Name: a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction
Uploaded: 2019-08-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction at JoVE.com

Bu çalışma kısmen NIH araştırma hibe R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484 ve DOD araştırma hibe W81XWH-16-16-0482 tarafından desteklenmiştir.

1. Hücreleri toplama ve düzenlil
<ol><li>% 10 fetal sığır serumu, 2 mM glutamin ve% 1 antibiyotik ile Dulbecco modifiye Eagle orta (DMEM) kullanarak 293T hücreleri büyümek. 37 °C'de %5 CO2'nin altında kuluçka kültürleri . NOT: Hücrelerin büyüme durumu sonraki deneylerin kararlılığını etkileyebilir.</li>
	<li>80\u201290% biraraya ulaşana kadar kültür hücreleri genişletin.</li>
	<li>345 μL hücre lisis reaktifini (Malzeme Tablosunabakın) 25 μL 20x proteaz inhibi...

<ol>
	<li>Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+druggable+genome:+Evaluation+of+drug+targets+in+clinical+trials+suggests+major+shifts+in+molecular+class+and+indication.">The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).</li><li>O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics.">Chemical genetics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).</li><li>McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+elucidation+of+protein-small+molecule+interactions.">Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (5), 667-673 (2013).</li><li>Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+target+isolation+for+novices:+affinity-based+strategies.">Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 17 (6), 616-623 (2010).</li><li>Sleno, L., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+methods+for+drug+target+discovery.">Proteomic methods for drug target discovery.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).</li><li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li><li>Strickland, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+analysis+of+protein-ligand+binding+interactions+in+complex+biological+mixtures+using+the+stability+of+proteins+from+rates+of+oxidation.">Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation.</a> Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).</li><li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells.">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+cancer+drugs+in+living+cells+by+thermal+profiling+of+the+proteome.">Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome.</a> Science. 346 (6205), 1255784 (2014).</li><li>Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+identification+and+validation+of+protein+targets+of+natural+products+without+chemical+modification.">Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).</li><li>Pai, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS)+for+small-molecule+target+identification.">Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification.</a> Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).</li><li>Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+therapeutic+targeting+of+human+cancer+cell+motility.">Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility.</a> Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+autophagy+enhancer+as+a+therapeutic+agent+against+metabolic+syndrome+and+diabetes.">A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).</li><li>Schulte, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+blockade+of+ASCT2-dependent+glutamine+transport+leads+to+antitumor+efficacy+in+preclinical+models.">Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models.</a> Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).</li><li>Skrott, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol-abuse+drug+disulfiram+targets+cancer+via+p97+segregase+adaptor+NPL4.">Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4.</a> Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosidin2+targets+conserved+exocyst+complex+subunit+EXO70+to+inhibit+exocytosis.">Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).</li><li>Chin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolite+alpha-ketoglutarate+extends+lifespan+by+inhibiting+ATP+synthase+and+TOR.">The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR.</a> Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).</li><li>Robinson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+identifies+disulfiram+as+a+potential+therapeutic+for+triple-negative+breast+cancer+cells:+interaction+with+IQ+motif-containing+factors.">High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors.</a> Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).</li><li>Aghajan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetics+screen+for+enhancers+of+rapamycin+identifies+a+specific+inhibitor+of+an+SCF+family+E3+ubiquitin+ligase.">Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+blue+staining.">Coomassie blue staining.</a> Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).</li><li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li><li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li><li>Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+human+immunophilin+FKBP-12+complexes+with+FK506+and+rapamycin.">Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).</li><li>Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+direct+protein+targets+of+small+molecules.">Identification of direct protein targets of small molecules.</a> ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).</li><li>Park, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Multiple+Cryptococcal+Fungicidal+Drug+Targets+by+Combined+Gene+Dosing+and+Drug+Affinity+Responsive+Target+Stability+Screening.">Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li><li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+promotes+beta-catenin+citrullination+and+inhibits+Wnt+signaling+in+cancer.">Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).</li></ol>

DARTS, protein bağlamanın bozulmaya karşı koruyucu etkisinden yararlanarak küçük molekül hedeflerinin belirlenmesini sağlar. DARTS herhangi bir kimyasal modifikasyon veya küçük molekül26immobilizasyon gerektirmez. Bu küçük moleküllerin doğrudan bağlayıcı protein hedeflerini belirlemek için kullanılmasını sağlar. Klasik DARTS yöntemi için standart değerlendirme kriterleri jel boyama, kütle spektrometresi ve batı leke12,13içerir.<sup...

Küçük molekül hedef proteinlerin belirlenmesi mekanistik anlayış ve potansiyel terapötik ilaçların gelişimi için gereklidir1,2,3. Affinity kromatografisi, küçük moleküllerin hedef proteinlerini tanımlamak için klasik bir yöntem olarak, iyi sonuçlar vermiştir4,5. Ancak, bu yöntem, küçük moleküllerin kimyasal modifikasyongenellikle azaltılmış veya değiştirilmiş bağlayıcı özgüllük veya yakınlık ile sonuçlanır, sınırlamalar vardır. Bu sınırlamaları aşmak için, son zamanlarda küçük moleküllerin kimyasal modifikasyonu olmadan küçük molekül hedeflerini belirlemek için çeşitli yeni stratejiler geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Etiketsiz küçük moleküllerin hedef tanımlaması için bu doğrudan yöntemler arasında ilaç afiniteduyarlı hedef stabilitesi (DARTS)6, oksidasyon oranlarından proteinlerin stabilitesi (SPROX)7, hücresel termal değişim töz (CETSA)8 ,9, ve termal proteom profilleme (TPP)10. Doğal, değiştirilmemiş küçük moleküller kullandıkları ve hedef proteinleri bulmak için sadece doğrudan bağlayıcıetkileşimlere güvendikleri için bu yöntemler son derece avantajlıdır 11.
Bu yeni yöntemler arasında, DARTS kolayca en laboratuvarları12,13tarafından kabul edilebilir nispeten basit bir metodolojidir. DARTS, ligand bağlı proteinlerin bağlanmamış proteinlere göre enzimatik bozulmaya karşı modifiye duyarlılığı gösterdiği kavramına bağlıdır. Yeni hedef protein sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile SDS-PAGE jelindeki değiştirilmiş bandın incelenmesi ile saptanabilir. Bu yaklaşım başarıyla doğal ürün ve ilaçların daha önce bilinmeyen hedeflerinin belirlenmesi için uygulanmıştır14,15,16,17,18, 19. Aynı zamanda belirli bir protein20,21bileşiklerin bağlayıcı doğrulamak veya ekrana bir araç olarak güçlüdür. Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri küçük moleküllerle izleyerek ve protein-ligand bağlayıcı afiyetleri tanımlayarak deneyde bir iyileşme sayılmayı savuruyoruz. Yaklaşımımızı göstermek için mTOR-rapamycin etkileşimini örnek olarak kullanıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Dilute to 20X with ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>DMEM medium with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>179693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td>statistical analysis and drawing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Version 1.52</td>
			<td>image processing and analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Cell Lysis Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>78501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>R21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>PRON-RO</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyrophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust to pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-quantitative drug affinity responsive target stability (darts) assay for studying rapamycin/mtor interaction

İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS) yeni küçük molekül protein hedeflerinin tespiti için sağlam bir yöntemdir. Bilinen küçük molekül-protein etkileşimlerini doğrulamak ve doğal ürünler için potansiyel protein hedeflerini bulmak için kullanılabilir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, DARTS yerli, değiştirilmemiş, küçük moleküller kullanır ve basit ve kullanımı kolaydır. Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri izleyerek ve protein-ligand etkileşimlerinin yakınlığını tahmin ederek DARTS deneyinin veri analizi yeteneklerini daha da geliştirtik. Protein-ligand etkileşimleri iki eğriye dönüştürülebilir: proteolitik eğri ve doz bağımlılığı eğrisi. MTOR-rapamisin etkileşimini protokolümüzün kurulması için örnek bir örnek olarak kullandık. Proteolitik eğriden pronase tarafından mTOR proteozisinin rapamisin varlığı ile inhibe edildiğini gördük. Doz bağımlılığı eğrisi bize rapamisin ve mTOR bağlayıcı yakınlık tahmin etmek için izin verdi. Bu yöntem, yeni hedef proteinlerin doğru bir şekilde tanımlanması ve uyuşturucu hedef etkileşiminin optimizasyonu için güçlü ve basit bir yöntem olması muhtemeldir.

Deneyin akış şeması Şekil1'de özetlenmiştir. Coomassie mavi boyama sonucu Şekil2'de gösterilmiştir. Küçük molekül ile kuluçka proteoziz karşı koruma sağlar. Araç kontrolü üzerinde rapamisin ile kuluçka ile korunuyor gibi görünen üç bant bulunur. Proteolitik eğri deneyinden beklenen sonuçlar Şekil3'te gösterilmiştir. Bir kanıtı olarak, biz iyi çalışılmış protein mTOR, hangi ilaç rapamycin<sup c...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction at JoVE.com

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability DARTS assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri izleyerek ve protein-ligand etkileşimlerinin yakınlığını tahmin ederek DARTS deneyinin veri analizi yeteneklerini geliştirdik. Etkileşimler iki eğriye çizilebilir: proteolitik eğri ve doz bağımlılığı eğrisi. MTOR-rapamisin etkileşimini örnek bir vaka olarak kullandık.

Rapamisin/mTOR etkileşimini incelemek için Yarı Kantitatif İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS)

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

İlaç afinite duyarlı hedef kararlılık, DARTS, yeni küçük moleküllü protein hedeflerinin tespiti için sağlam bir yöntemdir. Bilinen küçük moleküllü protein etkileşimlerini doğrulamak ve doğal ürünler için potansiyel protein hedeflerini bulmak için kullanılabilir. Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri izleyerek ve protein-ligand etkileşimlerinin yakınlığını tahmin ederek DARTS deneyinin veri analizi yeteneklerini daha da geliştiriyoruz.Protein-ligand etkileşimleri iki eğri, bir proteolitik eğri ve doz bağımlılığı eğrisi karşı çizilebilir. MTOR-rapamycin etkileşimini protokolümüzün kurulması için örnek bir örnek olarak kullandık. %10 fetal sığır serumu, iki milimolar glutamin ve %1 antibiyotik içeren DMEM kullanarak 293T hücreleri büyütün.Kültürleri %5 karbondioksit insantininin 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kültür %80-90'lık birleştiğinde hücreleri soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri uygun miktarda soğuk hücre lisis tamponuna toplamak ve lysing hücrelerini 1,5 milimetrelik bir tüpe aktarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.Lysis tamponve lysing hücreleri iyice karıştırmak ve 10 dakika boyunca buz üzerinde tüp kuluçka ters. Tüpü 18,000 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Supernatant'ı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve buzüzerinde soğutulun.Lysatların protein konsantrasyonu yaklaşık bca test gerçekleştirmek ve protein konsantrasyonu dayalı pronase seyreltme hesaplamak. İlk olarak, iki 1.5 mililitrelik tüpler, 99 mikrolitre her içine lysate aktarın. Lysate her aliquot için küçük moleküllü stok çözeltisi bir mikrolitre ekleyin ve sallayarak oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca iki tüp kuluçka.Buz üzerinde, 1x TNC taze çözülmüş pronase çözeltisi seri seyreltme kurmak. Küçük molekül ile kuluçka sonra, beş tüpler halinde örneklerin 20 mikrolitre içine her aliquot bölün. Aynı sindirim süresini sağlamak için, her 30 saniyede bir belirli aralıklarla, numunelere hazırlanan pronase çözeltilerinin iki mikrolitresini ekleyin.Bir kontrol grubu için, Iki mikrolitre TNC arabelleği ekleyin. Beş ila 20 dakika sonra, 30 saniyelik aralıklarla soğuk 20x proteaz inhibitör kokteyl iki mikrolitre ilave yoluyla altı tüplerin sindirim durdurmak. İyibir şekilde karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.Her numuneyi altı mikrolitre 5x SDS-PAGE yükleme tamponu ile seyreltin ve numuneleri 70 derecede 10 dakika kaynatın. Şimdi, Batı leke gerçekleştirmek için, uygun bir moleküler ağırlık belirteci ile birlikte, bir % 8 SDS-PAGE jel kuyularına protein eşit miktarda yükleyin. 80 volt 30 dakika jel çalıştırın, sonra 120 volt volta voltaj ı ayarlayın ve bir ila iki saat boyunca çalışmaya devam edin.Küçük molekülün potansiyel hedef proteinlere doğrudan bağlanabilen ivedu. Bu protokolde, küçük molekül ile kuluçka proteoziz karşı koruma doğruladı. Üç bant araç kontrolü üzerinde rapamisin ile kuluçka ile korunduğu tespit edilebildi.Batı lekeleme, düşük pronase ile protein oranlarında mTOR proteininin varlığını ve artan oranlarda azalma ve kaybını göstermiştir. Pronase tarafından mTOR proteolisisi açıkça rapamisin varlığı ile inhibe edildi ve rapamisin eklenmesi proteolitik eğribelirgin bir kayma üretti. Rapamisin doz-bağımlı mTOR düzeyini artırdı, rapamisin tedavisi ile mTOR artan istikrar düşündüren.Hedef protein bandı yoğunluklarının ölçülmesi mTOR'un rapamisinin hedef proteini olduğunu göstermiştir. En iyi stepwise etkisi elde etmek için, bu deney protein oranları üzerinde pronase uygun bir dizi elde etmek için birkaç kez tekraredilmesi gerekebilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential Scanning Calorimetry ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli.

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...