Name: photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells
Uploaded: 2019-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81571719 و 81661168014 و 81673014 و 81870055) ولجنة العلوم والتكنولوجيا البلدية في شنغهاي (18QA1402300 و16XD1403100)، والخطة الوطنية البحث والتطوير الرئيسية (2017YFA0104600).

تحذير: </</c0> ويشمل البروتوكول الوارد أدناه استخدام ليزر فيمتوثانية من تقرير الجرد الوطني والمواد الكيميائية السامة. يرجى الانتباه إلى جميع الأضرار المحتملة الناجمة عن إجراءات التجربة. يرجى قراءة صحائف بيانات السلامة لجميع المواد الكيميائية ذات الصلة أو غيرها من المواد قبل الاستخدام...

<ol>
	<li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-signalling+dynamics+in+time+and+space.">Cell-signalling dynamics in time and space.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).</li><li>Scott, J. D., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+in+space+and+time:+where+proteins+come+together+and+when+they&#8217;re+apart.">Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they&#8217;re apart.</a> Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience.">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states.">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li><li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras/Erk+module.">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).</li><li>Steinbeck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+enables+functional+analysis+of+human+embryonic+stem+cell&#8211;derived+grafts+in+a+Parkinson's+disease+model.">Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell&#8211;derived grafts in a Parkinson's disease model.</a> Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Hoover, E. E., Squier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multiphoton+microscopy+technology.">Advances in multiphoton microscopy technology.</a> Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).</li><li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432 (7019), 822 (2004).</li><li>Tirlapur, U. K., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+targeted+transfection+by+femtosecond+laser.">Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser.</a> Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).</li><li>Shen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mechanics &amp; chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cellular-resolution+optical+perturbation+and+imaging+of+place+cell+firing+fields.">Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields.</a> Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+cellular+light+from+green+fluorescent+protein+by+a+femtosecond+laser.">Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser.</a> Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).</li><li>Smith, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+of+two+types+of+Ca2++waves+in+rat+pheochromocytoma+PC12+cells+by+ultrashort+pulsed+near-infrared+laser+irradiation.">Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation.</a> Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).</li><li>Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+signaling+in+response+to+photostimulation+with+a+femtosecond+laser.">Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser.</a> Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+across+gaps+in+non-excitable+cells+induced+by+femtosecond+laser+exposure.">Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+regulation+of+gene+expression+in+targeted+cells.">All-optical regulation of gene expression in targeted cells.</a> Scientific reports. 4, 5346 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+Extracellular-Signal-Regulated+Kinase+Signaling+in+Target+Cells+by+Femtosecond+Laser.">Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser.</a> Laser &amp; Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).</li><li>Yan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+generation+of+reactive+oxygen+species+by+femtosecond-laser+irradiation.">Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation.</a> Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Shi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+swelling+and+restorable+fragmentation+stimulated+by+femtosecond+laser.">Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser.</a> Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).</li><li>Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duration,+magnitude+and+compartmentalization+of+ERK+MAP+kinase+activity:+mechanisms+for+providing+signaling+specificity.">The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity.</a> Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+in+single+mitochondria.">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134 (2), 279-290 (2008).</li><li>Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Flashes:+Elemental+Signaling+Events+in+Eukaryotic+Cells.">Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells.</a> Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).</li><li>Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+flashes:+new+insights+into+mitochondrial+ROS+signalling+and+beyond.">Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond.</a> The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).</li><li>Wang, S., Hu, M., He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+mitoflash+excited+by+femtosecond+laser.">Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser.</a> Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).</li></ol>

نقوم بإظهار استراتيجية تحفيز الصور من خلال الجمع بين ليزر femtosecond مع نظام المجهر البؤري المسح الضوئي بالليزر. يمكن أن يعمل التحفيز الضوئي مباشرة كنسخة مجهرية بفوتونين من خلال تعريف Stim-B وفقًا لذلك. نحن نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام ومضة قصيرة من الليزر femtosecond لتحريك إشارات ERK أو mitoflashes في الخل?...

تكنولوجيا السيطرة على جزيئات الإشارات الخلوية هي جزء مهم من تطور علوم الحياة. تقليديا، الطريقة الأكثر شيوعا هو العلاج البيوكيميائيبواسطة الأدوية أو المواد البيولوجية 1،2،3. على مدى العقد الماضي، اختراع علم الوراثة البصرية يفتح حقبة جديدة لتعديل الإشارات الجزيئية الخلوية. الانسياق مع البروتينات الحساسة الخفيفة عن طريق هندسة الجينات يجعل الضوء يصبح أداة قوية لتعديل مختلف أنشطة البروتين في الخلية المستهدفة. وقد حققت هذه التكنولوجيا تقدما مشجعا مثل الإثارة وتثبيط الإشارة العصبية، وتعزيز التعبير الجيني، والتلاعب أنماط الإشارات الخلوية، مما يؤدي إلى مصائر الخلايا المختلفة والتحقيق المرضي4،5 ،6،7،8،9. ومع ذلك، يمكن للضوء أن يعمل فقط عن طريق نقل الخلايا مع البروتينات البصرية. في المرحلة الحالية، هناك طرق نادرة تمكن الضوء من السيطرة على الجزيئات الخلوية مباشرة إلى جانب علم الوراثة البصرية.
الليزر Femtosecond وقد البحوث البيولوجية المتقدمة من خلال توفير كفاءة الإثارة متعددة الفوتون مع الحفاظ على سلامة بيولوجية جيدة. من خلال نشر استراتيجيات معالجة الصور المتنوعة، حققت العديد من الإنجازات مثل الفحص المجهري متعدد الفوتونات، والجراحة الدقيقة والتطبيقات الوراثية البصرية متعددة الفوتون اتّبع10،11،12،13 ،14،15،16. وتظهر التحقيقات الأخيرة أن تحفيز الليزر femtosecond قد ثبت كطريقة بصرية عالية الكفاءة للحث مباشرة على أحداث الإشارات الجزيئية. وقد وجد أن الأشعة الليزر ية فيمتوثانية شديدة التركيز على الشبكية الإندوبلازما (ER) قادرة على استنفاد الكالسيوم في ER وتنشيط قنوات الكالسيوم المنشطة من الكالسيوم (CRAC) لتشكيل إشارات الكالسيوم في الخلايا17. يمكن أن تنتشر إشارة الكالسيوم هذه المنشطة بالصورة بين أنواع متعددة من الخلايا18،19،20. وعلاوة على ذلك، فإنه لديه أيضا القدرة على تنشيط مسارات إشارة الخلية مثل العامل النووي للخلايا T المنشطة (NFAT) وERK إشارة المسار21،22. من خلال ضبط كثافة وتوطين التعرض بالليزر femtosecond في الخلايا، على سبيل المثال، مع التركيز على الليزر على الميتوكوندريا، فإنه يمكن أن تؤثر على مورفولوجيا الميتوكوندريا والأحداث الجزيئية23،24، 25.على وجه التحديد، يمكن أن تكون متحمسة رشقات نارية من توليد ROS الميتوكوندريا عن طريق التحفيز الضوئي، والذي هو لاحظ ومضات الفلورسنت في الميتوكوندريا (ميتوفلاشز).
وبالتالي، فإن تكنولوجيا التحفيز الضوئي ذات إمكانات جيدة يمكن تطبيقها على نطاق واسع في البحوث البيولوجية ذات الصلة. بل هو أيضا فرصة جيدة لتوسيع تطبيقات الليزر femtosecond في السيطرة على جزيئات الإشارات الخلوية والوظائف إلى جانب الفحص المجهري. هنا، ونحن نقدم التفاصيل التقنية لتحفيز الصور. يتم تحقيق التحفيز الضوئي عن طريق ربط ليزر femtosecond إلى مجهر البؤري لتوفير خلية هدف واحد مع التحفيز الضوئي فلاش قصيرة. فإنه يمكن بدء كفاءة ويمكن التحكم فيها تفعيل ERK في الخلية. إذا كان التحفيز الضوئي يقع على بنية أنبوبي الميتوكوندريا، يمكن التحكم في إمكانات غشاء الميتوكوندريا، مورفولوجيا، ROS، والمسام الانتقالية نفاذية، عن طريق التحفيز الضوئي. بناء على هذا المخطط تحفيز الصور، ونحن نقدم طريقة مفصلة لتنشيط ERK مسار الإشارات والتأثير على أحداث الميتوكوندريا متعددة في خلايا هيلا. يوضح هذا البروتوكول عملية تقديم تحفيز الليزر فيمتوثانية في الخلايا المستهدفة.
يتم إنشاء نظام التحفيز الضوئي على المجهر البؤري مع اقتران الليزر femtosecond في ذلك للتحفيز في وقت واحد والفحص المجهري المستمر. الليزر femtosecond (الطول الموجي: 1040 نانومتر، معدل التكرار: 50 ميغاهيرتز، عرض النبض: 120 fs، أقصى قدرة متوسط الناتج: 1 W) ينقسم إلى شعاعين قبل اقتران. واحد يتم توجيهها من خلال تلسكوب التتابع تتكون من زوج من العدسات. ثم ينعكس مباشرة في الفتحة الخلفية لهدف (60x, N.A. = 1.2, غمر المياه) لتشكيل التركيز الحد الانعراج (Stim-A). وينعكس الآخر إلى المسار البصري المسح الضوئي من المجهر البؤري للعمل كوضع المسح الضوئي اثنين فوتون (Stim-B). Stim-A يقدم نقطة تركيز ثابتة في وسط مجال الرؤية (FOV). Stim-B هي منطقة مسح بؤري جزئية مصممة مسبقًا في FOV. يظهر Stim-A وStim-B في الشكل 1A. توفر كاميرا CCD تحت المرآة الديكروية (DM) تصويرًا ميدانيًا مشرقًا لرصد تركيز ليزر femtosecond.
هناك بعض الضروريات الحاسمة للتجارب التالية. في هذا البروتوكول، يتم استخدام مصدر ليزر ألياف femtosecond (1040 نانومتر، 50 ميغاهرتز، 120 fs) كمثال. في الممارسة العملية، يمكن استخدام معظم المذبذبات femtosecond التجارية طالما أن عرض النبض أقصر من 200 FS وينبغي أن تكون كثافة الطاقة الذروة فوق مستوى 1011 ~ 1012 W/cm2. على سبيل المثال، تي: ليزر الياقوت يستخدم عادة للميكروسكوب متعدد الفوتونات قادر على استبدال الليزر femtosecond أظهرت في الشكل 1B. قوة الليزر وبعض المعلمات التحفيز الضوئي الأخرى تحتاج إلى ضبطها لأن المعلمات البصرية (عرض النبض، الطول الموجي، ومعدل التكرار) تختلف كثيرا في مختلف الليزر femtosecond التي تحفز بالتالي مختلف الكفاءة الإثارة multiphoton.
جنبا إلى جنب مع التحفيز بالليزر femtosecond، يوفر الفحص المجهري البؤري التصوير الخلوي المستمر لرصد الديناميات الجزيئية في الوقت الحقيقي في كل من وسائط Stim-A و Stim-B. يتم التحكم في كل من مخططات التحفيز الضوئي (Stim-A وStim-B) بواسطة مصراع ميكانيكي مع دقة ميلي ثانية (الشكل1).
في وضع Stim-A، يتم إصلاح موقف التركيز بالليزر في وسط FOV. يُستخدم مقراب ترحيل لضمان تركيز ليزر femtosecond على مستوى التصوير البؤري عن طريق ضبط المسافة بين عدسات في الاتجاه الرأسي (اتجاه انتشار الليزر، العمودي إلى مستوى التصوير البؤري، كما هو موضح في الشكل1). من خلال التصوير مشرق الميدان من كاميرا CCD، يمكن قياس قطر التركيز بالليزر (~ 2 ميكرومتر، الشكل 2B). يتم التحكم في فترات التحفيز وأوقات التعرض بواسطة مصراع أثناء عملية التصوير البؤري.
في وضع Stim-B، يمكن تعيين منطقة التحفيز مسبقًا يدويًا في برنامج التحكم في التصوير البؤري لأي شكل مثل الخط أو المضلع أو الدائرة. تتم مزامنة الغالق مع عملية المسح الضوئي البؤري. يفتح في الوقت المصمم ة مسبقا التي يتم تعيينها من خلال برنامج التحكم التصوير البؤري. ثم يتم مسح منطقة التحفيز بواسطة ليزر femtosecond كتنظير مجهري. وهكذا، يتم تحفيز العينة فقط عن طريق الليزر femtosecond عندما تدخل عملية المسح الضوئي البؤري إطار تصوير معين.
يمكن إنشاء نظام التحفيز الضوئي على كل من المجاهر المعدنية المقلوبة ومستقيمة وفقا لمواضيع التجربة. الخلايا في المختبر المستزرعة في أطباق بيتري هي أفضل للعمل مع المجاهر المقلوبة. الحيوانات، وخاصة أدمغة الحيوانات الحية، هي أكثر ملاءمة مع المجاهر تستقيم. في هذه الدراسة، نأخذ المجهر المقلوب كمثال. وتجدر الإشارة إلى أن غطاء طبق بيتري لا يفتح خلال التجارب بأكملها.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>femtosecond laser</td>
			<td>Fianium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubation system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MIU-IBC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish with imprinted grid</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK-GFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>37145</td>
			<td>A gift from Rony Seger&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-cpYFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Heping Cheng&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mito-GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine (TMRM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Dilute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8430</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-eIF4E antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab76256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Bax antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab53154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome C antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab90529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells

السيطرة المباشرة على الأحداث الجزيئية الخلوية المحددة مهمة لعلوم الحياة. في الآونة الأخيرة، أظهرت الدراسات أن تحفيز الليزر femtosecond يمكن تنشيط مسارات الإشارات الجزيئية الخلوية متعددة في وقت واحد. في هذا البروتوكول، نبين أنه من خلال اقتران الليزر femtosecond في المجهر البؤري، يمكن تحفيز الخلايا على وجه التحديد عن طريق الليزر مركزة بإحكام. يتم تنشيط بعض العمليات الجزيئية التي يمكن ملاحظتها في وقت واحد في وقت لاحق. نقدم بروتوكولات مفصلة للتحفيز الضوئي لتنشيط إشارة خارج الخلية ينظم kinase (ERK) إشارة المسار في خلايا هيلا. يمكن أيضًا تحفيز ومضات الميتوكوندريا من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وغيرها من أحداث الميتوكوندريا إذا ركزت نبض الليزر فيمتوثانية على بنية أنبوبية الميتوكوندريا معينة. ويشمل هذا البروتوكول المعالجة المسبقة للخلايا قبل التحفيز الضوئي، وتقديم التحفيز الضوئي بواسطة فلاش ليزر فيمتوثانية على الهدف، ومراقبة / تحديد التغيرات الجزيئية بعد ذلك. ويمثل هذا البروتوكول أداة بصرية لجميع البحوث البيولوجية ذات الصلة.

يمكن إجراء التحفيز الضوئي في وقت واحد جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري المسح الضوئي المستمر. يمكن أن يبدأ التحفيز الضوئي في أي فتحة زمنية محددة مسبقًا في تسلسل الفحص المجهري البؤري الفاصل الزمني. يمكن للميكروسكوب البؤري مراقبة الجزيئات الخلوية عن طريق التصوير الفلوري. ويمك...

Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

الليزر femtosecond مركزة بإحكام يمكن أن توفر التحفيز الدقيق للخلايا من خلال أن يقترن في مجهرية البؤرية تمكين المراقبة في الوقت الحقيقي وتحفيز الصور. يمكن للتحفيز الضوئي تنشيط الأحداث الجزيئية الخلية بما في ذلك ERK مسار الإشارات وومضات الميتوكوندريا من أنواع الأكسجين التفاعلية.

تحفيز الصور بواسطة ليزر Femtosecond ينشط إشارات الكيناز (ERK) أو أحداث الميتوكوندريا في الخلايا المستهدفة

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

يمكن أن توفر الطرق البصرية، مثل optogenetics التشكيل الدقيق للإشارات الجزيئية الخلوية. أظهر بروتوكولنا التلاعب البصري الفموي للجزيئات إشارة الخلوية عن طريق تحفيز الليزر femtosecond. عن طريق اقتران ليزر femtosecond لدينا في المجهر confocal، يمكن أن توفر لدينا تقنية عملية على مستوى الخلية الواحدة أو دون الخلية عن طريق تحفيز الليزر femtosecond والرصد الديناميكي الجزيئي في الوقت الحقيقي عن طريق المجهر confocal.يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي أنظمة المجهر الفلورسنت عن طريق اقتران ليزر femtosecond في النظام بطريقة سليمة. لأي شخص يحاول طريقتنا للمرة الأولى، يرجى اتباع تعليمات منفصلة من مرفق الليزر أو التماس التوجيه من المهنيين عند تشغيل مصدر ليزر femtosecond مختبر. للبدء، قم بتشغيل ليزر الفومتو ثانية والمجهر confocal.استخدم المرايا العاكسة لتوجيه شعاع الليزر الفيمتو ثانية من خلال مصراع ميكانيكي. بعد ذلك، قم بتعيين تلسكوب ترحيل يتكون من زوج من العدسات لتوسيع عرض شعاع الإرسال. وينبغي أن يكون ذلك متسقا مع الفتحة الخلفية للهدف.الآن، توجيه المرايا العاكسة لمحاذاة شعاع الموسعة في المجهر. ضبط اثنين من المرايا العاكسة ، وأشار هنا ، لضبط تركيز ليزر femtosecond إلى مركز مجال الرؤية. وأخيراً، قم بقياس وضبط أشعة الليزر كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.ثقافة خلايا هيلا باستخدام التقنيات القياسية. عندما تكون جاهزة لتنفيذ التجربة، transfect الخلايا مع ERK2-GFP كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. بعد ذلك، قم بتشغيل المجهر الناكوسيل المسح بالليزر و الليزر femtosecond.تأكد من إغلاق مصراع الليزر. ثم، افتح برنامج المجهر. تعيين الليزر الإثارة في 488 نانومتر، وتعيين مستوى قوتها في 0.1 مللي واط.تعيين حجم التصوير 512 في 512 بكسل، ووقت الفاصل الزمني لكل بكسل كميكرو ثانية 2.4. ثم، تعيين الوقت الفاصل الزمني بين إطارين في ست ثوان للحد من تبييض الصورة وتلف الصورة للخلايا. أيضا، تعيين إطارات التصوير الكلي في حوالي 300 إطار لتوفير حوالي 30 دقيقة من المجهر المستمر في تجربة فردية.خذ الطبق الذي يحتوي على خلايا هيلا المصابة بـ ERK2-GFP من الحاضنة، ووضع الطبق على مرحلة المجهر. في البرنامج ، بدء وضع المسح الضوئي السريع ، وضبط الهدف للحصول على صور الفلورسنت واضحة من الخلايا. ثم، توقف عن المسح الضوئي السريع والتبديل إلى وضع التصوير في المجال الساطع باستخدام كاميرا CCD.افتح الغالق واضبط المسافة بين العدسات من تلسكوب التتابع لضمان أن قطر تركيز الليزر الفيمتوس ثانية حوالي اثنين من ميكرون. ثم أغلق الغالق لإكمال التعديل. قم بتعيين قوة ليزر الفيمتوس ثانية على 15 إلى 40 مللي وات ليزر 810 نانومتر، أو 20 إلى 60 مللي واط ليزر 1040 نانومتر.ثم، تعيين وقت فتح مصراع الكاميرا في 05 إلى 0.2 ثانية. استخدم وضع المسح السريع لتحديد خلية مستهدفة تعبر بقوة عن ERK2-GFP. بمجرد العثور عليها، نقل المرحلة من أجل توطين منطقة cytosol من الخلية المستهدفة المحددة بحيث يكون في وسط مجال الرؤية عندما تحت التصوير المجال مشرق.بمجرد توسيطه، انقر على زر البدء لبدء التصوير المستمر. افتح الغالق في أي فتحة زمنية محددة مسبقًا لتقديم تحفيز الليزر الفيمتو ثانية إلى الخلية المستهدفة. عند اكتمال عملية التصوير، احفظ بيانات التصوير لمزيد من التحليل.تعيين قوة ليزر الفيمتوس ثانية في 15 إلى 40 مللي و 810 نانومتر و 20 إلى 60 مللي واط و 1040 نانومتر في العينة. ثم، تأخذ الطبق الذي يحتوي على الخلايا التي تحتوي على المصابين ERK2-GFP من الحاضنة ووضعها على مرحلة المجهر. استخدام وضع المسح السريع لتحديد الخلية المستهدفة التعبير بشكل جيد ERK2-GFP.ثم، قم بتعيين عملية التصوير confocal وتحديد إطار المسح الضوئي الخاص كإطار التحفيز في عملية التصوير. تحديد معلمة إطار التحفيز. تعيين منطقة المسح من اثنين إلى ثلاثة من ثلاثة ميكرون مربع في منطقة cytosol قريبة من النواة في الخلية المستهدفة.تعيين وقت المسح الكلي في 0.1 إلى 0.2 ثانية. تعيين الوقت الفاصل الزمني بين إطارين في ست ثوان، وتعيين إطارات التصوير الكلي في حوالي 300 إطار لتوفير حوالي 30 دقيقة من المجهر المستمر. حفظ بيانات التصوير لمزيد من تحليل البيانات.مزامنة مصراع ليزر الفيمتوس ثانية مع ذلك من المسح confocal وفقا لمنطقة التحفيز الصورة المحددة مسبقا والتي هي مفتوحة فقط عندما قطرات المسح الضوئي بالليزر في إطار التحفيز. انقر فوق زر البدء لبدء عملية التصوير المجهري المستمر. لمراقبة ديناميات المورفولوجية الميتوكوندريا، عبر الخلايا هيلا مع الميتو-GFP للإشارة فلوريا الميتوكوندريا، أو قاعدة مع ميتو-cpYFP لمراقبة الميتوفلورام.بعد transfection، قم بتشغيل ليزر الفمتوز ثانية وتأكد من إغلاق الغالق. ثم، قم بتشغيل المجهر الناكوسي المسح الضوئي بالليزر. تعيين الليزر الإثارة في 488 نانومتر.ثم، تعيين مستوى الطاقة ليزر 488 نانومتر في 0.1 مللي واط. بالإضافة إلى ذلك، قم بتعيين حجم التصوير إلى 512 في 512 بكسل و وقت التصوير الكلي لكل إطار إلى 2.2 ثانية. ثم، تعيين الفاصل الزمني بين إطارين في ثواني صفر وإطارات التصوير الإجمالية كـ 200 إطار لتوفير حوالي 440 ثانية من المجهر المستمر في تجربة فردية.خذ الطبق الذي يحتوي على الخلايا المصابة بـ Mito GFP أو البروتين الفلوري الأصفر المُستَهدَف بشكل دائري المُوجَّل من الحاضنة ووضع الطبق على مرحلة المجهر. تحقق من حالة ليزر الفيمتو ثانية للتأكد من أن تركيز ليزر الفيمتو ثانية يقع في وسط مجال الرؤية. ثم قم بتعيين سهم مرجعي في مركز نافذة التصوير الفلورسنت للإشارة إلى موضع التركيز.بعد ذلك، تعيين قوة ليزر الفيمتوس ثانية في 5-30 miliwatts مع الليزر في 810 نانومتر و 10 إلى 40 مللي واط بالليزر في 1040 نانومتر. تعيين وقت فتح الغالق إلى 05 إلى 0.1 ثانية. استخدم وضع المسح السريع لتحديد الخلية المستهدفة التي تعبر بشكل جيد عن ميتو جي بي أو البروتين الفلوري الأصفر المُستَهدف بالتقدر الميتوكوندري.حدد الميتوكوندريون واحد عشوائيا في الخلية المستهدفة كما موضوع التجريبية. بعد ذلك، نقل مرحلة المجهر من أجل توطين الهيكل الأنبوبي الميتوكوندريا الهدف في وسط مجال الرؤية عن طريق وضع المسح الضوئي السريع كما هو مبين من قبل السهم المرجعي. انقر فوق زر البدء لبدء التصوير المستمر.وأخيراً، افتح الغالق في أي وقت محدد مسبقًا لتقديم تحفيز الليزر الفومتو ثانية في الهيكل الأنبوبي الميتوكوندري المستهدف. انتظر حتى تكتمل عملية التصوير ثم احفظ بيانات التصوير لمزيد من تحليل البيانات. باستخدام الطريقة المقدمة في هذا البروتوكول، ERK2 نقل إلى النواة بعد أن تعامل مع ومضة قصيرة من ليزر الفيومتوثان.ERK2-GFP الفلوريسنس يصل إلى الحد الأقصى بعد عدة دقائق من التحفيز ليزر الفيمتو ثانية. وسوف تكون جزيئات ERK2 dephosphorylated بعد تفعيل ركائز المصب في النواة ومن ثم ERK2 يعود إلى السيتوبلازم المشار إليها من قبل انخفاض الفلورسينسي GFP النووية. ERK2 يمكن تفعيلها عدة مرات عن طريق تحفيز الصور متعددة.ولذلك، فمن الممكن لمعالجة نمط إشارة ERK2 بدقة عن طريق التحكم في الفاصل الزمني بين المحفزات متعددة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تنشيط ERK2 أحيانا في الخلايا المجاورة حول الخلية حفز. تشير هذه الملاحظة إلى أن بعض الجزيئات القابلة للنشر قد يتم تحريرها من قبل الخلية المعالجة بالليزر الفيمتوس ثانية لتنشيط ERK2 في الخلايا المجاورة.يمكن تأكيد فسفور ERK2 من البروتين المصب eIF4E فردية عن طريق المجهر المناعي. هذه النتيجة تشير إلى أن تحفيز الليزر femtosecond يمكن بنجاح تنشيط مسار إشارة ERK. ومضات المؤكدة الميتوكوندريا أو mitoflashes هي رشقات نارية الأكسدة في الميتوكوندريا أن الجذر من الديناميات الجزيئية المعقدة.تنفيذ هذا مخطط تحفيز الصور أدى إلى إثارة Mitoflash ناجحة. هذا التحفيز الصورة كما يظهر أنواع من الديناميات الجزيئية الميتوكوندريا بما في ذلك تفتيت واستعادة مورفولوجيا الميتوكوندريا فضلا عن التذبذب من إمكانات غشاء الميتوكوندريا. على غرار الميتوفلا الصورة المنشط، هذه الأحداث الميتوكوندريا لها أداء مختلف مع كثافة الطاقة المختلفة.الشيء الأكثر أهمية هو التأكد من أن التركيز والحجم والدقة ليزر الفيمتو ثانية هو خاصية لتحفيز في الخلايا. قد يكون ليزر الفومتو ثانية الأشعة تحت الحمراء القريبة خطرًا على المستخدمين. عند اتباع هذا البروتوكول، وارتداء الحماية المناسبة ويمنع الليزر من الانتشار من الجدول البصري.

Research

JoVE Journal

Biology

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

التصوير G - مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) بوساطة الأحداث يشير إلى أن التحكم في الانجذاب الكيميائي Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

تقييم وظائف الميتوكوندريا وبقاء الخلية في خلايا الكلى البروتين Overexpressing نظائر الانزيمات C كيناز

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

التصوير متحد البؤر واحدة من الميتوكوندريا الأكسيد ومضات في القلب سليمة أو<em&gt; في فيفو</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

يقترن تصوير البروتين G مستقبلات بوساطة الكيميائي والأحداث يشير في خلايا HL60 العدلات مثل

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

تحديد بين الخلايا اشارة الأحداث المستحثة في خلايا قابلة للحياة من خلال التفاعل مع المجاورة الخلايا التي تمر أفكارك موت الخلية

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...