Name: photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells
Uploaded: 2019-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

Het werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81571719 en 81661168014, 81673014 en 81870055), het Shanghai Municipal Science and Technology Committee (18QA1402300 en 16XD1403100), en het National key R & D plan (2017YFA0104600).

Let op: Het onderstaande protocol omvat het gebruik van NIR femtosecondelaser laser en giftige chemicaliën. Let op alle mogelijke schade veroorzaakt door experiment procedures. Lees voor gebruik veiligheidsinformatiebladen van alle relevante chemicaliën of andere materialen. Volg de veiligheidsinstructies van de laser faciliteiten of raadpleeg professionals voor hulp bij het bedienen van de laserbron.
1. experimentele voorbereiding
<ol><li>Het photostimulatie syste...

<ol>
	<li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-signalling+dynamics+in+time+and+space.">Cell-signalling dynamics in time and space.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).</li><li>Scott, J. D., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+in+space+and+time:+where+proteins+come+together+and+when+they&#8217;re+apart.">Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they&#8217;re apart.</a> Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience.">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states.">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li><li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras/Erk+module.">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).</li><li>Steinbeck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+enables+functional+analysis+of+human+embryonic+stem+cell&#8211;derived+grafts+in+a+Parkinson's+disease+model.">Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell&#8211;derived grafts in a Parkinson's disease model.</a> Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Hoover, E. E., Squier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multiphoton+microscopy+technology.">Advances in multiphoton microscopy technology.</a> Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).</li><li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432 (7019), 822 (2004).</li><li>Tirlapur, U. K., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+targeted+transfection+by+femtosecond+laser.">Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser.</a> Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).</li><li>Shen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mechanics &amp; chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cellular-resolution+optical+perturbation+and+imaging+of+place+cell+firing+fields.">Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields.</a> Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+cellular+light+from+green+fluorescent+protein+by+a+femtosecond+laser.">Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser.</a> Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).</li><li>Smith, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+of+two+types+of+Ca2++waves+in+rat+pheochromocytoma+PC12+cells+by+ultrashort+pulsed+near-infrared+laser+irradiation.">Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation.</a> Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).</li><li>Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+signaling+in+response+to+photostimulation+with+a+femtosecond+laser.">Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser.</a> Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+across+gaps+in+non-excitable+cells+induced+by+femtosecond+laser+exposure.">Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+regulation+of+gene+expression+in+targeted+cells.">All-optical regulation of gene expression in targeted cells.</a> Scientific reports. 4, 5346 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+Extracellular-Signal-Regulated+Kinase+Signaling+in+Target+Cells+by+Femtosecond+Laser.">Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser.</a> Laser &amp; Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).</li><li>Yan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+generation+of+reactive+oxygen+species+by+femtosecond-laser+irradiation.">Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation.</a> Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Shi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+swelling+and+restorable+fragmentation+stimulated+by+femtosecond+laser.">Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser.</a> Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).</li><li>Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duration,+magnitude+and+compartmentalization+of+ERK+MAP+kinase+activity:+mechanisms+for+providing+signaling+specificity.">The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity.</a> Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+in+single+mitochondria.">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134 (2), 279-290 (2008).</li><li>Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Flashes:+Elemental+Signaling+Events+in+Eukaryotic+Cells.">Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells.</a> Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).</li><li>Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+flashes:+new+insights+into+mitochondrial+ROS+signalling+and+beyond.">Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond.</a> The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).</li><li>Wang, S., Hu, M., He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+mitoflash+excited+by+femtosecond+laser.">Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser.</a> Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).</li></ol>

We demonstreren een foto stimulatie strategie door een femtosecondelaser laser te combineren met een laser scanning confocale Microscoop systeem. De foto stimulatie kan direct werken als een twee-Fobe microscopie door Stim-B dienovereenkomstig te definiëren. We bieden een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een korte flits van femtosecondelaser laser om ERK-signalering of mitoflitsen in doelcellen te activeren. De verschillende stimulatie modi kunnen worden uitgevoerd volgens verschillende experimentele doeleind...

De technologie van het beheersen van cellulaire signalering moleculen is een belangrijk onderdeel van de ontwikkeling van de levenswetenschappen. Traditioneel, de meest gebruikte methode is biochemische behandeling door drugs of biologische materialen1,2,3. In het afgelopen decennium, de uitvinding van optogenetics opent een nieuw tijdperk voor cellulaire moleculaire signaal modulatie. Transfectie met lichtgevoelige eiwitten door genengineering maakt licht uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel om verschillende proteïne-activiteiten in de doelcel te moduleren. Deze technologie heeft bemoedigende vorderingen gemaakt, zoals excitatie en remming van het neurale signaal, het bevorderen van genexpressie, het manipuleren van cellulaire signaal patronen, het leiden van verschillende celfates en pathologisch onderzoek4,5 ,6,7,8,9. Licht kan echter alleen werken door transfecterende cellen met optogenetische eiwitten. In de huidige fase, er bestaan zeldzame methoden die licht in staat stellen om cellulaire moleculen direct naast optogenetics controleren.
Femtosecond laser heeft geavanceerde biologische onderzoeken door het verstrekken van efficiënte multiphoton excitatie met behoud van goede biologische veiligheid. Door diverse fotoverwerkings strategieën te implementeren, heeft het tal van prestaties gerealiseerd, zoals multiphoton microscopie, microsurgeries en multiphoton optogenetische toepassingen10,11,12,13 ,14,15,16. Recente onderzoeken tonen aan dat femtosecondelaser Laser stimulatie is aangetoond als een zeer efficiënte optische methode om moleculaire signalering van gebeurtenissen direct te induceren. Er is geconstateerd dat strak gerichte femtosecondelaser laser bestraling op endoplasmisch reticulum (ER) calcium in ER kan afbreken en calcium-vrijgave-geactiveerde calcium (CRAC)-kanalen kunnen activeren om calcium signalen in cellen17te vormen. Dit foto-geactiveerde calcium signaal kan zich verspreiden tussen meerdere soorten cellen18,19,20. Bovendien, het heeft ook de mogelijkheid om het activeren van de cel signalering trajecten zoals nucleaire factor van geactiveerde T-cellen (nfat) en ERK signalering traject21,22. Door het aanpassen van de intensiteit en lokalisatie van femtosecondelaser Laser blootstelling in cellen, bijvoorbeeld, het concentreren van de laser op mitochondriën, het kan beïnvloeden mitochondriale morfologie en moleculaire gebeurtenissen23,24, 25. in het bijzonder, uitbarstingen van mitochondriale Ros generatie kan worden opgewonden door photostimulatie, die is gemarkeerd als fluorescerende flitsen in mitochondriën (mitoflashes).
Vandaar dat de photostimulatie technologie van goed potentieel is om op grote schaal toegepast te worden in verwant biologisch onderzoek. Het is ook een goede kans om uit te breiden femtosecondelaser lasertoepassingen in het beheersen van cellulaire signalering van moleculen en functies naast microscopie. Hier bieden we de technische details van photostimulatie. De foto stimulatie wordt bereikt door een femtosecondelaser laser te koppelen aan een confocale Microscoop om een enkelvoudige doelcel te bieden met een korte flits fotostimulatie. Het kan efficiënte en bestuurbare ERK-activering in de cel initiëren. Als de foto stimulatie is gelegen op de mitochondriale buisvormige structuur, de Mitochondriale membraanpotentiaal, morfologie, ROS, en permeabiliteit overgang poriën, kunnen allemaal worden bestuurd door de foto stimulatie. Op basis van dit photostimulatie schema bieden we een gedetailleerde methode om ERK-signalerings traject te activeren en meerdere mitochondriale gebeurtenissen in HeLa-cellen te beïnvloeden. Dit protocol aanvult het proces van het leveren van femtosecondelaser Laser stimulatie in doelcellen.
Het foto stimulatie systeem wordt ingesteld op een confocale Microscoop met een femtosecondelaser Laser koppeling erin voor gelijktijdige stimulatie en continue microscopie. De femtosecondelaser Laser (golflengte: 1.040 nm, herhalingssnelheid: 50 MHz, pulsbreedte: 120 FS, maximaal uitgangs gemiddelde vermogen: 1 W) wordt voor koppeling gesplitst in twee stralen. Een wordt geleid door een relais telescoop bestaande uit een paar lenzen. Het wordt dan direct weerspiegeld in de Achteropening van een doelstelling (60x, N.A. = 1,2, onderdompeling in water) om een diffractie-grens focus te vormen (STIM-A). De andere wordt weerspiegeld in het Scanning optische pad van confocale Microscoop om te werken als een twee-photon Scanning mode (STIM-B). STIM-A presenteert een vast scherpstelpunt in het midden van het gezichtsveld (FOV). STIM-B is een vooraf ontworpen gedeeltelijke confocale scanning gebied in de FOV. STIM-A en STIM-B worden weergegeven in Figuur 1a. Een CCD-camera onder de dichroïde spiegel (DM) biedt helder-veld beeldvorming voor het bewaken van de focus van femtosecondelaser laser.
Er zijn enkele cruciale essentiële benodigdheden voor de volgende experimenten. In dit protocol wordt een femtosecondelaser Fiber laserbron (1040 nm, 50 MHz, 120 FS) als voorbeeld gebruikt. In de praktijk kunnen de meeste commerciële femtosecondelaser-oscillatoren worden gebruikt zolang de pulsbreedte korter is dan 200 FS en de piek vermogensdichtheid boven het niveau van 1011 ~ 1012 W/cm2moet liggen. Bijvoorbeeld, een TI: saffier laser meestal gebruikt voor multiphoton microscopie is in staat om de femtosecondelaser laser te vervangen toonde in Figuur 1b. De laser kracht en enkele andere fotostimulatie parameters moeten worden afgesteld omdat de optische parameters (pulsbreedte, golflengte en herhalingssnelheid) veel variëren in verschillende femtosecondelaser-lasers die zo verschillende multiphoton-excitatie-efficiëntie opwekken.
Samen met femtosecondelaser Laser stimulatie biedt de confocale microscopie continue celbeeldvorming om de moleculaire dynamiek in real-time te bewaken in zowel Stim-A als Stim-B modes. Beide foto stimulatie schema's (STIM-A en STIM-B) worden bestuurd door een mechanische sluiter met een resolutie van milliseconde (Figuur 1).
In Stim-A mode, de positie van laser focus is vastgesteld in het centrum van FOV. Een relais telescoop wordt gebruikt om de focus van femtosecondelaser laser te vinden op het confocale beeldvormings vlak door de afstand tussen twee lenzen in de verticale richting te tunen (de laser propagatie richting, verticaal naar het confocale beeldvlak, zoals weergegeven in Figuur 1). Door de helder-veld beeldvorming van de CCD-camera kan de diameter van de laser focus worden gemeten (~ 2 μm, Figuur 2b). De duur van de stimulatie en de blootstellings tijden worden geregeld door een sluiter tijdens het confocale beeldvormings proces.
In de Stim-B-modus kan het stimulatie gebied handmatig worden toegewezen in de confocale Imaging Controlling-software op elke vorm zoals lijn, veelhoek of cirkel. De sluiter wordt gesynchroniseerd met het confocale scanproces. Het opent op de vooraf ontworpen tijd die is ingesteld door de confocale Imaging Controlling software. Vervolgens wordt het stimulatie gebied gescand door femtosecondelaser laser als confocale microscopie. Zo wordt het monster alleen gestimuleerd door femtosecondelaser Laser wanneer het confocale scanproces een bepaald beeld frame binnenkomt.
Het fotostimulatie systeem kan worden ingesteld op zowel omgekeerde als staande metallurgische microscopen volgens de proefpersonen. In vitro cellen gekweekt in Petri schalen zijn beter om te werken met omgekeerde microscopen. Dieren, in het bijzonder hersenen van levende dieren, zijn meer geschikt voor rechtopstaande microscopen. In deze studie nemen we de omgekeerde Microscoop als voorbeeld. Opgemerkt moet worden dat de cover van Petri schaal niet wordt geopend tijdens de hele experimenten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>femtosecond laser</td>
			<td>Fianium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubation system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MIU-IBC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish with imprinted grid</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK-GFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>37145</td>
			<td>A gift from Rony Seger&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-cpYFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Heping Cheng&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mito-GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine (TMRM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Dilute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8430</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-eIF4E antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab76256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Bax antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab53154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome C antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab90529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells

Directe controle van cellulaire gedefinieerde moleculaire gebeurtenissen is belangrijk voor Life Science. Onlangs hebben studies aangetoond dat femtosecondelaser Laser stimulatie gelijktijdig meerdere cellulaire moleculaire signalerings trajecten kan activeren. In dit protocol laten we zien dat door het koppelen van femtosecondelaser laser in een confocale Microscoop, cellen precies kunnen worden gestimuleerd door de strak gerichte laser. Sommige moleculaire processen die gelijktijdig kunnen worden waargenomen, worden vervolgens geactiveerd. We presenteren gedetailleerde protocollen van de photostimulatie te activeren extracellulaire signaal gereguleerd kinase (ERK) signalering traject in HeLa cellen. Mitochondriale flitsen van reactieve zuurstof soorten (ROS) en andere mitochondriale gebeurtenissen kunnen ook worden gestimuleerd als het concentreren van de femtosecondelaser laserpuls op een bepaalde mitochondriale buisvormige structuur. Dit protocol omvat het voorbehandelen van cellen vóór foto stimulatie, het afleveren van de foto stimulatie door een femtosecondelaser Laser flits op het doelwit en het observeren/identificeren van moleculaire veranderingen achteraf. Dit protocol vertegenwoordigt een all-optisch hulpmiddel voor aanverwante biologische onderzoeken.

De foto stimulatie kan gelijktijdig worden uitgevoerd samen met continue confocale scanning microscopie. De foto stimulatie kan beginnen bij elk vooraf gedefinieerd tijdslot in de time-lapse confocale microscopie sequentie. De confocale microscopie kan cellulaire moleculen monitoren door fluorescerende beeldvorming. De moleculaire responsen op foto stimulatie en andere dynamiek kunnen op deze manier worden geïdentificeerd. Theoretisch, als ERK wordt geactiveerd, het zal worden gefosforyl...

Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Strak gerichte femtosecondelaser laser kan precieze stimulatie naar cellen leveren door te worden gekoppeld aan een confocale microscopie die de real-time observatie en foto stimulatie mogelijk maakt. De foto stimulatie kan celmoleculaire gebeurtenissen activeren, waaronder ERK-signalerings traject en mitochondriale flitsen van reactieve zuurstof soorten.

Photostimulatie door Femtosecond Laser activeert extracellulaire-Signal-gereguleerde kinase (ERK) signalering of mitochondriale gebeurtenissen in doelcellen

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Optische methoden, zoals optogenetica kunnen de nauwkeurige modulatie van cellulaire moleculaire signalen bieden. Ons protocol toonde een orale optische manipulatie van cellulaire signaalmoleculen door femtoseconde laserstimulatie. Door onze femtosecondelaser in een confocale microscoop te koppelen, kan onze techniek eencellige of subcellulaire werking bieden door femtoseconde laserstimulatie en de real-time, moleculaire dynamische monitoring door confocale microscopie.Deze methode kan worden toegepast op fluorescerende microscopie systemen door het koppelen van een femtosecond laser in het systeem op de juiste manier. Voor iedereen die probeert onze methode voor de eerste keer, volg dan de afzonderlijke instructies van de laser faciliteit of zoek begeleiding van professionals bij het bedienen van een lab femtosecond laser bron. Om te beginnen, zet de femtoseconde laser en de confocale microscoop.Gebruik reflecterende spiegels om de femtoseconde laserstraal door een mechanische sluiter te leiden. Stel vervolgens een relaistelscoop in bestaande uit een paar lenzen om de breedte van de transmissiestraal uit te breiden. Dit moet in overeenstemming zijn met de achterkant diafragma van het doel.Nu, stuur de reflecterende spiegels om de uitgebreide straal uit te lijnen in de microscoop. Pas de twee reflecterende spiegels, hier gewezen, om de focus van de femtosecond laser af te stemmen op het midden van het gezichtsveld. Tot slot, meet en stem de lasers af zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Cultuur Hela cellen met behulp van standaard technieken. Wanneer u klaar bent om het experiment uit te voeren, transfecteert u de cellen met ERK2-GFP zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Schakel vervolgens de confocale microscoopmicroscoop en de femtosecondelaser aan.Zorg ervoor dat de sluiter van de laser gesloten is. Open vervolgens de microscoopsoftware. Stel de excitatielaser in op 488 nanometer en stel het vermogensniveau in op 0,1 milliwatt.Stel de beeldgrootte in op 512 bij 512 pixels en de intervaltijd van elke pixel op 2,4 microseconden. Stel vervolgens de intervaltijd in tussen twee frames op zes seconden om het bleken van foto's en fotoschade aan de cellen te minimaliseren. Stel ook de totale beeldvormende frames in op ongeveer 300 frames om ongeveer 30 minuten continue microscopie te bieden in een individueel experiment.Neem de schotel met de Hela cellen doorfected met ERK2-GFP uit de couveuse, en zet de schotel op de microscoop stadium. In de software, start snel scannen modus, en tune het doel om duidelijke fluorescerende beelden van de cellen te verwerven. Stop vervolgens met snel scannen en schakel over naar de beeldmodus met heldere velden met behulp van de CCD-camera.Open de sluiter en pas de afstand tussen de twee lenzen van de relaistelscoop aan om ervoor te zorgen dat de diameter van de femtoseconde laserfocus ongeveer twee micron bedraagt. Sluit vervolgens de sluiter om de afstelling te voltooien. Stel de kracht van de femtosecondelaser in op 15 tot 40 milliwatt voor een laser van 810 nanometer, of een laser van 20 tot 60 milliwatt voor een laser van 1040 nanometer.Stel vervolgens de openingstijd van de sluiter op 05 tot 0,2 seconden in. Gebruik de snelle scanmodus om een doelcel te selecteren die ERK2-GFP sterk uitdrukt. Eenmaal gevonden, verplaats het stadium om het cytosolgebied van de geselecteerde doelcel te lokaliseren, zodat het zich in het midden van het gezichtsveld bevindt wanneer het onder beeldvorming met helder veld is.Eenmaal gecentreerd, klik op de startknop om continue beeldvorming te beginnen. Open de sluiter op een vooraf gedefinieerd tijdslot om de femtoseconde laserstimulatie in de doelcel te leveren. Wanneer het beeldvormingsproces is voltooid, slaat u de beeldgegevens op voor verdere analyse.Stel de kracht van de femtosecondelaser in op 15 tot 40 milliwatt en 810 nanometer en 20 tot 60 milliwatt en 1040 nanometer bij het monster. Neem vervolgens de schotel met cellen die met ERK2-GFP uit de couveuse zijn getransfecteerd en leg deze op het microscoopstadium. Gebruik de snelle scanmodus om de doelcel te selecteren die ERK2-GFP goed uitdrukt.Stel vervolgens het confocale beeldvormingsproces in en definieer een speciaal scanframe als het stimulatieframe in het beeldvormingsproces. Definieer de parameter van het stimulatieframe. Stel een scangebied van twee bij twee bij drie bij drie vierkante micron in het cytosolgebied dicht bij de kern in de doelcel.Stel de totale scantijd in op 0,1 op 0,2 seconden. Stel de intervaltijd in tussen twee frames op zes seconden en stel de totale beeldvormende frames in op ongeveer 300 frames voor ongeveer 30 minuten continue microscopie. Sla de beeldgegevens op voor verdere gegevensanalyse.Synchroniseer de sluiter van de femtoseconde laser met die van de confocale scanning volgens de vooraf gedefinieerde foto stimulatie gebied dat alleen open is wanneer de laser scannen daalt in de stimulatie frame. Klik op de startknop om het continue microscopiebeeldvormingsproces te starten. Om mitochondriale morfologische dynamiek te observeren, transfecte Hela cellen met Mito-GFP fluorescerend wijzen op de mitochondriën, of een basis met mito-cpYFP te observeren mitoflashes.Na transfectie, zet de femtoseconde laser en zorg ervoor dat de sluiter is gesloten. Schakel vervolgens de confocale microscoopmicroscoop voor laserscannen in. Stel de excitatielaser in op 488 nanometer.Stel vervolgens het vermogensniveau van de 488 nanometerlaser in op 0,1 milliwatt. Stel bovendien de beeldgrootte in op 512 bij 512 pixels en de totale beeldtijd van elk frame op 2,2 seconden. Stel vervolgens de intervaltijd in tussen twee frames op nul seconden en de totale beeldvormende frames als 200 frames voor ongeveer 440 seconden continue microscopie in een individueel experiment.Neem de schotel met cellen doorgescheurd met mito GFP of mitochondriaal-gerichte circulair gepermuteerd geel fluorescerend eiwit uit de couveuse en zet de schotel op de microscoop stadium. Controleer de status van de femtosecondelaser om ervoor te zorgen dat de focus van de femtosecondelaser zich in het midden van het gezichtsveld bevindt. Stel vervolgens een referentiepijl in het midden van het fluorescerende weergavevenster in om de positie van de focus aan te geven.Stel vervolgens de kracht van de femtosecondelaser in op vijf tot 30 miliwatt met de laser op 810 nanometer en 10 tot 40 milliwatt voor de laser op 1040 nanometer. Stel de openingstijd van de sluiter in op 05 op 0,1 seconden. Gebruik de snelle scanmodus om de doelcel te selecteren die goed mito GFP of het mitochondriaal-gerichte circulair gerichte gepermuteerde gele fluorescerende eiwit uitdrukt.Selecteer een mitochondrion willekeurig in de doelcel als het experimentele onderwerp. Beweeg vervolgens de microscoopfase om de doelwantriale buisstructuur in het midden van het gezichtsveld te lokaliseren door de snelscanmodus te scannen, zoals aangegeven door de referentiepijl. Klik op de startknop om continue beeldvorming te starten.Ten slotte, open de sluiter op een vooraf gedefinieerde tijd om de femtoseconde laserstimulatie te leveren in de doel mitochondriale buisvormige structuur. Wacht tot het beeldverwerkingsproces is voltooid en sla vervolgens de beeldgegevens op voor verdere gegevensanalyse. Met behulp van de methode die in dit protocol wordt gepresenteerd, wordt ERK2 in de kern overgeërfd nadat deze is behandeld met een korte flits van de femtosecond-laser.ERK2-GFP fluorescentie bereikt het maximum na enkele minuten van femtoseconde laserstimulatie. De ERK2-moleculen worden ontcijferd na het activeren van downstreamsubstraten in de kern en vervolgens komt de ERK2 terug naar het cytoplasma dat wordt aangegeven door een afname van nucleaire GFP-fluorescentie. ERK2 kan meerdere keren worden geactiveerd door meerdere fotostimulaties.Daarom is het mogelijk om het ERK2-signaalpatroon nauwkeurig te manipuleren door de intervaltijd tussen meerdere stimuli te regelen. Bovendien kan ERK2 af en toe worden geactiveerd in aangrenzende cellen rond de gestimuleerde cel. Deze observatie geeft aan dat sommige diffusible moleculen kunnen worden vrijgegeven door de cel behandeld met de femtosecond laser om ERK2 te activeren in de aangrenzende cellen.Fosforylatie van ERK2 downstream eiwit eIF4E kan worden bevestigd geïndividualiseerd door immunofluorescentie microscopie. Dit resultaat geeft aan dat femtoseconde laserstimulatie de ERK-signaleringsroute met succes kan activeren. Mitochondriale oxidatieve flitsen of mitoflashes zijn oxidatieve uitbarstingen in mitochondriën die wortelen uit complexe moleculaire dynamica.De implementatie van deze foto stimulatie regeling resulteerde in een succesvolle mitoflash excitatie. Deze fotostimulatie toont ook variëteiten van mitochondriale moleculaire dynamica, waaronder fragmentatie en herstel van mitochondriale morfologie en oscillatie van mitochondriaal membraanpotentieel. Vergelijkbaar met foto geactiveerde mitoflashes, deze mitochondriën gebeurtenissen hebben verschillende prestaties met verschillende krachtintensiteiten.Het belangrijkste is om ervoor te zorgen dat de focus, grootte en de precisie van de femtosecond laser is een eigenschap voor de stimulatie in cellen. De near-infrared femtosecond laser kan gevaarlijk zijn voor gebruikers. Draag bij het volgen van dit protocol de juiste bescherming en voorkomt dat de laser uit de optische tafel komt.

Research

JoVE Journal

Biology

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Bepaling van de lipid raft van afscherming van fluorescent-gelabelde probes in levende cellen met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET microscopie voor Real-time monitoring van Signalering Evenementen in levende cellen met behulp Unimoleculaire Biosensoren

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Beoordeling van Mitochondriale functies en levensvatbaarheid van de cellen in de nier overexpressie Proteïne kinase C-isozymen

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocale beeldvorming van Single mitochondriaal superoxide Knippert Intact Heart of<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Imaging G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde Chemotaxis en de signalering evenementen in neutrofielen-achtige HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Identificatie van intracellulaire signalering Events Induced in levensvatbare cellen door de interactie met naburige cellen ondergaan apoptotische celdood

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...