Name: photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells
Uploaded: 2019-07-06T14:00:00
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Die Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (81571719 und 81661168014, 81673014 und 81870055), Shanghai Municipal Science and Technology Committee (18QA1402300 und 16XD1403100) und National Key F&D Plan (2017YFA0104600).

ACHTUNG: Das nachfolgend vorgestellte Protokoll beinhaltet die Verwendung von NIR-Femtosekundenlasern und toxischen Chemikalien. Bitte achten Sie auf alle möglichen Schäden, die durch Experimentierverfahren verursacht werden. Bitte lesen Sie vor der Verwendung Sicherheitsdatenblätter aller relevanten Chemikalien oder sonstigen Materialien. Bitte befolgen Sie die Sicherheitshinweise der Laseranlagen oder wenden Sie sich an Fachleute, um sich vor dem Betrieb der Laserquelle beraten zu lassen.
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Wir demonstrieren eine Photostimulationsstrategie, indem wir einen Femtosekundenlaser mit einem laserscannenden Konfokalmikroskopsystem kombinieren. Die Photostimulation kann direkt als Zwei-Photonen-Mikroskopie wirken, indem Stim-B entsprechend definiert wird. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines kurzen Blitzes von Femtosekundenlaser, um ERK-Signalisierung oder Mitoflashes in Zielzellen auszulösen. Die verschiedenen Stimulationsmodi können nach unterschiedlichen experimentellen Zwecken und ...

Die Technologie zur Steuerung zellulärer Signalmoleküle ist ein wichtiger Teil der Entwicklung der Biowissenschaften. Traditionell ist die am häufigsten verwendete Methode die biochemische Behandlung durch Medikamente oder biologische Materialien1,2,3. In den letzten zehn Jahren eröffnet die Erfindung der Optogenetik eine neue Ära der zellulären molekularen Signalmodulation. Die Transfektion mit lichtempfindlichen Proteinen durch Gentechnik macht Licht zu einem leistungsfähigen Werkzeug, um verschiedene Proteinaktivitäten in der Zielzelle zu modulieren. Diese Technologie hat ermutigende Fortschritte wie Anregung und Hemmung des neuronalen Signals, Förderung der Genexpression, Manipulation zellulärer Signalmuster, Führung verschiedener Zellschicksale und pathologische Untersuchung4,5 ,6,7,8,9. Licht kann jedoch nur funktionieren, indem es Zellen mit optogenetischen Proteinen transfiziert. Im aktuellen Stadium gibt es seltene Methoden, die es Dem Licht ermöglichen, zelluläre Moleküle direkt neben der Optogenetik zu steuern.
Femtosecond Laser hat fortschrittliche biologische Forschungen durch effiziente Multiphotonen Erregung unter Beibehaltung einer guten biologischen Sicherheit. Durch den Einsatz vielfältiger Fotoverarbeitungsstrategien hat es zahlreiche Erfolge wie Multiphotonenmikroskopie, Mikrochirurgie und multiphotonoptogenetische Anwendungen10,11,12,13 realisiert. ,14,15,16. Jüngste Untersuchungen zeigen, dass die Femtosekunden-Laserstimulation als hocheffiziente optische Methode zur direkten Induzieren molekularer Signalereignisse nachgewiesen wurde. Es wurde festgestellt, dass eine eng fokussierte Femtosekunden-Laserbestrahlung auf endoplasmatischem Retikulum (ER) in der Lage ist, Kalzium in ER zu abbauen und Calcium-Freisetzungs-aktivierte Calciumkanäle (CRAC) zu aktivieren, um Kalziumsignale in Zellen17zu bilden. Dieses fotoaktivierte Kalziumsignal kann sichzwischen mehreren Zelltypen 18,19,20ausbreiten. Darüber hinaus hat es auch die Fähigkeit, Zellsignalwege wie Kernfaktor aktivierter T-Zellen (NFAT) und ERK-Signalweg21,22zu aktivieren. Durch die Anpassung der Intensität und Lokalisierung der Femtosekunden-Laserbelichtung in Zellen, z. B. durch Fokussierung des Lasers auf Mitochondrien, kann es die mitochondriale Morphologie und molekulare Ereignissebeeinflussen 23,24, 25. Insbesondere können Ausbrüche der mitochondrialen ROS-Generation durch Photostimulation angeregt werden, die als fluoreszierende Blitze in Mitochondrien (Mitoflashes) bezeichnet wird.
Daher ist die Photostimulationstechnologie von großem Potenzial, in der verwandten biologischen Forschung weit verbreitet zu sein. Es ist auch eine gute Chance, Femtosekunden-Laseranwendungen bei der Steuerung von zellulären Signalmolekülen und Funktionen neben der Mikroskopie zu erweitern. Hier stellen wir Ihnen die technischen Details der Photostimulation zur Verfügung. Die Photostimulation wird durch die Kopplung eines Femtosekundenlasers an ein konfokales Mikroskop erreicht, um eine einzelne Zielzelle mit einer kurzen Blitzphotostimulation zu versorgen. Es kann eine effiziente und steuerbare ERK-Aktivierung in der Zelle initiieren. Befindet sich die Photostimulation auf der mitochondrialen röhrenförmigen Struktur, können das mitochondriale Membranpotential, die Morphologie, die ROS und die Permeabilitätsübergangsporen durch die Photostimulation gesteuert werden. Basierend auf diesem Photostimulationsschema bieten wir eine detaillierte Methode zur Aktivierung des ERK-Signalwegs und zur Beeinflussung mehrerer mitochondrialer Ereignisse in Hela-Zellen. Dieses Protokoll erläutert den Prozess der Femtosekunden-Laserstimulation in Zielzellen.
Das Photostimulationssystem wird auf einem konfokalen Mikroskop mit femtosekundenLaserkopplung für die gleichzeitige Stimulation und kontinuierliche Mikroskopie eingerichtet. Der Femtosekundenlaser (Wellenlänge: 1.040 nm, Wiederholungsrate: 50 MHz, Pulsbreite: 120 fs, maximale Ausgangsdurchschnittsleistung: 1 W) wird vor der Kopplung in zwei Strahlen aufgeteilt. Man wird durch ein Relaisteleskop geführt, das aus einem Linsenpaar besteht. Es wird dann direkt in die Hinterapertur eines Objektivs (60x, N.A. = 1.2, Wassereintauchen) reflektiert, um einen Beugungs-Grenzfokus (Stim-A) zu bilden. Die andere wird auf den optischen Scanpfad des konfokalen Mikroskops reflektiert, um als Zwei-Photonen-Scanmodus (Stim-B) zu arbeiten. Stim-A präsentiert einen festen Fokuspunkt im Blickfeld (FOV). Stim-B ist ein vorgefertigter partieller konfokaler Scanbereich im FOV. Stim-A und Stim-B sind in Abbildung 1Adargestellt. Eine CCD-Kamera unter dem dichroitischen Spiegel (DM) bietet Eine Lichtfeld-Bildgebung zur Überwachung des Fokus des Femtosekundenlasers.
Für die folgenden Experimente gibt es einige wesentliche Punkte. In diesem Protokoll wird als Beispiel eine Femtosekunden-Faserlaserquelle (1040 nm, 50 MHz, 120 fs) verwendet. In der Praxis können die meisten kommerziellen Femtosekunden-Oszillatoren verwendet werden, solange die Pulsbreite kürzer als 200 fs ist und die Spitzenleistungsdichte über dem Niveau von 1011 x 1012 W/cm2liegen sollte. Zum Beispiel ist ein Ti: Saphirlaser, der normalerweise für die Multiphotonenmikroskopie verwendet wird, in der Lage, den femtosekundenlaser zu ersetzen, der in Abbildung 1Bgezeigt wird. Die Laserleistung und einige andere Photostimulationsparameter müssen abgestimmt werden, da die optischen Parameter (Pulsbreite, Wellenlänge und Wiederholungsrate) bei verschiedenen Femtosekundenlasern stark variieren, die somit unterschiedliche Multiphotonen-Erregungseffizienzen induzieren.
Neben der Femtosekunden-Laserstimulation bietet die konfokale Mikroskopie eine kontinuierliche Zellbildgebung zur Überwachung der molekularen Dynamik in Echtzeit im Stim-A- und Stim-B-Modus. Beide Photostimulationsschemata (Stim-A und Stim-B) werden durch einen mechanischen Verschluss mit Millisekundenauflösung gesteuert (Abbildung 1).
Im Stim-A-Modus wird die Position des Laserfokus in der Mitte von FOV fixiert. Ein Relaisteleskop wird verwendet, um sicherzustellen, dass der Fokus des Femtosekundenlasers auf einer konfokalen Bildebene lokalisiert wird, indem der Abstand zwischen zwei Linsen in vertikaler Richtung (die Laserausbreitungsrichtung, vertikal zur konfokalen Bildebene, wie in Abbildung 1). Durch die Lichtfeld-Bildgebung der CCD-Kamera kann der Durchmesser des Laserfokus gemessen werden (abbildung 2B). Die Stimulationsdauer und Belichtungszeiten werden während des konfokalen Bildgebungsprozesses durch einen Verschluss gesteuert.
Im Stim-B-Modus kann der Stimulationsbereich in der konfokalen Imaging-Steuerungssoftware manuell jeder Form wie Linie, Polygon oder Kreis vorzugewiesen werden. Der Verschluss wird mit dem konfokalen Scanvorgang synchronisiert. Es öffnet sich zur vorgefertigten Zeit, die durch die konfokale Imaging-Controlling-Software eingestellt wird. Anschließend wird der Stimulationsbereich mit femtosekundenlaser als konfokale Mikroskopie gescannt. So wird die Probe nur durch Femtosekundenlaser stimuliert, wenn der konfokale Scanvorgang in einen bestimmten Bildrahmen eintritt.
Das Photostimulationssystem kann je nach Versuchsteilnehmer sowohl auf invertierten als auch aufrechten metallurgischen Mikroskopen aufgebaut werden. In-vitro-Zellen, die in Petrischalen kultiviert werden, sind besser, mit invertierten Mikroskopen zu arbeiten. Tiere, insbesondere Gehirne lebender Tiere, eignen sich besser mit aufrechten Mikroskopen. In dieser Studie nehmen wir das invertierte Mikroskop als Beispiel. Es sollte beachtet werden, dass die Abdeckung der Petrischale während der gesamten Experimente nicht geöffnet wird.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>femtosecond laser</td>
			<td>Fianium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubation system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MIU-IBC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish with imprinted grid</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK-GFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>37145</td>
			<td>A gift from Rony Seger&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-cpYFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Heping Cheng&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mito-GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine (TMRM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Dilute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8430</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-eIF4E antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab76256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Bax antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab53154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome C antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab90529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells

Die direkte Kontrolle zellulär definierter molekularer Ereignisse ist für die Biowissenschaft wichtig. Kürzlich haben Studien gezeigt, dass die Femtosekunden-Laserstimulation gleichzeitig mehrere zelluläre molekulare Signalwege aktivieren kann. In diesem Protokoll zeigen wir, dass durch die Kopplung des Femtosekundenlasers in ein konfokales Mikroskop Zellen durch den eng fokussierten Laser präzise stimuliert werden können. Einige molekulare Prozesse, die gleichzeitig beobachtet werden können, werden anschließend aktiviert. Wir präsentieren detaillierte Protokolle der Photostimulation zur Aktivierung des extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK) Signalwegs in Hela-Zellen. Mitochondriale Blitze von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und anderen mitochondrialen Ereignissen können auch stimuliert werden, wenn der Femtosekunden-Laserpuls auf eine bestimmte mitochondriale Röhrenstruktur fokussiert wird. Dieses Protokoll umfasst die Vorbehandlung von Zellen vor der Photostimulation, die Bereitstellung der Photostimulation durch einen Femtosekunden-Laserblitz auf das Ziel und das Beobachten/Identifizieren molekularer Veränderungen danach. Dieses Protokoll stellt ein rein optisches Werkzeug für verwandte biologische Forschungen dar.

Die Photostimulation kann gleichzeitig zusammen mit einer kontinuierlichen konfokalen Scanmikroskopie durchgeführt werden. Die Photostimulation kann zu jedem vordefinierten Zeitfenster in der Zeitraffer-Konfokalmikroskopiesequenz beginnen. Die konfokale Mikroskopie kann zelluläre Moleküle durch fluoreszierende Bildgebung überwachen. Die molekularen Reaktionen auf Photostimulation und andere Dynamiken können auf diese Weise identifiziert werden. Theoretisch, wenn ERK aktiviert ist, wi...

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Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Der eng fokussierte Femtosekundenlaser kann eine präzise Stimulation der Zellen ermöglichen, indem er in eine konfokale Mikroskopie gekoppelt wird, die die Echtzeitbeobachtung und Photostimulation ermöglicht. Die Photostimulation kann zellmolekulare Ereignisse wie ERK-Signalweg und mitochondriale Blitze reaktiver Sauerstoffspezies aktivieren.

Photostimulation durch Femtosecond Laser aktiviert extrazellulär-signalregulierte Kinase (ERK) Signalisierung oder Mitochondrienereignisse in Zielzellen

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Optische Methoden wie die Optogenetik können die präzise Modulation zellulärer molekularer Signale ermöglichen. Unser Protokoll zeigte eine orale optische Manipulation von zellulären Signalmolekularen durch Femtosekunden-Laserstimulation. Durch die Kopplung unseres Femtosekundenlasers in ein konfokales Mikroskop kann unsere Technik eine einzellige oder subzelluläre Operation durch Femtosekunden-Laserstimulation und die molekulardynamische Echtzeitüberwachung durch konfokale Mikroskopie ermöglichen.Diese Methode kann auf alle fluoreszierenden Mikroskopiesysteme angewendet werden, indem ein Femtosekundenlaser auf die richtige Weise in das System gekoppelt wird. Für alle, die unsere Methode zum ersten Mal ausprobieren, folgen Sie bitte den separaten Anweisungen der Laseranlage oder suchen Sie Rat von Fachleuten beim Betrieb einer Labor femtosekunden Laserquelle. Schalten Sie zunächst den Femtosekundenlaser und das konfokale Mikroskop ein.Verwenden Sie reflektierende Spiegel, um den Femtosekunden-Laserstrahl durch einen mechanischen Verschluss zu lenken. Als nächstes stellen Sie ein Relaisteleskop ein, das aus einem Linsenpaar besteht, um die Transmissionsstrahlbreite zu erweitern. Dies sollte mit der Hintertür des Ziels im Einklang stehen.Steuern Sie nun die reflektierenden Spiegel, um den erweiterten Strahl in das Mikroskop auszurichten. Passen Sie die beiden reflektierenden Spiegel an, auf die hier hingewiesen wird, um den Fokus des Femtosekundenlasers auf die Mitte des Sichtfeldes abzustimmen. Schließlich messen und stimmen Sie die Laser, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.Kultur Hela Zellen mit Standard-Techniken. Wenn Sie bereit sind, das Experiment durchzuführen, transfezieren Sie die Zellen mit ERK2-GFP, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Schalten Sie als Nächstes das konfokale Laserscanning-Mikroskop und den Femtosekundenlaser ein.Stellen Sie sicher, dass der Verschluss des Lasers geschlossen ist. Öffnen Sie dann die Mikroskopsoftware. Stellen Sie den Anregungslaser auf 488 Nanometer und seinen Leistungspegel auf 0,1 Milliwatt ein.Legen Sie die Bildgröße auf 512 x 512 Pixel und die Intervallzeit jedes Pixels auf 2,4 Mikrosekunden fest. Legen Sie dann die Intervallzeit zwischen zwei Frames auf sechs Sekunden fest, um Fotobleichungen und Fotoschäden an den Zellen zu minimieren. Stellen Sie außerdem die gesamten Bildgebungsrahmen auf rund 300 Frames ein, um in einem einzelnen Experiment etwa 30 Minuten kontinuierliche Mikroskopie bereitzustellen.Nehmen Sie die Schale mit den mit ERK2-GFP transfizierten Hela-Zellen aus dem Inkubator und stellen Sie die Schale auf die Mikroskopstufe. Starten Sie in der Software den schnellen Scanmodus, und stimmen Sie das Ziel ein, um klare fluoreszierende Bilder der Zellen zu erfassen. Beenden Sie dann das schnelle Scannen und wechseln Sie mit der CCD-Kamera in den Hellfeld-Bildgebungsmodus.Öffnen Sie den Verschluss und passen Sie den Abstand zwischen den beiden Linsen des Relaisteleskops an, um sicherzustellen, dass der Durchmesser des Femtosekunden-Laserfokus etwa zwei Mikrometer beträgt. Schließen Sie dann den Verschluss, um die Einstellung abzuschließen. Stellen Sie die Leistung des Femtosekundenlasers auf 15 bis 40 Milliwatt für einen 810-Nanometer-Laser oder 20 bis 60 Milliwatt für einen 1040-Nanometer-Laser ein.Stellen Sie dann die Öffnungszeit des Verschlusses auf 05 auf 0,2 Sekunden ein. Verwenden Sie den schnellen Scanmodus, um eine Zielzelle auszuwählen, die ERK2-GFP stark ausdrückt. Verschieben Sie die Bühne, um den Zytosolbereich der ausgewählten Zielzelle so zu lokalisieren, dass sie sich in der Mitte des Sichtfeldes befindet, wenn sie unter HellerFeld-Bildgebung steht.Sobald Sie zentriert sind, klicken Sie auf den Startknopf, um mit der kontinuierlichen Bildgebung zu beginnen. Öffnen Sie den Verschluss zu jedem vordefinierten Zeitfenster, um die Femtosekunden-Laserstimulation in die Zielzelle zu liefern. Wenn der Bildgebungsprozess abgeschlossen ist, speichern Sie die Bildgebungsdaten zur weiteren Analyse.Stellen Sie die Leistung des Femtosekundenlasers auf 15 bis 40 Milliwatt und 810 Nanometer und 20 bis 60 Milliwatt und 1040 Nanometer an der Probe ein. Nehmen Sie dann die mit ERK2-GFP transfizierte Schale aus dem Inkubator und stellen Sie sie auf die Mikroskopstufe. Verwenden Sie den schnellen Scanmodus, um die Zielzelle auszuwählen, die ERK2-GFP ausdrückt.Legen Sie dann den konfokalen Bildgebungsprozess fest und definieren Sie einen speziellen Scanrahmen als Stimulationsrahmen im Bildprozess. Definieren Sie den Parameter des Stimulationsrahmens. Legen Sie einen Scanbereich von zwei mal zwei mal drei mal drei Quadratmikrometern im Cytosolbereich in der Nähe des Kerns in der Zielzelle fest.Legen Sie die Gesamtscanzeit auf 0,1 bis 0,2 Sekunden fest. Legen Sie die Intervallzeit zwischen zwei Frames auf sechs Sekunden fest, und legen Sie die gesamten Bildgebungsrahmen auf etwa 300 Frames fest, um etwa 30 Minuten kontinuierliche Mikroskopie bereitzustellen. Speichern Sie die Bilddaten für weitere Datenanalysen.Synchronisieren Sie den Verschluss des Femtosekundenlasers mit dem des konfokalen Scannens entsprechend dem vordefinierten Fotostimulationsbereich, der nur geöffnet ist, wenn das Laserscannen in den Stimulationsrahmen fällt. Klicken Sie auf die Starttaste, um den kontinuierlichen Mikroskopie-Bildprozess zu starten. Um die mitochondriale morphologische Dynamik zu beobachten, transfetieren Sie Hela-Zellen mit Mito-GFP, um die Mitochondrien zu fluoreszierend anzugeben, oder eine Basis mit Mito-cpYFP zur Beobachtung von Mitoflashes.Schalten Sie nach der Transfektion den Femtosekundenlaser ein und stellen Sie sicher, dass der Verschluss geschlossen ist. Schalten Sie dann das konfokale Laserscanning-Mikroskop ein. Stellen Sie den Anregungslaser auf 488 Nanometer ein.Stellen Sie dann den Leistungspegel des 488-Nanometer-Lasers auf 0,1 Milliwatt ein. Legen Sie außerdem die Bildgröße auf 512 x 512 Pixel und die Gesamtbildzeit jedes Frames auf 2,2 Sekunden fest. Legen Sie dann die Intervallzeit zwischen zwei Frames auf null Sekunden und die gesamten Bildgebungsrahmen auf 200 Frames fest, um in einem einzelnen Experiment etwa 440 Sekunden kontinuierliche Mikroskopie bereitzustellen.Nehmen Sie die Schale mit Zellen, die mit Mito GFP oder mitochondrial gezielt entrisiertes kreisförmiges, permutiertes gelbes Fluoreszenzprotein aus dem Inkubator transfiziert wurden, und stellen Sie die Schale auf die Mikroskopstufe. Überprüfen Sie den Status des Femtosekundenlasers, um sicherzustellen, dass sich der Fokus des Femtosekundenlasers in der Mitte des Sichtfeldes befindet. Legen Sie dann einen Referenzpfeil in der Mitte des fluoreszierenden Bildgebungsfensters fest, um die Position des Fokus anzuzeigen.Als nächstes stellen Sie die Leistung des Femtosekundenlasers auf fünf bis 30 Milliwatt mit dem Laser auf 810 Nanometer und 10 bis 40 Milliwatt für den Laser auf 1040 Nanometer. Stellen Sie die Öffnungszeit des Verschlusses auf 05 bis 0,1 Sekunden ein. Verwenden Sie den schnellen Scanmodus, um die Zielzelle auszuwählen, die gut mito GFP exdrückt, oder das mitochondrial ausgerichtete kreisförmige permutierte gelbe Fluoreszenzprotein.Wählen Sie ein Mitochondrion nach dem Zufallsprinzip in der Zielzelle als Versuchsgegenstand aus. Als nächstes bewegen Sie die Mikroskopstufe, um die mitochondriale Röhrenstruktur des Ziels in der Mitte des Sichtfeldes durch einen schnellen Scanmodus zu lokalisieren, wie durch den Referenzpfeil angegeben. Klicken Sie auf die Startschaltfläche, um die kontinuierliche Bildgebung zu starten.Öffnen Sie schließlich den Verschluss zu jeder vordefinierten Zeit, um die Femtosekunden-Laserstimulation in die mitochondriale Röhrenstruktur des Ziels zu liefern. Warten Sie, bis der Imaging-Prozess abgeschlossen ist, und speichern Sie dann die Bildgebungsdaten für weitere Datenanalysen. Mit der in diesem Protokoll vorgestellten Methode transloziert ERK2 in den Kern, nachdem es mit einem kurzen Blitz des Femtosekundenlasers behandelt wurde.DIE ERK2-GFP-Fluoreszenz erreicht nach einigen Minuten Femtosekunden-Laserstimulation das Maximum. Die ERK2-Moleküle werden nach aktivierung nachgeschalteter Substrate im Zellkern dephosphoryliert und dann kommt das ERK2 zum Zytoplasma zurück, das durch eine Abnahme der kernnuklearen GFP-Fluoreszenz angezeigt wird. ERK2 kann mehrfach durch mehrere Fotostimulationen aktiviert werden.Daher ist es möglich, das ERK2-Signalmuster präzise zu manipulieren, indem die Intervallzeit zwischen mehreren Reizen gesteuert wird. Darüber hinaus kann ERK2 gelegentlich in benachbarten Zellen um die stimulierte Zelle aktiviert werden. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass einige diffusible Moleküle von der zelle freigesetzt werden können, die mit dem Femtosekundenlaser behandelt wird, um ERK2 in den angrenzenden Zellen zu aktivieren.Die Phosphorylierung des ERK2-nachgeschalteten Proteins eIF4E kann durch Immunfluoreszenzmikroskopie individuell bestätigt werden. Dieses Ergebnis zeigt an, dass die Femtosekunden-Laserstimulation den ERK-Signalweg erfolgreich aktivieren kann. Mitochondriale oxidative Blitze oder Mitoflashes sind oxidative Ausbrüche in Mitochondrien, die aus der komplexen molekularen Dynamik wurzeln.Die Implementierung dieses Fotostimulationsschemas führte zu einer erfolgreichen Mitoflash-Erregung. Diese Fotostimulation zeigt auch Varianten der mitochondrialen Molekulardynamik, einschließlich Fragmentierung und Wiederherstellung der mitochondrialen Morphologie sowie Oszillation des mitochondrialen Membranpotentials. Ähnlich wie bei fotoaktivierten Mitoflashes weisen diese Mitochondrien-Ereignisse unterschiedliche Leistungen mit unterschiedlichen Leistungsintensitäten auf.Das Wichtigste ist, dass der Fokus, die Größe und die Präzision des Femtosekundenlasers eine Eigenschaft für die Stimulation in Zellen ist. Der Nahinfrarot-Femtosekundenlaser kann für Benutzer gefährlich sein. Wenn Sie diesem Protokoll folgen, tragen Sie den richtigen Schutz und verhindern, dass sich der Laser vom optischen Tisch austauft.

Research

JoVE Journal

Biology

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

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Forschung

Biologie

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