажденным на льду.Выполните анализ BCA, чтобы приблизить концентрацию белка лисатов и рассчитать разбавление проназ на основе концентрации белка. Во-первых, перенесите лизат в две 1,5-миллилитровые трубки по 99 микролитров каждая. Добавьте один микролитер раствора мелкокаликулярного бульона к каждой алициту лизата и инкубировать две трубки в течение 30-60 минут при комнатной температуре при встряхивании.На льду устанавливают серийные разбавления свежеоттая проназного раствора в 1x ТНК. После инкубации с небольшой молекулой, разделить каждый aliquot на 20 микролитров образцов в пяти трубках. Чтобы обеспечить одинаковое время пищеварения, через определенные промежутки времени каждые 30 секунд, добавьте два микролитера подготовленных проназных растворов в образцы соответственно.Для одной контрольной группы добавьте два микролитера буфера ТНК. Через 5-20 минут, остановить переваривание шести труб через добавление двух микролитров холодного 20x ингибитора протеазы коктейль с 30-секундными интервалами. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 10 минут.Разбавить каждый образец шестью микролитров 5x SDS-PAGE загрузки буфера и варить образцы в водяной бане при 70 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Теперь, для выполнения западной помарки, загрузите равное количество белка в скважины геля 8%SDS-PAGE, а также соответствующий молекулярный маркер веса. Запустите гель в течение 30 минут на 80 вольт, затем отрегулируйте напряжение до 120 вольт и продолжайте работать в течение одного-двух часов.Убедитесь, что небольшая молекула может связываться непосредственно с потенциальными белками-мишенями. В этом протоколе инкубация с небольшой молекулой подтвердила защиту от протеолиза. Было установлено, что три группы защищены инкубацией рапамицином для управления транспортным средством.Западные blotting проиллюстрировали при наличии белка mTOR при низких соотношениях проназ к белку и его уменьшение и потерю с увеличением соотношения. Протеолиз mTOR проназой был явно ингибируется наличием рапамицина и добавление рапамицина вызвало очевидный сдвиг в протеолитической кривой. Доза рапамицина зависит от повышения уровня mTOR, что свидетельствует о повышении устойчивости mTOR с лечением рапамицином.Количественная оценка интенсивности целевой белковой полосы свидетельствует о том, что mTOR является целевым белком рапамицина. Для того, чтобы получить лучший эффект шаг за шагом, этот эксперимент, возможно, придется повторить несколько раз, чтобы получить подходящий диапазон проназа над соотношением белка.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Дифференциальная сканирующая калориметрия - метод оценки термической устойчивости и конформации белка антигена

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

G-квадруплекс ДНК-сродства подход для очистки ферментативно активной G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Простая, прочная и высокая пропускная способность одной молекулы потока растяжения Assay осуществления для изучения транспорт молекул вдоль ДНК

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Полуавтоматическая Biopanning бактериальной отображения библиотек пептид сродство реагент обнаружения и анализа результате изолятов

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Модифицированная дрожжевая гибридная система для исследований комплексных ДНК-гетерогенных белков

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop иммобилизованных металла аффинной хроматографии, воссоздание и меткой, Assay Polyhistidine Metalloenzyme для студентов лаборатории

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Родная клеточная мембрана наночастицы системы membrane белка-белкового взаимодействия анализа

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...