Name: photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells
Uploaded: 2019-07-06T14:00:00
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Les travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (81571719 et 81661168014, 81673014 et 81870055), le Shanghai Municipal Science and Technology Committee (18QA1402300 et 16XD1403100), et national Key R-D Plan (2017YFA0104000).

MISE EN GARDE: Le protocole présenté ci-dessous implique l'utilisation du laser NIR femtoseconde et des produits chimiques toxiques. S'il vous plaît prêter attention à tous les dommages possibles induits par les procédures d'expérience. Veuillez lire les fiches de sécurité de tous les produits chimiques ou autres matériaux pertinents avant utilisation. S'il vous plaît suivre les instructions de sécurité des installations laser ou consulter les professionnels pour obtenir des conseils avant d...

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	<li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-signalling+dynamics+in+time+and+space.">Cell-signalling dynamics in time and space.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).</li><li>Scott, J. D., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+in+space+and+time:+where+proteins+come+together+and+when+they&#8217;re+apart.">Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they&#8217;re apart.</a> Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience.">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states.">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li><li>Toettcher, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+enables+functional+analysis+of+human+embryonic+stem+cell&#8211;derived+grafts+in+a+Parkinson's+disease+model.">Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell&#8211;derived grafts in a Parkinson's disease model.</a> Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Hoover, E. E., Squier, J. 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K., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+targeted+transfection+by+femtosecond+laser.">Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser.</a> Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).</li><li>Shen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mechanics &amp; chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cellular-resolution+optical+perturbation+and+imaging+of+place+cell+firing+fields.">Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields.</a> Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+cellular+light+from+green+fluorescent+protein+by+a+femtosecond+laser.">Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser.</a> Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).</li><li>Smith, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+of+two+types+of+Ca2++waves+in+rat+pheochromocytoma+PC12+cells+by+ultrashort+pulsed+near-infrared+laser+irradiation.">Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation.</a> Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).</li><li>Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+signaling+in+response+to+photostimulation+with+a+femtosecond+laser.">Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser.</a> Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+across+gaps+in+non-excitable+cells+induced+by+femtosecond+laser+exposure.">Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+regulation+of+gene+expression+in+targeted+cells.">All-optical regulation of gene expression in targeted cells.</a> Scientific reports. 4, 5346 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+Extracellular-Signal-Regulated+Kinase+Signaling+in+Target+Cells+by+Femtosecond+Laser.">Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser.</a> Laser &amp; Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).</li><li>Yan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+generation+of+reactive+oxygen+species+by+femtosecond-laser+irradiation.">Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation.</a> Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Shi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+swelling+and+restorable+fragmentation+stimulated+by+femtosecond+laser.">Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser.</a> Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).</li><li>Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duration,+magnitude+and+compartmentalization+of+ERK+MAP+kinase+activity:+mechanisms+for+providing+signaling+specificity.">The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity.</a> Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+in+single+mitochondria.">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134 (2), 279-290 (2008).</li><li>Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Flashes:+Elemental+Signaling+Events+in+Eukaryotic+Cells.">Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells.</a> Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).</li><li>Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+flashes:+new+insights+into+mitochondrial+ROS+signalling+and+beyond.">Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond.</a> The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).</li><li>Wang, S., Hu, M., He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+mitoflash+excited+by+femtosecond+laser.">Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser.</a> Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).</li></ol>

Nous démontrons une stratégie de photostimulation en combinant un laser femtoseconde avec un système de microscope confocal de balayage laser. La photostimulation peut fonctionner directement comme une microscopie à deux photons en définissant Stim-B en conséquence. Nous fournissons un protocole détaillé pour l'utilisation d'un court flash de laser femtoseconde pour déclencher la signalisation ERK ou mitoflashes dans les cellules cibles. Les différents modes de stimulation peuvent être exécutés selon différ...

La technologie de contrôle des molécules de signalisation cellulaire est une partie importante du développement des sciences de la vie. Traditionnellement, la méthode la plus couramment utilisée est le traitement biochimique par des médicaments ou des matériaux biologiques1,2,3. Au cours de la dernière décennie, l'invention de l'optogénétique ouvre une nouvelle ère pour la modulation des signaux moléculaires cellulaires. La transfection avec des protéines sensibles à la lumière par génie génétique fait de la lumière un outil puissant pour moduler diverses activités protéiques dans les cellules cibles. Cette technologie a fait des progrès encourageants tels que l'excitation et l'inhibition du signal neuronal, la promotion de l'expression des gènes, la manipulation des modèles de signal cellulaire, menant différents destins cellulaires et la recherche pathologique4,5 ,6,7,8,9. Cependant, la lumière ne peut fonctionner qu'en transfectant les cellules avec des protéines optogénétiques. Au stade actuel, il existe des méthodes rares qui permettent à la lumière de contrôler les molécules cellulaires directement en plus de l'optogénétique.
Le laser Femtosecond a fait progresser les recherches biologiques en fournissant une excitation multiphoton efficace tout en maintenant une bonne sécurité biologique. En déployant diverses stratégies de traitement photo, il a réalisé de nombreuses réalisations telles que la microscopie multiphoton, les microsurgeries et les applications optogénétiques multiphoton10,11,12,13 ,14,15,16. Des études récentes montrent que la stimulation laser femtoseconde a été démontrée comme une méthode optique très efficace pour induire directement des événements de signalisation moléculaire. Il a été constaté que l'irradiation laser femtoseconde étroitement focalisée sur le réticulum endoplasmique (ER) est capable d'épuiser le calcium dans les urgences et d'activer les canaux de calcium activé par le calcium (CRAC) pour former des signaux de calcium dans les cellules17. Ce signal de calcium photo-activé peut se propager entre plusieurs types de cellules18,19,20. En outre, il a également la capacité d'activer les voies de signalisation cellulaire telles que le facteur nucléaire des cellules T activées (NFAT) et la voie de signalisation ERK21,22. En ajustant l'intensité et la localisation de l'exposition au laser femtoseconde dans les cellules, par exemple, en concentrant le laser sur les mitochondries, il peut influencer la morphologie mitochondriale et les événements moléculaires23,24, 25. Plus précisément, les éclats de la génération mitochondriale de ROS peuvent être excités par la photostimulation, qui est marquée comme clignotements fluorescents dans les mitochondries (mitoflashes).
Par conséquent, la technologie de photostimulation est d'un bon potentiel pour être largement appliquée dans la recherche biologique connexe. C'est également une bonne chance d'étendre les applications laser femtoseconde dans le contrôle des molécules de signalisation cellulaire et des fonctions en plus de la microscopie. Ici, nous fournissons les détails techniques de la photostimulation. La photostimulation est réalisée en couplant un laser femtoseconde à un microscope confocal pour fournir une cellule cible unique avec une photostimulation flash courte. Il peut initier une activation ERK efficace et contrôlable dans la cellule. Si la photostimulation est située sur la structure tubulaire mitochondriale, le potentiel de membrane mitochondriale, la morphologie, le ROS, et les pores de transition de perméabilité, peuvent tous être commandés par la photostimulation. Basé sur ce schéma de photostimulation, nous fournissons une méthode détaillée d'activer la voie de signalisation ERK et d'influencer les événements mitochondriaux multiples dans les cellules Hela. Ce protocole élucide le processus de la prestation de la stimulation laser femtoseconde dans les cellules cibles.
Le système de photostimulation est établi sur un microscope confocal avec un électrocouple laser femtoseconde en elle pour la stimulation simultanée et la microscopie continue. Le laser femtoseconde (longueur d'onde : 1 040 nm, taux de répétition : 50 MHz, largeur d'impulsion : 120 fs, puissance moyenne de sortie maximale : 1 W) est divisé en deux faisceaux avant le couplage. L'un est guidé à travers un télescope relais composé d'une paire de lentilles. Il est ensuite directement reflété dans l'ouverture arrière d'un objectif (60x, N.A. 1.2, immersion dans l'eau) pour former un focus diffraction-limite (Stim-A). L'autre est reflétée dans la trajectoire optique de balayage du microscope confocal pour fonctionner comme un mode de balayage à deux photons (Stim-B). Stim-A présente un point de focalisation fixe au centre du champ de vision (FOV). Stim-B est une zone de balayage confocal partiel pré-conçue dans le FOV. Stim-A et Stim-B sont représentés à la figure 1A. Une caméra CCD sous le miroir dichroique (DM) fournit l'imagerie de champ lumineux pour surveiller le foyer du laser de femtoseconde.
Il y a quelques éléments essentiels cruciaux pour les expériences suivantes. Dans ce protocole, une source laser en fibre femtoseconde (1040 nm, 50 MHz, 120 fs) est utilisée comme exemple. Dans la pratique, la plupart des oscillateurs commerciaux femtoseconde peuvent être utilisés tant que la largeur de l'impulsion est plus courte que 200 fs et la densité de puissance maximale devrait être au-dessus du niveau de 1011 - 1012 W/cm2. Par exemple, un laser Ti: Sapphire habituellement utilisé pour la microscopie multiphoton est capable de remplacer le laser femtoseconde montré dans la figure 1B. La puissance du laser et d'autres paramètres de photostimulation doivent être réglés parce que les paramètres optiques (largeur d'impulsion, longueur d'onde et taux de répétition) varient beaucoup dans différents lasers femtosecondes qui induisent ainsi différentes excitations d'efficacité multiphoton.
En plus de la stimulation laser femtoseconde, la microscopie confocale fournit une imagerie cellulaire continue pour surveiller la dynamique moléculaire en temps réel dans les deux modes Stim-A et Stim-B. Les deux schémas de photostimulation (Stim-A et Stim-B) sont contrôlés par un obturateur mécanique à résolution milliseconde (figure 1).
En mode Stim-A, la position de mise au point laser est fixée au centre de FOV. Un télescope relais est utilisé pour assurer la mise au point du laser femtoseconde à être situé sur le plan d'imagerie confocale en admettant la distance entre deux lentilles dans la direction verticale (la direction de propagation laser, verticale au plan d'imagerie confocale, comme indiqué dans Figure 1). Grâce à l'imagerie sur le terrain lumineux de la caméra CCD, le diamètre de la mise au point laser peut être mesuré (2 m, figure 2B). Les durées de stimulation et les temps d'exposition sont contrôlés par un obturateur pendant le processus d'imagerie confocale.
En mode Stim-B, la zone de stimulation peut être pré-attribuée manuellement dans le logiciel de contrôle de l'imagerie confocale à n'importe quelle forme comme la ligne, le polygone ou le cercle. L'obturateur est synchronisé avec le processus de numérisation confocale. Il s'ouvre à l'heure pré-conçue qui est fixé par le logiciel de contrôle d'imagerie confocale. Ensuite, la zone de stimulation est numérisée par laser femtoseconde comme microscopie confocale. Ainsi, l'échantillon n'est stimulé par le laser femtoseconde que lorsque le processus de balayage confocal entre dans un cadre d'imagerie donné.
Le système de photostimulation peut être établi sur les microscopes métallurgiques inversés et droits selon les sujets de l'expérience. Les cellules in vitro cultivées dans les plats Petri sont préférables de travailler avec des microscopes inversés. Les animaux, en particulier les cerveaux des animaux vivants, sont plus appropriés avec des microscopes droits. Dans cette étude, nous prenons le microscope inversé comme exemple. Il convient de noter que la couverture du plat Petri n'est pas ouverte pendant l'ensemble des expériences.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>femtosecond laser</td>
			<td>Fianium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubation system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MIU-IBC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish with imprinted grid</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK-GFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>37145</td>
			<td>A gift from Rony Seger&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-cpYFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Heping Cheng&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mito-GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine (TMRM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Dilute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8430</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-eIF4E antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab76256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Bax antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab53154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome C antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab90529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells

Le contrôle direct des événements moléculaires définis cellulaires est important pour les sciences de la vie. Récemment, des études ont démontré que la stimulation laser femtoseconde peut simultanément activer plusieurs voies de signalisation moléculaire cellulaire. Dans ce protocole, nous montrons qu'en couplant le laser femtoseconde dans un microscope confocal, les cellules peuvent être stimulées précisément par le laser étroitement focalisé. Certains processus moléculaires qui peuvent être observés simultanément sont ensuite activés. Nous présentons des protocoles détaillés de la photostimulation pour activer la voie de signalisation de kinase réglée de signal extracellulaire (ERK) dans les cellules de Hela. Les éclairs mitochondriaux des espèces réactives d'oxygène (ROS) et d'autres événements mitochondriaux peuvent également être stimulés si la focalisation de l'impulsion laser de femtoseconde sur une certaine structure tubulaire mitochondriale. Ce protocole comprend le prétraitement des cellules avant la photostimulation, la livraison de la photostimulation par un flash laser femtoseconde sur la cible, et l'observation / l'identification des changements moléculaires par la suite. Ce protocole représente un outil tout optique pour les recherches biologiques connexes.

La photostimulation peut être effectuée simultanément avec la microscopie continue de balayage confocal. La photostimulation peut commencer à n'importe quel créneau horaire prédéfini dans la séquence de microscopie confocale en time-lapse. La microscopie confocale peut surveiller les molécules cellulaires par imagerie fluorescente. Les réponses moléculaires à la photostimulation et à d'autres dynamiques peuvent être identifiées de cette façon. Théoriquement, si ERK est ac...

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Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Le laser femtoseconde étroitement focalisé peut fournir la stimulation précise aux cellules en étant couplé dans une microscopie confocale permettant l'observation et la photostimulation en temps réel. La photostimulation peut activer des événements moléculaires cellulaires, y compris la voie de signalisation ERK et les éclairs mitochondriaux des espèces réactives d'oxygène.

Photostimulation par Femtosecond Laser Actives Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells Photo

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Les méthodes optiques, telles que l’optogénétique, peuvent fournir la modulation précise des signaux moléculaires cellulaires. Notre protocole a démontré une manipulation optique orale des moléculaires cellulaires de signal par stimulation de laser de femtoseconde. En couplant notre laser femtoseconde dans un microscope confocal, notre technique peut fournir une opération à cellule unique ou subcellulaire par stimulation laser femtoseconde et la surveillance dynamique moléculaire en temps réel par microscopie confocale.Cette méthode peut être appliquée à tous les systèmes de microscopie fluorescente en coupant un laser femtoseconde dans le système de la bonne manière. Pour toute personne qui essaie notre méthode pour la première fois, s’il vous plaît suivre les instructions distinctes de l’installation laser ou demander conseil à des professionnels lors de l’exploitation d’une source laser femtoseconde laboratoire. Pour commencer, allumez le laser femtoseconde et le microscope confocal.Utilisez des miroirs réfléchissants pour diriger le faisceau laser femtoseconde à travers un obturateur mécanique. Ensuite, placez un télescope relais composé d’une paire de lentilles pour augmenter la largeur du faisceau de transmission. Cela devrait être compatible avec l’ouverture arrière de l’objectif.Maintenant, dirigez les miroirs réfléchissants pour aligner le faisceau élargi dans le microscope. Ajustez les deux miroirs réfléchissants, soulignés ici, pour régler la mise au point du laser femtoseconde au centre du champ de vision. Enfin, mesurez et accordez les lasers tels que décrits dans le protocole texte qui l’accompagne.Culture Cellules Hela en utilisant des techniques standard. Lorsqu’elles sont prêtes à effectuer l’expérience, transfectez les cellules avec ERK2-GFP tel que décrit dans le protocole texte qui l’accompagne. Ensuite, allumez le microscope confocal à balayage laser et le laser femtoseconde.Assurez-vous que l’obturateur du laser est fermé. Ensuite, ouvrez le logiciel microscope. Réglez le laser d’excitation à 488 nanomètres, et réglez son niveau de puissance à 0,1 milliwatts.Définissez la taille de l’imagerie comme 512 par 512 pixels, et le temps d’intervalle de chaque pixel comme 2,4 microsecondes. Ensuite, réglez le temps d’intervalle entre deux images à six secondes pour minimiser le blanchiment des photos et les dommages photo aux cellules. En outre, réglez le total des cadres d’imagerie à environ 300 images pour fournir environ 30 minutes de microscopie continue dans une expérience individuelle.Prenez le plat contenant les cellules Hela transfectées avec ERK2-GFP de l’incubateur, et mettez le plat sur la scène du microscope. Dans le logiciel, commencez le mode de balayage rapide, et accordez l’objectif d’acquérir des images fluorescentes claires des cellules. Ensuite, arrêtez de scanner rapidement et passez en mode imagerie à champ lumineux à l’aide de la caméra CCD.Ouvrez l’obturateur et ajustez la distance entre les deux lentilles du télescope relais pour vous assurer que le diamètre de la mise au point laser femtoseconde est d’environ deux microns. Ensuite, fermez l’obturateur pour compléter l’ajustement. Réglez la puissance du laser femtoseconde à 15 à 40 milliwatts pour un laser de 810 nanomètres, ou un laser de 20 à 60 milliwatts pour un laser de 1040 nanomètres.Ensuite, réglez l’heure d’ouverture de l’obturateur à 05 à 0,2 seconde. Utilisez le mode de numérisation rapide pour sélectionner une cellule cible qui exprime fortement ERK2-GFP. Une fois trouvé, déplacez la scène afin de localisér la zone de cytosol de la cellule cible sélectionnée de sorte qu’elle soit au centre du champ de vision lorsqu’elle est sous imagerie à champ lumineux.Une fois centré, cliquez sur le bouton de démarrage pour commencer l’imagerie continue. Ouvrez l’obturateur à n’importe quelle plage horaire prédéfini pour fournir la stimulation laser femtoseconde dans la cellule cible. Lorsque le processus d’imagerie est terminé, enregistrez les données d’imagerie pour une analyse plus approfondie.Réglez la puissance du laser femtoseconde à 15 à 40 milliwatts et 810 nanomètres et 20 à 60 milliwatts et 1040 nanomètres à l’échantillon. Ensuite, prenez le plat contenant des cellules transfectées avec ERK2-GFP de l’incubateur et mettez-le sur la scène du microscope. Utilisez le mode de balayage rapide pour sélectionner la cellule cible exprimant bien ERK2-GFP.Ensuite, définissez le processus d’imagerie confocale et définissez un cadre de balayage spécial comme cadre de stimulation dans le processus d’imagerie. Définissez le paramètre du cadre de stimulation. Réglez une région de balayage de deux par deux à trois par trois microns carrés à la zone de cytosol près du noyau dans la cellule cible.Réglez le temps total de numérisation à 0,1 à 0,2 seconde. Réglez le temps d’intervalle entre deux images à six secondes et définissez les images totales à environ 300 images pour fournir environ 30 minutes de microscopie continue. Enregistrez les données d’imagerie pour une analyse plus approfondie des données.Synchronisez l’obturateur du laser femtoseconde avec celui de la numérisation confocale en fonction de la zone de stimulation photo prédéfinie qui n’est ouverte que lorsque le balayage laser tombe dans le cadre de stimulation. Cliquez sur le bouton de démarrage pour démarrer le processus continu d’imagerie par microscopie. Pour observer la dynamique morphologique mitochondriale, les cellules transfect hela avec Mito-GFP pour indiquer fluorescentement les mitochondries, ou une base avec mito-cpYFP pour observer des mitoflashes.Après la transfection, allumez le laser femtoseconde et assurez-vous que l’obturateur est fermé. Ensuite, allumez le microscope confocal à balayage laser. Réglez le laser excitation à 488 nanomètres.Ensuite, réglez le niveau de puissance du laser de 488 nanomètres à 0,1 milliwatt. En outre, réglez la taille de l’imagerie à 512 par 512 pixels et le temps total d’imagerie de chaque image à 2,2 secondes. Ensuite, définissez le temps d’intervalle entre deux images à zéro seconde et les images totales comme 200 images pour fournir environ 440 secondes de microscopie continue dans une expérience individuelle.Prenez le plat contenant des cellules transfectées avec mito GFP ou mitochondrial-ciblé circulairement permuté protéine fluorescente jaune de l’incubateur et mettre le plat sur le stade du microscope. Vérifiez l’état du laser femtoseconde pour vous assurer que la mise au point du laser femtoseconde est située au centre du champ de vision. Ensuite, placez une flèche de référence au centre de la fenêtre d’imagerie fluorescente pour indiquer la position de la mise au point.Ensuite, réglez la puissance du laser femtoseconde à cinq à 30 miliwatts avec le laser à 810 nanomètres et 10 à 40 milliwatts pour le laser à 1040 nanomètres. Réglez l’heure d’ouverture de l’obturateur à 05 à 0,1 seconde. Utilisez le mode de balayage rapide pour sélectionner la cellule cible qui exprime bien le Mito GFP ou la protéine fluorescente jaune permutée circulairement ciblée par mitochondrique.Sélectionnez une mitochondrion au hasard dans la cellule cible comme sujet expérimental. Ensuite, déplacez l’étape du microscope afin de localiser la structure tubulaire mitochondriale cible au centre du champ de vision par le mode de balayage rapide comme indiqué par la flèche de référence. Cliquez sur le bouton de démarrage pour commencer l’imagerie continue.Enfin, ouvrez l’obturateur à tout moment prédéfini pour fournir la stimulation laser femtoseconde dans la structure tubulaire mitochondriale cible. Attendez que le processus d’imagerie soit terminé, puis enregistrez les données d’imagerie pour une analyse plus poussée des données. En utilisant la méthode présentée dans ce protocole, ERK2 se translocalise dans le noyau après avoir été traité avec un court flash du laser femtoseconde.La fluorescence ERK2-GFP atteint le maximum après plusieurs minutes de stimulation laser femtoseconde. Les molécules ERK2 seront déphosphorylatées après avoir activé les substrats en aval dans le noyau, puis l’ERK2 revient au cytoplasme indiqué par une diminution de la fluorescence nucléaire du GFP. ERK2 peut être activé plusieurs fois par plusieurs stimulations photo.Par conséquent, il est possible de manipuler le modèle de signal ERK2 précisément en contrôlant le temps d’intervalle entre plusieurs stimuli. En outre, ERK2 peut parfois être activé dans les cellules adjacentes autour de la cellule stimulée. Cette observation indique que certaines molécules diffusibles peuvent être libérées par la cellule traitée avec le laser femtoseconde pour activer ERK2 dans les cellules adjacentes.La phosphorylation de la protéine eIF4E en aval eRK2 peut être confirmée individualisée par microscopie d’immunofluorescence. Ce résultat indique que la stimulation laser femtoseconde peut activer avec succès la voie de signalisation ERK. Les éclairs oxydatifs mitochondriaux ou les mitoflashes sont des éclats oxydatifs dans les mitochondries qui s’enracinent dans la dynamique moléculaire complexe.La mise en œuvre de ce programme de stimulation photo a donné lieu à une excitation réussie de mitoflash. Cette stimulation photo montre également des variétés de dynamique moléculaire mitochondriale comprenant la fragmentation et la restauration de la morphologie mitochondriale ainsi que l’oscillation du potentiel memitochondrial de membrane. Semblables aux mitoflashes activés par photo, ces événements de mitochondrie ont des performances différentes avec différentes intensités de puissance.La chose la plus importante est de s’assurer que la mise au point, la taille et la précision du laser femtoseconde est une propriété pour la stimulation dans les cellules. Le laser femtoseconde proche infrarouge peut être dangereux pour les utilisateurs. Lorsque vous suivez ce protocole, portez une protection adéquate et il empêche le laser de se diffuser à partir de la table optique.

Research

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