Name: a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction
Uploaded: 2019-08-27T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado en parte por las becas de investigación DE NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, y una beca de investigación del Departamento de Defensa W81XWH-16-1-0482.

1. Recoger y lijar células
<ol><li>Cultivar células 293T usando el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal, 2 mM de glutamina y 1% de antibióticos. Incubar cultivos a 37oCpor debajo del 5% de CO 2. NOTA: El estado de crecimiento de las celdas puede afectar a la estabilidad de los experimentos posteriores.</li>
	<li>Amplíe las celdas en el cultivo hasta que alcancen la confluencia del 80-u201290%.</li>
	<li>Mezclar 345 ml de reactivo de lisis celular (ver la Ta...

<ol>
	<li>Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome:+Evaluation+of+drug+targets+in+clinical+trials+suggests+major+shifts+in+molecular+class+and+indication.">The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).</li><li>O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+analysis+of+protein-ligand+binding+interactions+in+complex+biological+mixtures+using+the+stability+of+proteins+from+rates+of+oxidation.">Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation.</a> Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+cancer+drugs+in+living+cells+by+thermal+profiling+of+the+proteome.">Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome.</a> Science. 346 (6205), 1255784 (2014).</li><li>Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+identification+and+validation+of+protein+targets+of+natural+products+without+chemical+modification.">Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).</li><li>Pai, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS)+for+small-molecule+target+identification.">Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification.</a> Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).</li><li>Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+therapeutic+targeting+of+human+cancer+cell+motility.">Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility.</a> Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+autophagy+enhancer+as+a+therapeutic+agent+against+metabolic+syndrome+and+diabetes.">A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).</li><li>Schulte, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+blockade+of+ASCT2-dependent+glutamine+transport+leads+to+antitumor+efficacy+in+preclinical+models.">Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models.</a> Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).</li><li>Skrott, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol-abuse+drug+disulfiram+targets+cancer+via+p97+segregase+adaptor+NPL4.">Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4.</a> Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosidin2+targets+conserved+exocyst+complex+subunit+EXO70+to+inhibit+exocytosis.">Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).</li><li>Chin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolite+alpha-ketoglutarate+extends+lifespan+by+inhibiting+ATP+synthase+and+TOR.">The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR.</a> Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).</li><li>Robinson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+identifies+disulfiram+as+a+potential+therapeutic+for+triple-negative+breast+cancer+cells:+interaction+with+IQ+motif-containing+factors.">High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors.</a> Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).</li><li>Aghajan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+screen+for+enhancers+of+rapamycin+identifies+a+specific+inhibitor+of+an+SCF+family+E3+ubiquitin+ligase.">Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+staining.">Coomassie blue staining.</a> Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).</li><li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+human+immunophilin+FKBP-12+complexes+with+FK506+and+rapamycin.">Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).</li><li>Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+direct+protein+targets+of+small+molecules.">Identification of direct protein targets of small molecules.</a> ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).</li><li>Park, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Multiple+Cryptococcal+Fungicidal+Drug+Targets+by+Combined+Gene+Dosing+and+Drug+Affinity+Responsive+Target+Stability+Screening.">Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+promotes+beta-catenin+citrullination+and+inhibits+Wnt+signaling+in+cancer.">Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).</li></ol>

DARTS permite la identificación de pequeñas dianas de moléculas explotando el efecto protector de la unión a proteínas contra la degradación. DARTS no requiere ninguna modificación química o inmovilización de la molécula pequeña26. Esto permite utilizar moléculas pequeñas para determinar sus objetivos de proteína de unión directa. Los criterios de evaluación estándar para el método Clásico DARTS incluyen la tinción de gel, espectrometría de masas y la hincha occidental<sup cla...

La identificación de proteínas diana de moléculas pequeñas es esencial para la comprensión mecanicista y el desarrollo de fármacos terapéuticos potenciales1,2,3. La cromatografía de afinidad, como método clásico para identificar las proteínas diana de moléculas pequeñas, ha dado buenos resultados4,5. Sin embargo, este método tiene limitaciones, en que la modificación química de moléculas pequeñas a menudo resulta en una especificidad o afinidad de unión reducida o alterada. Para superar estas limitaciones, recientemente se han desarrollado y aplicado varias estrategias nuevas para identificar los objetivos de moléculas pequeñas sin modificación química de las moléculas pequeñas. Estos métodos directos para la identificación diana de moléculas pequeñas sin etiquetas incluyen la estabilidad objetivo sensible a la afinidad de los fármacos (DARTS)6, la estabilidad de las proteínas a partir de las tasas de oxidación (SPROX)7, el ensayo de cambio térmico celular (CETSA)8 ,9, y perfilado de proteome térmico (TPP)10. Estos métodos son muy ventajosos porque utilizan moléculas pequeñas naturales y no modificadas y dependen únicamente de interacciones de unión directa para encontrar proteínas objetivo11.
Entre estos nuevos métodos, DARTS es una metodología comparativamente simple que puede ser fácilmente adoptada por la mayoría de los laboratorios12,13. DARTS depende del concepto de que las proteínas ligadas a ligando de ligando demuestran la susceptibilidad modificada a la degradación enzimática en relación con las proteínas no unidas. La nueva proteína diana se puede detectar mediante el examen de la banda alterada en gel SDS-PAGE a través de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS/MS). Este enfoque se ha implementado con éxito para la identificación de objetivos previamente desconocidos de productos naturales y medicamentos14,15,16,17,18, 19. También es potente como medio para detectar o validar la unión de compuestos a una proteína específica20,21. En este estudio, presentamos una mejora en el experimento mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de proteínas con moléculas pequeñas y la identificación de afinidades de unión proteína-ligand. Utilizamos la interacción mTOR- rapamicina como ejemplo para demostrar nuestro enfoque.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Dilute to 20X with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>DMEM medium with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>statistical analysis and drawing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Version 1.52</td>
			<td>image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Cell Lysis Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction

La estabilidad de objetivos sensibles a la afinidad de fármacos (DARTS) es un método robusto para la detección de nuevos objetivos de proteínas de moléculas pequeñas. Se puede utilizar para verificar las interacciones molécula-proteína seres(as) conocidas y para encontrar posibles dianas proteicas para productos naturales. En comparación con otros métodos, DARTS utiliza moléculas nativas, no modificadas, pequeñas y es simple y fácil de operar. En este estudio, mejoramos aún más las capacidades de análisis de datos del experimento DARTS mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de las proteínas y la estimación de la afinidad de las interacciones proteína-ligand. Las interacciones proteína-ligand se pueden trazar en dos curvas: una curva proteolítica y una curva de dependencia de dosis. Hemos utilizado la interacción mTOR-rapamicina como un caso ejemplar para el establecimiento de nuestro protocolo. De la curva proteolítica vimos que la proteólisis de mTOR por pronasa fue inhibida por la presencia de rapamicina. La curva de dependencia de dosis nos permitió estimar la afinidad vinculante de rapamicina y mTOR. Es probable que este método sea un método potente y sencillo para identificar con precisión nuevas proteínas diana y para la optimización de la participación objetivo de fármacos.

El diagrama de flujo del experimento se describe en la Figura1. El resultado de la tinción azul de Coomassie se muestra en la Figura2. La incubación con la molécula pequeña confiere protección contra la proteólisis. Se encuentran tres bandas que parecen estar protegidas por la incubación con rapamicina sobre el control del vehículo. Los resultados esperados del experimento de curva proteolítica se muestran en la Figura3. Co...

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A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

En este estudio, mejoramos las capacidades de análisis de datos del experimento DARTS mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de las proteínas y la estimación de la afinidad de las interacciones proteína-ligand. Las interacciones se pueden trazar en dos curvas: una curva proteolítica y una curva de dependencia de dosis. Hemos utilizado la interacción mTOR-rapamicina como un caso ejemplar.

Un ensayo semicuantitativo de estabilidad de objetivos sensibles a la afinidad de drogas (DARTS, por sus) para estudiar la interacción con Rapamicina/mTOR

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

La estabilidad del objetivo sensible a la afinidad de fármacos, DARTS, es un método robusto para la detección de nuevos objetivos de proteínas de moléculas pequeñas. Se puede utilizar para verificar las interacciones conocidas de proteínas de molécula pequeña y para encontrar posibles dianas proteicas para productos naturales. En este estudio, mejoramos aún más las capacidades de análisis de datos del experimento DARTS mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de las proteínas y la estimación de la afinidad de las interacciones proteína-ligand.Las interacciones proteína-ligand se pueden trazar contra dos curvas, una curva proteolítica y una curva de dosis-dependencia. Hemos utilizado la interacción mTOR-rapamicina como un caso ejemplar para el establecimiento de nuestro protocolo. Cultivar células 293T usando DMEM con 10%suero bovino fetal, glutamina de dos milivolares y 1%antibióticos.Incubar los cultivos a 37 grados centígrados por debajo del 5% de dióxido de carbono. Cuando el cultivo alcance entre el 80 y el 90% de confluencia, lave las células dos veces con PBS frío. Utilice un rascador de celdas para recoger las células en una cantidad adecuada de búfer de lelisis de celda fría y transferir las celdas de la lesión a un tubo de 1,5 milímetros.Invertir para mezclar bien el tampón de la lesis y las células de lesing e incubar el tubo sobre hielo durante 10 minutos. Centrifugar el tubo a 18.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y manténgalo frío sobre hielo.Realizar el ensayo de BCA para aproximar la concentración proteica de los licatos y calcular la dilución de la pronasa en función de la concentración de proteínas. Primero, transfiera el izado a dos tubos de 1,5 mililitros, 99 microlitros cada uno. Añadir un microlitro de solución de stock de moléculas pequeñas a cada alícuota de izado e incubar los dos tubos durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente con agitación.En hielo, establezca diluciones en serie de solución de pronasa recién descongelada en 1x TNC. Después de la incubación con la molécula pequeña, divida cada alícuota en 20 microlitros de muestras en cinco tubos. Para garantizar el mismo tiempo de digestión, a intervalos específicos de cada 30 segundos, añada dos microlitros de las soluciones de pronasa preparadas a las muestras en consecuencia.Para un grupo de control, agregue dos microlitros de búfer TNC. Después de cinco a 20 minutos, detenga la digestión de los seis tubos mediante la adición de dos microlitros de cóctel inhibidor de la proteasa fría 20x a intervalos de 30 segundos. Mezclar bien e incubar sobre hielo durante 10 minutos.Diluir cada muestra con seis microlitros de 5x tampón de carga SDS-PAGE y hervir las muestras en un baño de agua a 70 grados Celsius durante 10 minutos. Ahora, para realizar Western blot, cargue cantidades iguales de proteína en los pozos de un gel 8%SDS-PAGE, junto con un marcador de peso molecular adecuado. Ejecute el gel durante 30 minutos a 80 voltios, luego ajuste la tensión a 120 voltios y continúe funcionando durante una o dos horas.Verifique que la molécula pequeña pueda unirse directamente a las proteínas objetivo potenciales. En este protocolo, la incubación con la molécula pequeña confirmó la protección contra la proteólisis. Se encontró que tres bandas estaban protegidas por incubación con rapamicina sobre el control de vehículos.La hinchazón occidental ilustró la presencia de proteína mTOR a baja pronase a proporciones proteicas y su reducción y pérdida con proporciones crecientes. La proteólisis de mTOR por pronase se inhibió claramente por la presencia de rapamicina y la adición de rapamicina generó un cambio evidente en la curva proteolítica. La rapamicina dependiente de la dosis mejoró el nivel de mTOR, lo que sugiere la creciente estabilidad de mTOR con tratamiento con rapamicina.La cuantificación de las intensidades de la banda de proteína objetivo sugirió que mTOR es la proteína diana de la rapamicina. Con el fin de obtener el mejor efecto escalonado, este experimento puede tener que repetirse varias veces para obtener una gama adecuada de pronasa sobre las proporciones de proteínas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Investigación

Bioquímica

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Calorimetría diferencial de barrido - un método para evaluar la estabilidad térmica y la conformación del antígeno proteico

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Un enfoque ADN afinidad G-cuádruplex para la purificación de enzimáticamente activa G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Una sola molécula Simple, robusto y alto rendimiento flujo estiramiento aplicación de análisis para el estudio de transporte de moléculas a lo largo de la DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning semi-automatizado de bibliotecas de exhibición bacteriana péptido afinidad reactivo descubrimiento y análisis de los aislamientos que

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Un sistema híbrido modificado de levadura-uno para estudios de interacción de ADN complejo-proteína heterotérica

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Banco inmovilizado cromatografía de afinidad metálica, reconstitución y ensayo de un Polyhistidine etiquetada metaloenzima para el laboratorio pregrado

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análisis de interacción proteína-proteína de membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...