Name: photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells
Uploaded: 2019-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

העבודה נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81571719 ו 81661168014, 81673014, ו 81870055), שנגחאי העיר המדע והטכנולוגיה הוועדה (18QA1402300 ו 16XD1403100), והמפתח הלאומי R & D תוכנית (2017YFA0104600).

זהירות: הפרוטוקול המוצג להלן כרוך באמצעות לייזר ניר שנייה וכימיקלים רעילים. שים לב לכל הנזקים האפשריים הנגרמת על ידי הליכי ניסוי. אנא קראו גליונות נתונים בטיחותיים של כל הכימיקלים הרלוונטיים או חומרים אחרים לפני השימוש. אנא עקוב אחר הוראות בטיחות של מתקני לייזר או להתייעץ עם אנש?...

<ol>
	<li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-signalling+dynamics+in+time+and+space.">Cell-signalling dynamics in time and space.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).</li><li>Scott, J. D., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+in+space+and+time:+where+proteins+come+together+and+when+they&#8217;re+apart.">Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they&#8217;re apart.</a> Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience.">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states.">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li><li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras/Erk+module.">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).</li><li>Steinbeck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+enables+functional+analysis+of+human+embryonic+stem+cell&#8211;derived+grafts+in+a+Parkinson's+disease+model.">Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell&#8211;derived grafts in a Parkinson's disease model.</a> Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Hoover, E. E., Squier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multiphoton+microscopy+technology.">Advances in multiphoton microscopy technology.</a> Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).</li><li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432 (7019), 822 (2004).</li><li>Tirlapur, U. K., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+targeted+transfection+by+femtosecond+laser.">Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser.</a> Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).</li><li>Shen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mechanics &amp; chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cellular-resolution+optical+perturbation+and+imaging+of+place+cell+firing+fields.">Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields.</a> Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+cellular+light+from+green+fluorescent+protein+by+a+femtosecond+laser.">Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser.</a> Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).</li><li>Smith, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+of+two+types+of+Ca2++waves+in+rat+pheochromocytoma+PC12+cells+by+ultrashort+pulsed+near-infrared+laser+irradiation.">Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation.</a> Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).</li><li>Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+signaling+in+response+to+photostimulation+with+a+femtosecond+laser.">Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser.</a> Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+across+gaps+in+non-excitable+cells+induced+by+femtosecond+laser+exposure.">Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+regulation+of+gene+expression+in+targeted+cells.">All-optical regulation of gene expression in targeted cells.</a> Scientific reports. 4, 5346 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+Extracellular-Signal-Regulated+Kinase+Signaling+in+Target+Cells+by+Femtosecond+Laser.">Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser.</a> Laser &amp; Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).</li><li>Yan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+generation+of+reactive+oxygen+species+by+femtosecond-laser+irradiation.">Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation.</a> Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Shi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+swelling+and+restorable+fragmentation+stimulated+by+femtosecond+laser.">Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser.</a> Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).</li><li>Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duration,+magnitude+and+compartmentalization+of+ERK+MAP+kinase+activity:+mechanisms+for+providing+signaling+specificity.">The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity.</a> Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+in+single+mitochondria.">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134 (2), 279-290 (2008).</li><li>Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Flashes:+Elemental+Signaling+Events+in+Eukaryotic+Cells.">Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells.</a> Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).</li><li>Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+flashes:+new+insights+into+mitochondrial+ROS+signalling+and+beyond.">Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond.</a> The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).</li><li>Wang, S., Hu, M., He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+mitoflash+excited+by+femtosecond+laser.">Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser.</a> Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).</li></ol>

אנו מדגימים אסטרטגיה פוטוסטימולציה על ידי שילוב לייזר משני השניים באמצעות סריקת לייזר ומערכת מיקרוסקופ קונטוטרציה. הגירוי יכול לעבוד ישירות כמיקרוסקופיה של שני הפוטונים על ידי הגדרת "היכל הקיטור" בהתאם. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניצול הבזק קצר של לייזר הפטושני להפעיל איתות של טיפשה או ?...

הטכנולוגיה של שליטה מולקולות איתות הסלולר היא חלק חשוב של התפתחות מדעי החיים. באופן מסורתי, השיטה הנפוצה ביותר היא טיפול ביולוגי על ידי תרופות או חומרים ביולוגיים1,2,3. במהלך העשור האחרון, ההמצאה של אלקטרואופטיקה פותחת עידן חדש לאפנון תדר מולקולרי סלולרי. העברה עם חלבונים רגישים באור על ידי הנדסת גנים גורם לאור להפוך כלי רב עוצמה כדי לווסת את פעילות החלבונים השונים בתא היעד. טכנולוגיה זו הפכה עידוד מתקדם כגון עירור ועיכוב של אות עצבי, קידום ביטוי גנים, מניפולציה דפוסי האותות הסלולריים, מוביל גורלות תא שונים וחקירה פתולוגית4,5 ,6,7,8,9. עם זאת, אור יכול לעבוד רק על ידי הינע תאים עם חלבונים אלקטרואופטיקה. בשלב הנוכחי, קיימות שיטות נדירות המאפשרות אור לשלוט מולקולות הסלולר ישירות מלבד אלקטרואופטיקה.
לייזר פטושני יש מחקרים ביולוגיים מתקדמים על ידי מתן עירור רב-פוטון יעיל תוך שמירה על בטיחות ביולוגית טובה. על-ידי פריסת אסטרטגיות עיבוד מגוונות של תמונות, היא הבינה הישגים רבים כגון מיקרוסקופ רב-פוטון, מיקרוניתוחים ויישומים מרובי פוטון10,11,12,13 ,14,15,16. חקירות שנעשו לאחרונה מראים כי גירוי לייזר של הנשים השני הוכח כשיטה אופטית יעילה ביותר כדי לגרום ישירות לאירועים איתות מולקולרי. זה נמצא כי הקרנה הדוקה התמקדות בלייזר לייזר באופן הדוק על רשתית העין (ER) הוא מסוגל לרוקן את הסידן ב-ER ולהפעיל סידן המופעל לשחרר סידן (CRAC) ערוצים ליצור אותות סידן בתאים17. זה אות סידן המופעל באמצעות תמונה יכול להתפשט בין סוגים מרובים של תאים18,19,20. יתר על כן, יש לו גם את היכולת להפעיל משעולים תא איתות כגון גורם גרעיני של הפעלת תאים T (nfat) ו-איתות טיפשה מסלול21,22. על-ידי התאמת העוצמה והלוקליזציה של חשיפה לייזר של פטושניות בתאים, לדוגמה, התמקדות בלייזר על המיטו, היא יכולה להשפיע על מורפולוגיה מיטוכונדריאלי ואירועים מולקולריים23,24, 25. במיוחד, צרורות של הדור מיטוכונדריאלי יכול להיות נרגש על ידי פוטוגירוי, אשר העיר כמו הבזקי פלורסנט ב המיטוסיה (mitoflashes).
מכאן, הטכנולוגיה לגירוי התמונה הוא בעל פוטנציאל טוב להיות מיושם נרחב במחקר ביולוגי הקשורים. זוהי גם הזדמנות טובה להרחיב את היישומים לייזר של נשים בלייזר בשליטה של מולקולות איתות הסלולר פונקציות מלבד מיקרוסקופ. כאן, אנו מספקים את הפרטים הטכניים של הפוטוגריית. גירוי התמונה מושגת על ידי צימוד לייזר השני למיקרוסקופ מיקוד כדי לספק תא יעד יחיד עם פוטוגריית פלאש קצר. זה יכול ליזום הפעלה יעילה וניתנת לשליטה של הטיפשה בתא. אם הגירוי הוא ממוקם על מבנה הכרישים מיטוכונדריאלי, הפוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי, מורפולוגיה, ROS, ו חדירות מעבר נקבוביות, כל יכול להיות נשלט על ידי פוטוגריית. בהתבסס על הערכה זו גירוי תמונה, אנו מספקים שיטה מפורטת של הפעלת מסלול איתות טיפשה והשפעה על אירועים מיטוכונדריאלי מרובים בתאי הלה. פרוטוקול זה מהבהיר את התהליך של העברת גירוי לייזר משני בלבד לתאי המטרה.
מערכת הפוטוסטימולציה מבוססת על מיקרוסקופ קונטואני עם צימוד לייזר משני, לגירוי סימולטני ומיקרוסקופ רציף. לייזר המגלגל השני (אורך הגל: 1,040 ננומטר, קצב חזרה: 50 MHz, רוחב הדופק: 120 fs, מקסימום פלט כוח ממוצע: 1 W) הוא מפוצל לשתי קורות לפני צימוד. אחד מודרך דרך טלסקופ ממסר המורכב מזוג עדשות. לאחר מכן הוא משתקף ישירות לתוך הפתח האחורי של מטרה (60x, N.A. = 1.2, טבילה במים) כדי ליצור מוקד עקיפה-הגבלת (בתוך). השני משתקף בדרך הסריקה האופטית של מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי לעבוד כמצב הסריקה שני פוטון ("היכל-בי"). מציג נקודת מיקוד קבועה במרכז שדה הראייה (FOV). הוא אזור סריקת מוקד חלקי. מתוכנן מראש ב-FOV . מוצג באיור 1A מצלמת CCD תחת דיקרואיק mirror (DM) מספק הדמיה בשדה בהיר עבור ניטור המוקד של לייזר משני של הלייזר.
ישנם כמה יסודות חיוניים. לניסויים הבאים בפרוטוקול זה, מקור לייזר של סיבים משני השניים (1040 ננומטר, 50 MHz, 120 fs) משמש כדוגמה. בפועל, רוב המאיירים מסחרי המסחרי השני יכול לשמש כל עוד רוחב הדופק קצר יותר 200 fs ואת צפיפות הכוח שיא צריך להיות מעל רמה של 1011 ~ 10 ו/cm2. לדוגמה, Ti: לייזר ספיר משמש בדרך כלל עבור מיקרוסקופ מולטי פוטון מסוגל להחליף את הלייזר השני הראה באיור 1B. הכוח לייזר וכמה פרמטרים אחרים הגירוי צריך להיות מכוון מכיוון הפרמטרים האופטיים (רוחב הדופק, אורך הגל, ושיעור חזרה) לשנות הרבה לייזרים שונים לנשים שונות, כי ובכך לגרום שונה מרובת פוטון עירור יעילות.
יחד עם גירוי לייזר בשתי השניות, המיקרוסקופיה הקונפוקלית מספקת הדמיה תאית רציפה לניטור הדינמיקה המולקולרית בזמן אמת במצבי הפעולה של הקרן והקיטור. הן מערכות הפוטוסטימולציה ("היכל הקיטור" ו-"בלטה-B") נשלטות על-ידי תריס מכני עם רזולוציה אלפית שניה (איור 1).
במצב של לייזר, מיקום מוקד הלייזר מתוקן במרכז FOV. הטלסקופ ממסר משמש כדי להבטיח את המיקוד של לייזר שנייה להיות ממוקם על מטוס הדמיה קונפוקלית ידי כוונון המרחק בין שתי עדשות בכיוון האנכי (הפצת לייזר כיוון, אנכית למישור הדמיה קונפוקלית, כפי שמוצג ב איור 1). על ידי הדמיה בשדה בהיר של מצלמת CCD, את קוטר המוקד לייזר ניתן למדוד (~ 2 μm, איור 2B). משכי הגירוי וזמני החשיפה נשלטים על ידי תריס במהלך תהליך הדימות הקונמוקד.
במצב-B, ניתן להקצות מראש את אזור הגירוי באופן ידני בתוכנת הבקרה הדמיה של ההדמיה לכל צורה כמו קו, מצולע או עיגול. התריס מסונכרן עם תהליך הסריקה הקונקלית. זה נפתח בזמן מעוצב מראש אשר מוגדר באמצעות הדמיה קונפוקלית וקד השליטה בתוכנה. לאחר מכן, אזור הגירוי נסרק על-ידי לייזר משני בתור מיקרוסקופ קונטואני. לפיכך, המדגם מגורה רק על ידי לייזר משני בלבד כאשר תהליך סריקה מיקוד נכנס מסגרת הדמיה נתונה.
ניתן להקים את מערכת הפוטוסטימולציה בעזרת מיקרוסקופ מתכות הפוך וזקוף בהתאם לנושאי הניסוי. בתאי מבחנה מתורבתים בצלחות פטרי עדיף לעבוד עם מיקרוסקופים הפוכה. בעלי חיים, בעיקר המוחות של חיות חיות, מתאימים יותר עם מיקרוסקופים זקוף. במחקר זה, אנו לוקחים את המיקרוסקופ הפוך כדוגמה. יצוין כי העטיפה של צלחת פטרי אינה נפתחת במהלך כל הניסויים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>femtosecond laser</td>
			<td>Fianium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubation system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MIU-IBC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish with imprinted grid</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK-GFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>37145</td>
			<td>A gift from Rony Seger&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-cpYFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Heping Cheng&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mito-GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine (TMRM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Dilute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8430</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-eIF4E antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab76256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Bax antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab53154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome C antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab90529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells

בקרה ישירה של אירועים מולקולריים מוגדרים הסלולר חשוב למדעי החיים. לאחרונה, מחקרים הוכיחו כי גירוי לייזר של נשים במקביל יכול בו זמנית להפעיל מספר מסלולים מולקולריים סלולריים. בפרוטוקול זה, אנו מראים כי באמצעות צימוד לייזר מצמד לתוך מיקרוסקופ קונטואני, תאים יכולים להיות מגורה בדיוק על ידי הלייזר ממוקדת היטב. כמה תהליכים מולקולריים שניתן להבחין בו זמנית מופעלים לאחר מכן. אנחנו להציג פרוטוקולים מפורטים של הגירוי פוטותאי כדי להפעיל את האות מוסדר מוסדרים קינאז (טיפשה) מסלול איתות בתאי הלה. הבזקים מיטוכונדריאלי של מינים חמצן תגובתי (ROS) ואירועים מיטוכונדריאלי אחרים יכול להיות גם מגורה אם התמקדות הדופק לייזר של פטושני על מבנה מיטוכונדריאלי מסוים צינורי. פרוטוקול זה כולל התייחסות מראש לתאים לפני הפוטוסטימולציה, אספקת הפוטוסטימולציה על-ידי הבזק לייזר משני בלבד אל המטרה, והתבוננות/זיהוי של שינויים מולקולריים לאחר מכן. פרוטוקול זה מייצג כלי כולו אופטי עבור מחקרים ביולוגיים קשורים.

ניתן לבצע את הגירוי בו יחד עם מיקרוסקופ מתמשך של סריקת קונסקופיה. הגירוי יכול להתחיל בכל חריץ זמן מוגדר מראש ברצף מיקרוסקופיה מיקוד הזמן. המיקרוסקופיה הקונפוקלית יכולה לפקח על מולקולות סלולריות על ידי דימות פלורסנט. בדרך זו ניתן לזהות את התגובות המולקולריות לגירויים ול?...

Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

לייזר ממוקד בצורה ממוקדת בשני התאים יכול לספק גירוי מדויק לתאי החיבור למיקרוסקופיה מרוכזת המאפשרת תצפית וגירוי בזמן אמת. הגירוי יכול להפעיל את האירועים המולקולריים תאים כולל מסלול מאותת והבזקים מיטוכונדריאלי של מינים חמצן תגובתי.

גירוי התמונה על ידי לייזר מפעיל בלייזר-האות-מוסדרים-קינאז (טיפשה) איתות או האירועים מיטוכונדריאלי בתאי היעד

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

שיטות אופטיות, כגון אופטוגנטיקה יכולה לספק אפנון מדויק של אותות מולקולריים תאיים. הפרוטוקול שלנו הראה מניפולציה אופטית אוראלית של מולקולות אות תאי על ידי גירוי לייזר femtosecond. על ידי צימוד לייזר femtosecond שלנו לתוך מיקרוסקופ קונפוקלי, הטכניקה שלנו יכולה לספק פעולה ברמה חד-תאית או תת-תאית על ידי גירוי לייזר femtosecond וניטור דינמי בזמן אמת, מולקולרי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות על ידי צימוד לייזר femtosecond לתוך המערכת בצורה הנכונה. לכל מי שמנסה את השיטה שלנו בפעם הראשונה, אנא בצע את ההוראות הנפרדות של מתקן הלייזר או לחפש הדרכה מאנשי מקצוע בעת הפעלת מקור לייזר femtosecond מעבדה. כדי להתחיל, הפעל את לייזר femtosecond ואת מיקרוסקופ confocal.השתמש במראות רפלקטיביות כדי לכוון את קרן הלייזר femtosecond דרך תריס מכני. לאחר מכן, הגדר טלסקופ ממסר המורכב מזוג עדשות כדי להרחיב את רוחב קרן השידור. זה צריך להיות עקבי עם הצמצם האחורי של המטרה.עכשיו, לנווט את המראות רפלקטיביות כדי ליישר את הקרן המורחבת לתוך המיקרוסקופ. התאם את שתי המראות המחזפות, שצוין כאן, כדי לכוון את המוקד של לייזר femtosecond למרכז שדה המבט. לבסוף, למדוד ולכוונן את הלייזרים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.תאי הלה תרבותיים בטכניקות סטנדרטיות. כאשר מוכן לבצע את הניסוי, לשנות את התאים עם ERK2-GFP כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, הפעל את מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר femtosecond.ודא כי תריס הלייזר סגור. לאחר מכן, פתח את תוכנת המיקרוסקופ. הגדר את לייזר העירור על 488 ננומטר, ולהגדיר את רמת הכוח שלה ב 0.1 מילי וואט.הגדר את גודל ההדמיה כ- 512 על 512 פיקסלים ואת זמן המרווח של כל פיקסל כ- 2.4 מיקרו-שניות. לאחר מכן, הגדר את זמן המרווח בין שתי מסגרות בשש שניות כדי למזער הלבנת תמונות ונזק לתמונה לתאים. כמו כן, הגדר את מסגרות ההדמיה הכוללות בסביבות 300 מסגרות כדי לספק כ -30 דקות של מיקרוסקופיה רציפה בניסוי בודד.קח את המנה המכילה את תאי הלה מנודים עם ERK2-GFP מהאינקובטור, ולשים את המנה על הבמה מיקרוסקופ. בתוכנה, הפעל מצב סריקה מהירה, ולכוונן את המטרה כדי להשיג תמונות פלואורסצנטיות ברורות של התאים. לאחר מכן, הפסיקו את הסריקה המהירה ולעבור למצב דימות שדה בהיר באמצעות מצלמת CCD.פתח את התריס והתאם את המרחק בין שתי העדשות של טלסקופ הממסר כדי להבטיח כי קוטר מוקד הלייזר femtosecond הוא כשני מיקרון. לאחר מכן, סגור את התריס כדי להשלים את ההתאמה. הגדר את העוצמה של לייזר femtosecond ב 15 עד 40 מילי וואט עבור לייזר 810 ננומטר, או 20 עד 60 מיליוואט עבור לייזר 1040 ננומטר.לאחר מכן, קבעו את זמן הפתיחה של התריס על 05 עד 0.2 שניות. השתמש במצב סריקה מהירה כדי לבחור תא יעד המבטא בחוזקה את ERK2-GFP. לאחר שנמצא, הזז את השלב כדי להפוך את אזור הציטוסול של תא היעד שנבחר ללאקליזציה כך שהוא יהיה במרכז שדה המבט כאשר הוא נמצא תחת הדמיה של שדה בהיר.לאחר לחיצה על לחצן 'התחל' כדי להתחיל בהדמיה רציפה. פתח את התריס בכל משבצת זמן מוגדרת מראש כדי לספק את גירוי הלייזר femtosecond לתוך תא היעד. לאחר השלמת תהליך ההדמיה, שמור את נתוני ההדמיה לצורך ניתוח נוסף.הגדר את העוצמה של לייזר femtosecond ב 15 עד 40 מילי וואט ו 810 ננומטר ו 20 עד 60 מילי וואט ו 1040 ננומטר בדגימה. לאחר מכן, קח את המנה המכילה תאים מנודים עם ERK2-GFP מהאינקובטור ולשים אותו על שלב המיקרוסקופ. השתמש במצב סריקה מהירה כדי לבחור את תא היעד היטב המבטא ERK2-GFP.לאחר מכן, הגדר את תהליך ההדמיה הקונפוקל והגדר מסגרת סריקה מיוחדת כמסגרת הגירוי בתהליך ההדמיה. הגדר את הפרמטר של מסגרת הגירוי. הגדר אזור סריקה של שניים על שניים עד שלושה על שלושה מיקרונים רבועים באזור ציטוסול קרוב לגרעין בתא היעד.הגדר את זמן הסריקה הכולל ב- 0.1 עד 0.2 שניות. הגדר את זמן המרווח בין שתי מסגרות בשש שניות והגדר את מסגרות ההדמיה הכוללות בסביבות 300 מסגרות כדי לספק כ-30 דקות של מיקרוסקופיה רציפה. שמור את נתוני הדימות לניתוח נתונים נוסף.לסנכרן את התריס של לייזר femtosecond עם זה של סריקת confocal על פי אזור גירוי תמונה מוגדר מראש אשר פתוח רק כאשר סריקת הלייזר טיפות במסגרת הגירוי. לחץ על לחצן 'התחל' כדי להתחיל את תהליך הדמיית המיקרוסקופיה הרציף. כדי לבחון את הדינמיקה המורפולוגית המיטוכונדרית, החלף תאי הלה עם Mito-GFP כדי לציין באופן פלואורסצנטי את המיטוכונדריה, או בסיס עם mito-cpYFP כדי לצפות mitoflashes.לאחר החיתוך, הפעל את הלייזר femtosecond וודא שהתריס סגור. לאחר מכן, הפעל את מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר. הגדר את לייזר העירור על 488 ננומטר.לאחר מכן, להגדיר את רמת הכוח של לייזר 488 ננומטר ב 0.1 מיליוואט. בנוסף, הגדר את גודל ההדמיה ל- 512 על 512 פיקסלים ואת זמן ההדמיה הכולל של כל מסגרת ל- 2.2 שניות. לאחר מכן, הגדר את זמן המרווח בין שתי מסגרות באפס שניות ואת מסגרות ההדמיה הכוללות כ- 200 מסגרות כדי לספק כ- 440 שניות של מיקרוסקופיה רציפה בניסוי בודד.קח את המנה המכילה תאים מגולפים עם Mito GFP או חלבון פלואורסצנטי צהוב מחודד באופן מעגלי מהאינקובטור ולשים את המנה על שלב המיקרוסקופ. בדוק את המצב של לייזר femtosecond כדי להבטיח כי המוקד של לייזר femtosecond ממוקם במרכז שדה המבט. לאחר מכן, הגדר חץ התייחסות במרכז חלון ההדמיה הפלואורסצנטי כדי לציין את מיקום המוקד.לאחר מכן, להגדיר את הכוח של לייזר femtosecond ב 5 עד 30 miliwatts עם הלייזר ב 810 ננומטר ו 10 עד 40 מיליוואט עבור הלייזר ב 1040 ננומטר. הגדר את זמן הפתיחה של התריס ל- 05 עד 0.1 שניות. השתמש במצב סריקה מהירה כדי לבחור את תא היעד המבטא היטב את Mito GFP או את החלבון הפלואורסצנטי הצהוב הממוקד במיטוכונדריה.בחר מיטוכונדריה אחת באופן אקראי בתא היעד כנושא הניסיוני. לאחר מכן, להזיז את שלב המיקרוסקופ על מנת לוקליזציה של מבנה צינורי המיטוכונדריאלי היעד במרכז השדה של התצוגה על ידי מצב סריקה מהירה כפי שצוין על ידי חץ הייחוס. לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל דימות רציף.לבסוף, לפתוח את התריס בכל זמן מוגדר מראש כדי לספק את גירוי לייזר femtosecond לתוך המבנה צינורי המיטוכונדריאלי היעד. המתן עד להשלמת תהליך ההדמיה ולאחר מכן שמור את נתוני ההדמיה לניתוח נתונים נוסף. באמצעות השיטה המוצגת בפרוטוקול זה, ERK2 טרנסלוקטוס לתוך הגרעין לאחר שטופלו עם הבזק קצר של לייזר femtosecond.פלואורסצנטיות ERK2-GFP מגיעה למקסימום לאחר מספר דקות של גירוי לייזר femtosecond. מולקולות ERK2 יהיה dephosphorylated לאחר הפעלת מצעים במורד הזרם בגרעין ולאחר מכן ERK2 חוזר לציטופלסמה המצוין על ידי ירידה של פלואורסצנטיות GFP גרעינית. ERK2 יכול להיות מופעל מספר פעמים על ידי גירויים צילום מרובים.לכן, ניתן לתפעל את תבנית האות ERK2 דווקא על ידי שליטה בזמן מרווח בין גירויים מרובים. בנוסף, ERK2 יכול מדי פעם להיות מופעל בתאים סמוכים סביב התא מגורה. תצפית זו מצביעה על כך שמולקולות מפוזרות מסוימות עשויות להשתחרר על ידי התא שטופל בלייזר femtosecond כדי להפעיל את ERK2 בתאים הסמוכים.זרחון של ERK2 חלבון במורד הזרם eIF4E ניתן לאשר אישית על ידי מיקרוסקופיה immunofluorescence. תוצאה זו מציינת כי גירוי לייזר femtosecond יכול להפעיל בהצלחה את מסלול איתות ERK. הבזקים חמצוניים מיטוכונדריאליים או mitoflashes הם התפרצויות חמצוני המיטוכונדריה כי שורש מן הדינמיקה המולקולרית מורכבת.יישום ערכת גירוי תמונה זו הביאה לגירוי mitoflash מוצלח. גירוי צילום זה מראה גם זנים של דינמיקה מולקולרית מיטוכונדריאלית כולל פיצול ושחזור של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית, כמו גם תנודות של פוטנציאל קרום המיטוכונדריאלי. בדומה לתמונה מופעל mitoflashes, אלה אירועי המיטוכונדריה יש ביצועים שונים עם עוצמות כוח שונות.הדבר החשוב ביותר הוא לוודא כי המיקוד, גודל ואת הדיוק של לייזר femtosecond הוא מאפיין לגירוי בתאים. לייזר femtosecond כמעט אינפרא אדום עלול להיות מסוכן למשתמשים. בעת ביצוע פרוטוקול זה, ללבוש הגנה נאותה וזה מונע את הלייזר להתפזר מהשולחן האופטי.

Research

JoVE Journal

Biology

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

קביעת רפסודה ליפידים חלוקת בדיקות fluorescently-מתוייגים בתאים חיים באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

ההדמיה confocal של הבזקים בודדים מיטוכונדריאלי Superoxide בלב שלם או<em&gt; בVivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

זיהוי של איתות תאיים אירועים מושרה תאים קיימא על ידי אינטראקציה עם תאים שכנים מוות של תאים אפופטוטיים שעברו

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...