Name: photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells
Uploaded: 2019-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

Arbejdet blev støttet af National Natural Science Foundation i Kina (81571719 og 81661168014, 81673014, og 81870055), Shanghai Municipal Science and Technology Committee (18QA1402300 og 16XD1403100), og National Key R & D plan (2017YFA0104600).

Forsigtig: Protokollen præsenteret nedenfor indebærer brug af NIR at laser og giftige kemikalier. Vær opmærksom på alle mulige skader induceret af eksperiment procedurer. Læs sikkerhedsdatabladene for alle relevante kemikalier eller andre materialer inden brug. Følg sikkerhedsanvisningerne fra laser faciliteterne, eller Konsultér fagfolk for vejledning, før du betjener laserkilden.
1. eksperimentel forberedelse
<ol><li>Opsætning af foto stimulerings systeme...

<ol>
	<li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-signalling+dynamics+in+time+and+space.">Cell-signalling dynamics in time and space.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).</li><li>Scott, J. D., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+in+space+and+time:+where+proteins+come+together+and+when+they&#8217;re+apart.">Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they&#8217;re apart.</a> Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience.">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states.">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li><li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras/Erk+module.">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).</li><li>Steinbeck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+enables+functional+analysis+of+human+embryonic+stem+cell&#8211;derived+grafts+in+a+Parkinson's+disease+model.">Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell&#8211;derived grafts in a Parkinson's disease model.</a> Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Hoover, E. E., Squier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multiphoton+microscopy+technology.">Advances in multiphoton microscopy technology.</a> Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).</li><li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432 (7019), 822 (2004).</li><li>Tirlapur, U. K., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+targeted+transfection+by+femtosecond+laser.">Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser.</a> Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).</li><li>Shen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mechanics &amp; chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cellular-resolution+optical+perturbation+and+imaging+of+place+cell+firing+fields.">Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields.</a> Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+cellular+light+from+green+fluorescent+protein+by+a+femtosecond+laser.">Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser.</a> Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).</li><li>Smith, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+of+two+types+of+Ca2++waves+in+rat+pheochromocytoma+PC12+cells+by+ultrashort+pulsed+near-infrared+laser+irradiation.">Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation.</a> Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).</li><li>Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+signaling+in+response+to+photostimulation+with+a+femtosecond+laser.">Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser.</a> Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+across+gaps+in+non-excitable+cells+induced+by+femtosecond+laser+exposure.">Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+regulation+of+gene+expression+in+targeted+cells.">All-optical regulation of gene expression in targeted cells.</a> Scientific reports. 4, 5346 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+Extracellular-Signal-Regulated+Kinase+Signaling+in+Target+Cells+by+Femtosecond+Laser.">Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser.</a> Laser &amp; Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).</li><li>Yan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+generation+of+reactive+oxygen+species+by+femtosecond-laser+irradiation.">Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation.</a> Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Shi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+swelling+and+restorable+fragmentation+stimulated+by+femtosecond+laser.">Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser.</a> Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).</li><li>Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duration,+magnitude+and+compartmentalization+of+ERK+MAP+kinase+activity:+mechanisms+for+providing+signaling+specificity.">The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity.</a> Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+in+single+mitochondria.">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134 (2), 279-290 (2008).</li><li>Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Flashes:+Elemental+Signaling+Events+in+Eukaryotic+Cells.">Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells.</a> Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).</li><li>Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+flashes:+new+insights+into+mitochondrial+ROS+signalling+and+beyond.">Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond.</a> The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).</li><li>Wang, S., Hu, M., He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+mitoflash+excited+by+femtosecond+laser.">Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser.</a> Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).</li></ol>

Vi demonstrerer en foto stimulation strategi ved at kombinere en at laser med en Laserscanning confokale mikroskop system. Foto stimulation kan direkte fungere som en to-foton mikroskopi ved at definere STIM-B i overensstemmelse hermed. Vi leverer en detaljeret protokol til at udnytte en kort flash af at laser til at udløse Erk signalering eller mitoflashes i målceller. De forskellige stimulerings former kan udføres i henhold til forskellige eksperimentelle formål og systemer. STIM-A kan nemt sættes op baseret på e...

Teknologien til at kontrollere cellulære signalering molekyler er en vigtig del af udviklingen af Life Science. Traditionelt er den mest almindeligt anvendte metode biokemisk behandling af narkotika eller biologiske materialer1,2,3. I løbet af det seneste årti, opfindelsen af optogenetics åbner en ny æra for cellulære molekylære signal modulation. Transfection med lysfølsomme proteiner fra genteknologi gør lys blive et kraftfuldt værktøj til at moduere forskellige protein aktiviteter i målcellen. Denne teknologi har gjort opmuntrende fremskridt såsom excitation og hæmning af neurale signal, fremme genekspression, manipulere cellulære signal mønstre, førende forskellige celle skæbner og patologisk undersøgelse4,5 ,6,7,8,9. Men, lys kan kun fungere ved transfficerende celler med optogenetiske proteiner. I den nuværende fase, der findes sjældne metoder, der giver lys til at kontrollere cellulære molekyler direkte udover optogenetics.
Femtosecond laser har avancerede biologiske forsker ved at give effektiv multiphoton excitation samtidig bevare god biologisk sikkerhed. Ved at implementere forskellige foto behandling strategier, det har indset talrige resultater såsom multiphoton mikroskopi, mikrokirurgi og multiphoton optogenetiske applikationer10,11,12,13 ,14,15,16. Nylige undersøgelser viser, at at laser stimulation er blevet demonstreret som en yderst effektiv optisk metode til direkte fremkalde molekylære signalering begivenheder. Det er blevet konstateret, at stramt fokuseret at laser bestråling på endoplasmatiske reticulum (er) er i stand til at nedbryder calcium i er og aktivere calcium-Release-aktiverede calcium (CRAC) kanaler til dannelse af calcium signaler i cellerne17. Dette foto-aktiverede calcium signal kan sprede sig mellem flere typer af celler18,19,20. Desuden, det har også evnen til at aktivere celle signalering veje såsom nuklear faktor af aktiverede T-celler (nfat) og Erk signalering pathway21,22. Ved at justere intensiteten og lokalisering af at laser eksponering i celler, for eksempel, fokusere laseren på mitokondrier, det kan påvirke mitokondrie morfologi og molekylære begivenheder23,24, 25. specifikt, byger af MITOKONDRIE ros generation kan blive ophidset af foto stimulation, som er bemærket som fluorescerende blinker i mitokondrier (mitoflashes).
Derfor, den foto stimulation teknologi er et godt potentiale til at blive bredt anvendt i beslægtede biologiske forskning. Det er også en god chance for at forlænge at laser applikationer i kontrol af cellulære signalering molekyler og funktioner foruden mikroskopi. Her giver vi de tekniske detaljer om foto stimulation. Foto stimulation opnås ved at koble en at-laser til et Konfokal mikroskop for at give en enkelt målcelle med en kort flash-foto stimulation. Det kan indlede effektiv og kontrollerbar ERK aktivering i cellen. Hvis foto stimulation er placeret på mitokondrie rørformede struktur, mitokondrie membran potentiale, morfologi, ROS, og permeabilitet overgang porer, kan alle styres af foto stimulation. Baseret på denne foto stimulerings ordning giver vi en detaljeret metode til aktivering af ERK signalering pathway og påvirkning af flere mitokondrielle hændelser i Hela-cellerne. Denne protokol belyser processen med at levere at laser stimulation i målcellerne.
Foto stimulations systemet er etableret på et Konfokal mikroskop med en at laser kobling i det til simultan stimulation og kontinuerlig mikroskopi. At laser (bølgelængde: 1.040 nm, gentagelse sats: 50 MHz, pulsbredde: 120 FS, maksimal output gennemsnitlig effekt: 1 W) er opdelt i to bjælker før kobling. Den ene styres gennem et relæ teleskop bestående af et par linser. Det afspejles derefter direkte i bagsiden af et mål (60x, N.A. = 1,2, vand nedsænkning) at danne en diffraktion-Limit fokus (STIM-A). Den anden afspejles i den optiske scanning af confokale mikroskop til at fungere som en to-foton scanningstilstand (STIM-B). STIM-A præsenterer et fast fokuspunkt i midten af synsfeltet (FOV). STIM-B er et præ-designet partielt Konfokal scanningsområde i FOV. STIM-A og STIM-B er vist i figur 1a. Et CCD-kamera under koldtlysreflektorlamper Mirror (DM) giver lys-felt Imaging til overvågning af fokus for at laser.
Der er nogle afgørende væsentlige for følgende eksperimenter. I denne protokol, en at fiber laser kilde (1040 nm, 50 MHz, 120 FS) bruges som et eksempel. I praksis kan de fleste kommercielle at oscillatorer anvendes, så længe puls bredden er kortere end 200 FS, og spidseffekt tætheden bør være over niveauet 1011 ~ 1012 W/cm2. For eksempel, en ti: safir laser normalt anvendes til multiphoton mikroskopi er i stand til at erstatte at laser viste i figur 1b. Laseren magt og nogle andre foto stimulation parametre skal justeres, fordi de optiske parametre (pulsbredde, bølgelængde, og gentagelse sats) varierer meget i forskellige at lasere, der dermed fremkalde forskellige multiphoton excitation effektivitetsgevinster.
Sammen med at laser stimulation, den konfokale mikroskopi giver kontinuerlig celle Imaging til at overvåge molekylære dynamik i realtid i både STIM-A og STIM-B modes. Begge foto stimuleringsordninger (STIM-A og STIM-B) styres af en mekanisk lukker med en millisekund opløsning (figur 1).
I STIM-A-tilstand er positionen for laser fokus fastgjort i midten af FOV. Et relæ teleskop bruges til at sikre fokus for at laser til at være placeret på confokale Imaging plane ved tuning afstanden mellem to linser i den lodrette retning (laser formering retning, lodret til confokale Imaging plane, som vist i Figur 1). Ved den lyse-Field Imaging af CCD-kamera, kan diameteren af laser fokus måles (~ 2 μm, figur 2b). Stimulations varigheder og eksponeringstider styres af en udløser under Konfokal billeddannelses processen.
I STIM-B-tilstand kan stimulerings området på forhånd tildeles manuelt i konfokale Imaging-styringssoftwaren til enhver form som linje, polygon eller cirkel. Udløseren synkroniseres med Konfokal scanningsprocessen. Det åbner på forhånd designet tid, som er sat gennem konfokale Imaging kontrollerende software. Derefter, stimulerings området scannes af at laser som Konfokal mikroskopi. Således, prøven er kun stimuleret af at laser når confokal scanning proces indtaster en given Imaging ramme.
Foto stimulations systemet kan etableres på både inverterede og opretstående metallurgiske mikroskoper i henhold til forsøgspersonerne. In vitro-celler, der dyrkes i Petri skåle er bedre at arbejde med inverterede mikroskoper. Dyr, især hjerner af levende dyr, er mere velegnede med opretstående mikroskoper. I denne undersøgelse tager vi det omvendte mikroskop som et eksempel. Det skal bemærkes, at dækslet af Petri skålen ikke åbnes under hele eksperimenter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>femtosecond laser</td>
			<td>Fianium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubation system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MIU-IBC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish with imprinted grid</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK-GFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>37145</td>
			<td>A gift from Rony Seger&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-cpYFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Heping Cheng&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mito-GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine (TMRM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Dilute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8430</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-eIF4E antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab76256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Bax antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab53154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome C antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab90529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells

Direkte kontrol af cellulære definerede molekylære begivenheder er vigtig for Life Science. For nylig, undersøgelser har vist, at at laser stimulation kan samtidig aktivere flere cellulære molekylære signalering veje. I denne protokol viser vi, at ved at koble at laser ind i et Konfokal mikroskop, kan cellerne stimuleres netop af den stramt fokuserede laser. Nogle molekylære processer, der kan observeres samtidigt, aktiveres efterfølgende. Vi præsenterer detaljerede protokoller af foto stimulation for at aktivere ekstracellulær signal reguleret kinase (ERK) signalering pathway i Hela celler. Mitokondrie blinker af reaktive oxygenarter (ros) og andre mitokondrielle begivenheder kan også stimuleres, hvis fokusere at laser puls på en bestemt mitokondrie rørformede struktur. Denne protokol omfatter forbehandling af celler før foto stimulation, levering af foto stimulation af en at laser flash på målet, og observere/identificere molekylære ændringer bagefter. Denne protokol repræsenterer et alt optisk værktøj til beslægtede biologiske undersøgelser.

Foto stimulation kan udføres samtidigt sammen med kontinuerlig Konfokal scanning mikroskopi. Foto stimulation kan starte på ethvert foruddefineret tidsinterval i den tidsforskudt Konfokal mikroskopi sekvens. Den konfokale mikroskopi kan overvåge cellulære molekyler ved fluorescerende billeddannelse. Den molekylære respons på foto stimulation og andre dynamikker kan identificeres på denne måde. Teoretisk, hvis ERK er aktiveret, vil det være fosforyleret flytte fra cytoplasmaet til...

Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Stramt fokuseret at laser kan levere præcis stimulation til celler ved at blive koblet til en Konfokal mikroskopi muliggør real-time observation og foto stimulation. Foto stimulation kan aktivere celle molekylære hændelser, herunder ERK signalering pathway og mitokondrie blinker af reaktive oxygenarter.

Foto stimulation af Femtosecond laser aktiverer ekstracellulær-signal-reguleret kinase (ERK) signalering eller mitokondrie hændelser i målcellerne

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Optiske metoder, såsom optogenetik kan give den præcise graduering af cellulære molekylære signaler. Vores protokol viste en mundtlig optisk manipulation af cellulære signalkylære ved femtosecond laser stimulation. Ved at koble vores femtosekundlaser til et konfokalt mikroskop, kan vores teknik give encellet eller subcellulær drift ved femtosecond laser stimulation og real-time, molekylær dynamisk overvågning ved konfokal mikroskopi.Denne metode kan anvendes på alle fluorescerende mikroskopi systemer ved at koble en femtosekond laser ind i systemet på den rigtige måde. For alle, der forsøger vores metode for første gang, skal du følge de separate instruktioner fra laser facilitet eller søge vejledning fra fagfolk, når du betjener et laboratorium femtosecond laser kilde. Til at begynde, tænde femtosekalde laser og konfokal mikroskop.Brug reflekterende spejle til at lede femtosekond laserstrålen gennem en mekanisk lukker. Dernæst indstille et relæ teleskop bestående af et par linser til at udvide transmission stråle bredde. Dette bør være i overensstemmelse med bagsiden blænde af målet.Nu styre de reflekterende spejle til at tilpasse den udvidede stråle i mikroskopet. Juster de to reflekterende spejle, påpeget her, at tune fokus for femtosecond laser til midten af synsfeltet. Endelig måle og tune lasere som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol.Kultur Hela celler ved hjælp af standard teknikker. Når du er klar til at udføre eksperimentet, skal du transfect cellerne med ERK2-GFP som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Tænd derefter for det konfokale laserscanningsmikroskop og femtosekundlaseren.Sørg for, at laserens lukker er lukket. Åbn derefter mikroskopsoftwaren. Indstil excitation laser på 488 nanometer, og sæt sit effektniveau på 0,1 milliwatt.Indstil billedstørrelsen til 512 gange 512 pixel og intervaltiden for hver pixel som 2,4 mikrosekunder. Derefter indstilles intervaltiden mellem to billeder på seks sekunder for at minimere fotoblegning og fotoskade på cellerne. Du skal også indstille de samlede billedrammer til omkring 300 billeder for at give ca. 30 minutters kontinuerlig mikroskopi i et individuelt eksperiment.Tag skålen indeholdende Hela celler transficeret med ERK2-GFP fra inkubatoren, og læg skålen på mikroskopet fase. I softwaren skal du starte hurtig scanningstilstand og indstille målet om at anskaffe klare lysstofrør af cellerne. Stop derefter hurtig scanning, og skift til lysfeltbilledbehandlingstilstand ved hjælp af CCD-kameraet.Åbn lukkeren og justere afstanden mellem de to linser af relæteleskopet for at sikre, at diameteren af femtosecond laser fokus er omkring to mikron. Luk derefter lukkeren for at fuldføre justeringen. Indstil styrken af femtosecond laser på 15 til 40 milliwatt for en 810 nanometer laser, eller en 20 til 60 milliwatt for en 1040 nanometer laser.Indstil derefter lukkeråbningstiden til 05 til 0,2 sekunder. Brug hurtig scanningstilstand til at vælge en målcelle, der på det kraftigste udtrykker ERK2-GFP. Når den er fundet, skal du flytte fasen for at lokalisere cytosolområdet i den valgte målcelle, så den er i midten af synsfeltet, når den er under billeddannelse i lysfeltet.Når centreret, skal du klikke på startknappen for at begynde kontinuerlig billeddannelse. Åbn lukkeren på et foruddefineret tidsslot for at levere femtosecond laserstimulationen ind i målcellen. Når billeddannelsesprocessen er fuldført, skal du gemme billeddataene til yderligere analyse.Indstilles styrken af femtosecond laser på 15 til 40 milliwatt og 810 nanometer og 20 til 60 milliwatt og 1040 nanometer på prøven. Derefter tage fadet indeholder celler transfekteret med ERK2-GFP fra inkubatoren og sætte det på mikroskopet fase. Brug hurtig scanningstilstand til at vælge målcellen, der udtrykker ERK2-GFP.Derefter indstille konfokale billeddannelse proces og definere en særlig scanning ramme som stimulering ramme i billeddannelse proces. Definer parameteren for stimuleringsrammen. Indstil en scanning region på to med to til tre af tre kvadratiske mikron på cytosol området tæt på kernen i målcellen.Indstil den samlede scanningstid til 0,1 til 0,2 sekunder. Indstil intervaltiden mellem to billeder på seks sekunder, og indstil de samlede billedrammer til ca. 300 billeder for at give ca. 30 minutters kontinuerlig mikroskopi. Gem billeddataene til yderligere dataanalyse.Synkroniser femtosekundlaserens lukker med den konfokale scanning i henhold til det foruddefinerede fotostimuleringsområde, som kun er åbent, når laserscanningen falder i stimuleringsrammen. Klik på startknappen for at starte den kontinuerlige mikroskopibilleddannelsesproces. At observere mitokondriel morfologisk dynamik, transfect Hela celler med Mito-GFP til fluorescerende angive mitokondrier, eller en base med mito-cpYFP at observere mitoflashes.Efter transfektion skal du tænde for femtosecond laseren og sikre lukkeren er lukket. Tænd derefter for det konfokale laserscanningsmikroskop. Indstil excitation laser på 488 nanometer.Derefter indstilles effektniveauet for 488 nanometerlaseren til 0,1 milliwatt. Angiv desuden billedstørrelsen til 512 gange 512 pixel og den samlede billedtid for hver ramme til 2,2 sekunder. Indstil derefter intervaltiden mellem to rammer ved nul sekunder og de samlede billedrammer som 200 billeder for at give ca. 440 sekunders kontinuerlig mikroskopi i et individuelt eksperiment.Tag skålen indeholdende celler transfekteret med mito GFP eller mitokondriel-målrettet cirkulært permuted gul fluorescerende protein fra inkubatoren og sætte fadet på mikroskop scenen. Kontroller femtosesekundlaserens status for at sikre, at femtosesekundlaserens fokus er placeret i midten af synsfeltet. Angiv derefter en referencepil i midten af lysstofrørsvinduet for at angive fokuss placering.Dernæst indstille magt femtosekond laser på fem til 30 miliwatts med laser på 810 nanometer og 10 til 40 milliwatt til laser på 1040 nanometer. Indstil lukkerens åbningstid til 05 til 0,1 sekunder. Brug hurtig scanningstilstand til at vælge den målcelle, der er godt udtryk mito GFP eller mitokondrielle-målrettede cirkulært permuterede gule fluorescerende protein.Vælg en mitokondrion tilfældigt i målcellen som forsøgsperson. Dernæst skal du flytte mikroskopstadiet for at lokalisere mål mitokondriel rørstruktur i midten af synsfeltet ved hurtig scanningstilstand som angivet af referencepilen. Klik på startknappen for at starte kontinuerlig billeddannelse.Endelig åbne lukkeren på ethvert foruddefineret tidspunkt til at levere femtosecond laser stimulation i målet mitokondrielle rørformede struktur. Vent, indtil billedbehandlingsprocessen er fuldført, og gem derefter billeddataene til yderligere dataanalyse. Ved hjælp af den metode, der præsenteres i denne protokol, translocerer ERK2 ind i kernen efter at være blevet behandlet med en kort flash af femtosecond laser.ERK2-GFP fluorescens når det maksimale efter flere minutter af femtosecond laser stimulation. ERK2 molekylerne vil blive dephosphorylated efter aktivering downstream substrater i kernen og derefter ERK2 kommer tilbage til cytoplasmaet angivet ved en faldende nuklear GFP fluorescens. ERK2 kan aktiveres flere gange ved flere fotostimuletider.Derfor er det muligt at manipulere ERK2 signalmønsteret præcist ved at styre intervaltiden mellem flere stimuli. Desuden kan ERK2 lejlighedsvis aktiveres i tilstødende celler omkring den stimulerede celle. Denne observation indikerer, at nogle diffusible molekyler kan frigives af cellen behandlet med femtosesekund laser til at aktivere ERK2 i de tilstødende celler.Fosforylering af ERK2 downstream protein eIF4E kan bekræftes individualiseret ved immunfluorescensmikroskopi. Dette resultat indikerer, at femtosekond laserstimulation med succes kan aktivere ERK-signalvejen. Mitokondrielle oxidative blinker eller mitoflashes er oxidative brister i mitokondrier, at roden fra komplekse molekylære dynamik.Gennemførelse af dette foto stimulation ordning resulterede i en vellykket mitoflash excitation. Dette foto stimulation viser også sorter af mitokondrielle molekylære dynamik, herunder fragmentering og restaurering af mitokondrielle morfologi samt svingning af mitokondriel membran potentiale. Svarende til foto aktiverede mitoflashes, disse mitokondrier begivenheder har forskellige ydeevne med forskellige effektintensiteter.Det vigtigste er at sikre, at fokus, størrelse og præcision femtosekund laser er en egenskab for stimulation i celler. Den nær-infrarøde femtosecond laser kan være farligt for brugerne. Når du følger denne protokol, skal du bære korrekt beskyttelse, og det forhindrer laseren i at sprede ud fra det optiske bord.

Research

JoVE Journal

Biology

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Bestemmelse af lipidklump opdeling af fluorescens-mærkede prober i levende celler ved fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET mikroskopi af Real-time overvågning af signalering begivenheder i levende celler Brug unimolekylær Biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Vurdering af Mitochondriale funktioner og cellelevedygtighed i Renal celler, der overudtrykker protein kinase C isozymer

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Konfokal Imaging af Single Mitochondriale Superoxide Blinker i intakte hjerte eller<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Imaging G-protein-koblet receptor-medieret Kemotaksi og dens signaleringshændelser i Neutrofil-lignende HL60-celler

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Identifikation af intracellulær signalering begivenheder induceret i levedygtige celler ved interaktion med naboceller Gennemgår apoptotisk celledød

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...