Name: photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells
Uploaded: 2019-07-06T14:00:00
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この研究は、中国国家自然科学財団(81571719および81661168014、81673014、81870055)、上海市科学技術委員会(18QA14023000および16XD1403100)、および国家キーR&プランD00000によって支援されました。

注意:以下に示すプロトコルは、NIRフェムト秒レーザーおよび有毒化学物質を使用することを含む。実験手順によって引き起こされる可能性のあるすべての損害に注意してください。使用前に、関連するすべての化学物質またはその他の材料の安全データシートをお読みください。レーザー光源を作動する前に、レーザー設備の安全指示に従うか、専門家に相談してください。...

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	<li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-signalling+dynamics+in+time+and+space.">Cell-signalling dynamics in time and space.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).</li><li>Scott, J. D., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+in+space+and+time:+where+proteins+come+together+and+when+they&#8217;re+apart.">Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they&#8217;re apart.</a> Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience.">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states.">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li><li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras/Erk+module.">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).</li><li>Steinbeck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+enables+functional+analysis+of+human+embryonic+stem+cell&#8211;derived+grafts+in+a+Parkinson's+disease+model.">Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell&#8211;derived grafts in a Parkinson's disease model.</a> Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Hoover, E. E., Squier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multiphoton+microscopy+technology.">Advances in multiphoton microscopy technology.</a> Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).</li><li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432 (7019), 822 (2004).</li><li>Tirlapur, U. K., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+targeted+transfection+by+femtosecond+laser.">Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser.</a> Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).</li><li>Shen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mechanics &amp; chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cellular-resolution+optical+perturbation+and+imaging+of+place+cell+firing+fields.">Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields.</a> Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+cellular+light+from+green+fluorescent+protein+by+a+femtosecond+laser.">Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser.</a> Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).</li><li>Smith, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+of+two+types+of+Ca2++waves+in+rat+pheochromocytoma+PC12+cells+by+ultrashort+pulsed+near-infrared+laser+irradiation.">Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation.</a> Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).</li><li>Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+signaling+in+response+to+photostimulation+with+a+femtosecond+laser.">Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser.</a> Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+across+gaps+in+non-excitable+cells+induced+by+femtosecond+laser+exposure.">Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+regulation+of+gene+expression+in+targeted+cells.">All-optical regulation of gene expression in targeted cells.</a> Scientific reports. 4, 5346 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+Extracellular-Signal-Regulated+Kinase+Signaling+in+Target+Cells+by+Femtosecond+Laser.">Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser.</a> Laser &amp; Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).</li><li>Yan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+generation+of+reactive+oxygen+species+by+femtosecond-laser+irradiation.">Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation.</a> Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Shi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+swelling+and+restorable+fragmentation+stimulated+by+femtosecond+laser.">Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser.</a> Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).</li><li>Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duration,+magnitude+and+compartmentalization+of+ERK+MAP+kinase+activity:+mechanisms+for+providing+signaling+specificity.">The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity.</a> Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+in+single+mitochondria.">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134 (2), 279-290 (2008).</li><li>Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Flashes:+Elemental+Signaling+Events+in+Eukaryotic+Cells.">Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells.</a> Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).</li><li>Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+flashes:+new+insights+into+mitochondrial+ROS+signalling+and+beyond.">Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond.</a> The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).</li><li>Wang, S., Hu, M., He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+mitoflash+excited+by+femtosecond+laser.">Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser.</a> Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).</li></ol>

フェムト秒レーザーとレーザー走査共焦点顕微鏡システムを組み合わせることで光刺激戦略を実証する。光刺激は、それに応じてStim-Bを定義することにより、2光子顕微鏡として直接働くことができる。我々は、ターゲット細胞におけるERKシグナル伝達またはミトフラッシュを引き起こすためにフェムト秒レーザーの短いフラッシュを利用するための詳細なプロトコルを提供する。異なる刺激...

細胞シグナル伝達分子を制御する技術は、生命科学の発展の重要な部分です。伝統的に、最も一般的に使用される方法は、薬物または生物学的材料1、2、3による生化学的治療である。過去10年間にわたり、光遺伝学の発明は、細胞分子信号変調のための新しい時代を開きます。遺伝子工学による光感受性タンパク質によるトランスフェクションは、光が標的細胞内の様々なタンパク質活性を調節する強力なツールになります。この技術は、神経信号の励起と阻害、遺伝子発現の促進、細胞信号パターンの操作、異なる細胞の運命と病理学的調査をリードするなどの進歩を奨励しています 4,5 ,6,7,8,9.しかし、光は光遺伝学的タンパク質で細胞をトランスフェクトすることによってのみ働くことができます。現在の段階では、光遺伝学以外に細胞分子を直接制御できる稀な方法があります。
フェムト秒レーザーは、良好な生物学的安全性を維持しながら、効率的なマルチフォトン励起を提供することにより、高度な生物学的研究を持っています。多様な写真処理戦略を展開することで、多光子顕微鏡、顕微鏡検査、多光子光遺伝学アプリケーション10、11、12、13などの多くの成果を実現しています。 ,14,15,16.最近の研究では、フェムト秒レーザー刺激が分子シグナル伝達事象を直接誘導する高効率光学法として実証されている。小プラズム網膜(ER)に対する緊密に焦点を当てたフェムト秒レーザー照射は、ERでカルシウムを枯渇させ、カルシウム放出活性化カルシウム(CRAC)チャネルを活性化して細胞17内でカルシウムシグナルを形成できることが分かった。この光活性化カルシウムシグナルは、複数のタイプの細胞18、19、20の間に広がりうる。さらに、活性T細胞(NFAT)およびERKシグナル伝達経路21、22の核因子などの細胞シグナル伝達経路を活性化する能力も有する。細胞におけるフェムト秒レーザー曝露の強度と局在化を調整することにより、例えば、レーザーをミトコンドリアに集色すると、ミトコンドリア形態および分子事象23、24、および、25.具体的には、ミトコンドリアROS生成のバーストは、ミトコンドリア(ミトフラッシュ)で蛍光点滅として言及されている光刺激によって興奮することができる。
したがって、光刺激技術は、関連する生物学的研究に広く適用される可能性が高い。また、顕微鏡検査以外の細胞シグナル伝達分子や機能の制御においてフェムト秒レーザー用途を拡張する良い機会でもあります。ここでは、光刺激の技術的な詳細を提供します。光刺激は、フェムト秒レーザーを共焦点顕微鏡に結合し、短いフラッシュ光刺激を持つ単一の標的細胞を提供することによって達成される。それは細胞の有効で、制御可能なERK活動化を開始できる。光刺激がミトコンドリア管状構造上に位置する場合、ミトコンドリア膜電位、形態、ROS、および透過性遷移毛孔は、すべて光刺激によって制御することができる。この光刺激スキームに基づいて、ERKシグナル伝達経路を活性化し、Hela細胞における複数のミトコンドリア事象に影響を与える詳細な方法を提供する。このプロトコルは、フェムト秒レーザー刺激を標的細胞に送り込むプロセスを解明する。
光刺激システムは同時刺激および連続的な顕微鏡のためのフェムト秒レーザー結合が付いている共焦点顕微鏡で確立される。フェムト秒レーザー(波長:1,040nm、繰り返し速度:50MHz、パルス幅:120fs、最大出力平均電力:1W)は、カップリング前に2つのビームに分割されます。一つは、レンズのペアからなる中継望遠鏡を介して導かれます。次に、回折限界焦点(Stim-A)を形成するために、目的の背面開口部(60x、N.A.=1.2、水浸漬)に直接反射されます。もう一つは、2光子走査モード(Stim-B)として機能する共焦点顕微鏡の走査光学経路に反映される。スティム A は、視野の中心 (FOV) に固定フォーカス ポイントを表示します。Stim-BはFOVであらかじめ設計された部分共焦点スキャン領域である。図 1A にスティム A とスティム B を示します。ダイクロイックミラー(DM)の下のCCDカメラは、フェムト秒レーザーの焦点を監視するための明視野イメージングを提供します。
以下の実験には重要な要素がいくつかあります。このプロトコルでは、フェムト秒ファイバーレーザー光源(1040nm、50MHz、120fs)を例に用いられる。実際には、ほとんどの市販のフェムト秒発振器は、パルス幅が200fsより短く、ピーク電力密度が1011~10 12 W/cm2のレベルを超える必要がある限り使用できます。例えば、Ti:サファイアレーザーは、通常、多光子顕微鏡検査に使用され、図1Bに示すフェムト秒レーザーを置き換えることができる。光学パラメータ(パルス幅、波長、繰り返し速度)は異なるフェムト秒レーザーで大きく異なるため、レーザーパワーやその他の光刺激パラメータは調整する必要があります。
フェムト秒レーザー刺激と共に、共焦点顕微鏡は、スティムAおよびスティムBモードの両方でリアルタイムで分子ダイナミクスを監視する連続的な細胞イメージングを提供します。両方の光刺激方式(Stim-AおよびStim-B)はミリ秒の解像度を持つメカニカルシャッターによって制御される(図1)。
スティムAモードでは、レーザーフォーカスの位置はFOVの中心に固定されます。中継望遠鏡は、2つのレンズ間を垂直方向に調整することにより、フェムト秒レーザーの焦点を高焦点に保つために使用されます(レーザー伝搬方向、共焦点イメージング平面への垂直方向) 図1)CCDカメラの明視野イメージングにより、レーザーフォーカスの直径を測定することができます(約2μm、図2B)。刺激時間および露出時間は共焦点イメージ投射プロセスの間にシャッターによって制御される。
Stim-B モードでは、刺激領域は、共焦点イメージング制御ソフトウェアで、ライン、ポリゴン、または円などの任意の形式に手動で割り当てることができます。シャッターは共焦点スキャンプロセスと同期されます。これは、共焦点イメージング制御ソフトウェアを介して設定された事前に設計された時間に開きます。次いで、刺激領域を共焦点顕微鏡としてフェムト秒レーザーでスキャンする。したがって、試料は、共焦点走査処理が所定の撮像フレームに入るときにのみフェムト秒レーザーによって刺激される。
光刺激システムは、実験対象に応じて反転および直立冶金顕微鏡の両方で確立することができる。ペトリ皿で培養されたインビトロ細胞は、反転顕微鏡で作業する方が良いです。動物、特に生きた動物の脳は、直立顕微鏡でより適しています。本研究では、反転顕微鏡を例にとった。ペトリ皿のカバーは、全体の実験中に開かれていないことに留意すべきです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>femtosecond laser</td>
			<td>Fianium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubation system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MIU-IBC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish with imprinted grid</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK-GFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>37145</td>
			<td>A gift from Rony Seger&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-cpYFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Heping Cheng&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mito-GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine (TMRM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Dilute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8430</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-eIF4E antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab76256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Bax antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab53154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome C antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab90529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells

細胞定義分子事象の直接制御は生命科学にとって重要である。近年、フェムト秒レーザー刺激が複数の細胞分子シグナル伝達経路を同時に活性化できることが研究で実証されている。このプロトコルでは、フェムト秒レーザーを共焦点顕微鏡に結合することで、細胞を密に焦点を合わせたレーザーによって正確に刺激できることを示す。同時に観察することができるいくつかの分子プロセスは、その後活性化されます。我々は、ヘラ細胞における細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)シグナル伝達経路を活性化するための光刺激の詳細なプロトコルを提示する。活性酸素種(ROS)および他のミトコンドリア事象のミトコンドリアフラッシュは、特定のミトコンドリア管状構造にフェムト秒レーザーパルスを集当すれば刺激することもできる。このプロトコルには、光刺激の前に細胞を前処理し、フェムト秒レーザーフラッシュによる光刺激をターゲットに送り、その後の分子変化を観察/同定することが含まれます。このプロトコルは、関連する生物学的研究のための全光学ツールを表す。

光刺激は連続的な共焦点スキャン顕微鏡と共に同時に行うことができる。光刺激は、タイムラプス共焦点顕微鏡シーケンス内の任意の事前定義されたタイムスロットで開始できます。共焦点顕微鏡は蛍光イメージングによって細胞分子を監視できる。光刺激やその他のダイナミクスに対する分子応答は、このようにして同定することができる。理論的には、ERKが活性?...

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Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

緊密に焦点を合わせたフェムト秒レーザーは、共焦点顕微鏡に結合することにより、細胞に正確な刺激を提供し、リアルタイムの観察と光刺激を可能にします。光刺激は、ERKシグナル伝達経路および活性酸素種のミトコンドリアフラッシュを含む細胞分子イベントを活性化することができる。

フェムトセカンドレーザーによる光刺激は、標的細胞における細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)シグナル伝達またはミトコンドリアイベントを活性化する

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

光遺伝学のような光学的方法は、細胞分子信号の精密な変調を提供することができる。我々のプロトコルは、フェムト秒レーザー刺激による細胞信号分子の経口光学操作を実証した。当社のフェムト秒レーザーを共焦点顕微鏡に結合することで、当社の技術は、フェムト秒レーザー刺激による単細胞または細胞内レベルの操作と、共焦点顕微鏡によるリアルタイムの分子動的モニタリングを提供することができます。この方法は、フェムト秒レーザーを適切な方法でシステムに結合することにより、任意の蛍光顕微鏡システムに適用することができます。初めて当社の方法を試している人のために、レーザー施設の別の指示に従うか、ラボフェムト秒レーザー源を操作する際に専門家からの指導を求めてください。まず、フェムト秒レーザーと共焦点顕微鏡をオンにします。反射ミラーを使用して、メカニカルシャッターを通してフェムト秒レーザービームを導きます。次に、一対のレンズからなるリレー望遠鏡をセットし、透過ビーム幅を広げる。これは、目的の背面開口と一致する必要があります。次に、反射ミラーを操縦して、拡大されたビームを顕微鏡に位置合わせします。ここで指摘した2つの反射ミラーを調整して、フェムト秒レーザーの焦点を視野の中心に合わせます。最後に、付属のテキスト プロトコルに記載されているとおりに、レーザーを測定および調整します。標準的な技術を用いた培養ヘラ細胞。実験を行う準備ができたら、付属のテキストプロトコルに記載されているようにERK2-GFPで細胞をトランスフェクトします。次に、レーザー走査型共焦点顕微鏡とフェムト秒レーザーをオンにします。レーザーのシャッターが閉じられていることを確認します。次に、顕微鏡ソフトを開きます。励起レーザーを488ナノメートルに設定し、その電力レベルを0.1ミリワットに設定します。イメージングサイズを512 x 512ピクセルに設定し、各ピクセルの間隔時間を2.4マイクロ秒に設定します。次に、2つのフレーム間の間隔を6秒に設定し、細胞への写真の漂白と写真の損傷を最小限に抑えます。また、イメージングフレームの合計を約300フレームに設定し、個々の実験で約30分間の連続顕微鏡検査を行います。インキュベーターからERK2-GFPにトランスフェクトしたヘラ細胞を含む皿を取り出し、その皿を顕微鏡のステージに置きます。ソフトウェアでは、高速スキャンモードを開始し、細胞の透明な蛍光画像を取得する目的を調整します。次に、高速スキャンを停止し、CCDカメラを使用して明視野イメージングモードに切り替えます。シャッターを開き、リレー望遠鏡の2つのレンズ間の距離を調整して、フェムト秒レーザーフォーカスの直径が約2ミクロンになるようにします。次に、シャッターを閉じて調整を完了します。フェムト秒レーザーのパワーを810ナノメートルのレーザーで15~40ミリワット、1040ナノメートルレーザーの場合は20~60ミリワットに設定します。次に、シャッターの開封時間を05秒に設定します。高速スキャンモードを使用して、ERK2-GFPを強く発現するターゲットセルを選択します。見つかったら、選択したターゲットセルのサイトゾル領域を局所化し、明視野イメージングの下で視野の中心になるようにステージを移動します。中央に配置したら、開始ボタンをクリックして連続イメージングを開始します。事前定義されたタイムスロットでシャッターを開き、フェムト秒レーザー刺激をターゲットセルに送ります。イメージングプロセスが完了したら、イメージングデータを保存してさらなる分析を行います。フェムト秒レーザーのパワーを15~40ミリワット、810ナノメートル、標本で20~60ミリワット、1040ナノメートルに設定します。次いで、インキュベーターからERK2-GFPにトランスフェクトした細胞を含む皿を取り出し、顕微鏡ステージに置きます。高速スキャンモードを使用して、ERK2-GFPを十分に発現するターゲットセルを選択します。次に、共焦点イメージングプロセスを設定し、撮像プロセスで刺激フレームとして特殊な走査フレームを定義します。刺激フレームのパラメータを定義します。標的細胞の核に近いサイトゾル領域に2~3個ずつ3平方ミクロンの走査領域を設定する。スキャン時間の合計を 0.1 秒から 0.2 秒に設定します。2つのフレーム間の間隔を6秒に設定し、総イメージングフレームを約300フレームに設定して、約30分の連続顕微鏡を提供します。さらなるデータ分析のためにイメージングデータを保存します。フェムト秒レーザーのシャッターを、レーザースキャンが刺激フレーム内に落ちるときにのみ開いている事前定義された写真刺激領域に従って共焦点スキャンのシャッターと同期させる。開始ボタンをクリックして、連続顕微鏡イメージングプロセスを開始します。ミトコンドリア形態学的ダイナミクスを観察するために、ミトコンドリアを蛍光的に示すミトコンドリアを示すミトグルドとヘラ細胞をトランスフェクトし、ミトフラッシュを観察するミトcpYFPを有する塩基を示す。トランスフェクションの後、フェムト秒レーザーをオンにして、シャッターが閉じられていることを確認します。次に、レーザー走査型共焦点顕微鏡をオンにします。励起レーザーを488ナノメートルに設定します。次に、488ナノメートルレーザーの電力レベルを0.1ミリワットに設定します。さらに、イメージングサイズを512 x 512ピクセルに、各フレームの総イメージング時間を2.2秒に設定します。次に、2つのフレーム間の間隔をゼロ秒に、総イメージングフレームを200フレームに設定し、個々の実験で約440秒間の連続顕微鏡検査を提供する。ミトGFPまたはミトコンドリアでトランスフェクトされた細胞を含む皿をインキュベーターから円形に転動した黄色の蛍光タンパク質をインキュベーターから取り出し、その皿を顕微鏡のステージに置きます。フェムト秒レーザーの状態を確認して、フェムト秒レーザーの焦点が視野の中央に位置していることを確認します。次に、蛍光イメージングウィンドウの中心に基準矢印を設定し、焦点の位置を示す。次に、フェムト秒レーザーのパワーを5~30ミリワットに設定し、レーザーは810ナノメートル、10~40ミリワットのレーザーは1040ナノメートルに設定します。シャッターの開始時間を 05 ~ 0.1 秒に設定します。速いスキャンモードを使用して、ミトGFPまたはミトコンドリア標的の円形に透過した黄色の蛍光タンパク質を良好に発現している標的細胞を選択します。実験対象として標的細胞内のミトコンドリアを無作為に選択する。次に、顕微鏡ステージを移動し、基準矢印で示すように高速走査モードにより視野の中心にあるターゲットミトコンドリア管状構造を局部化する。開始ボタンをクリックして、連続イメージングを開始します。最後に、事前に定義された任意の時間にシャッターを開き、フェムト秒レーザー刺激をターゲットミトコンドリア管状構造に送り込みます。イメージングプロセスが完了するまで待ってから、さらにデータ分析のためにイメージングデータを保存します。このプロトコルで提示された方法を使用して、ERK2はフェムト秒レーザーの短いフラッシュで処理された後、核に移入する。ERK2-GFP蛍光は、フェムト秒レーザー刺激の数分後に最大に達する。ERK2分子は核内の下流の基質を活性化した後に脱リン酸化され、次いで、ERK2は核GFP蛍光の減少によって示される細胞質に戻ってくる。ERK2は、複数回の写真刺激によって複数回活性化することができる。したがって、複数の刺激間の間隔時間を制御することによってERK2信号パターンを精密に操作することができる。さらに、ERK2は、刺激された細胞の周りの隣接する細胞で時折活性化され得る。この観察は、フェムト秒レーザーで処理された細胞によっていくつかの拡散性分子が放出され、隣接する細胞においてERK2を活性化することを示している。ERK2下流タンパク質eIF4Eのリン酸化は、免疫蛍光顕微鏡法により個別化して確認することができる。この結果は、フェムト秒レーザー刺激がERKシグナル伝達経路を正常に活性化できることを示している。ミトコンドリア酸化フラッシュまたはミトフラッシュは、複雑な分子動力学から根を張るミトコンドリアの酸化バーストである。この写真刺激スキームを実装すると、有糸引き起こしが成功しました。この写真刺激はまた、ミトコンドリア形態の断片化と回復、ミトコンドリア膜電位の振動を含むミトコンドリア分子動力学の品種を示しています。写真活性化ミトフラッシュと同様に、これらのミトコンドリアイベントは、異なる電力強度で異なる性能を有する。最も重要なことは、フェムト秒レーザーの焦点、サイズ、精度が細胞内の刺激の特性であることを確認することです。近赤外フェムト秒レーザーは、ユーザーに危険である可能性があります。このプロトコルに従うときは、適切な保護を着用し、光テーブルからレーザーが拡散するのを防ぎます。

Research

JoVE Journal

Biology

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

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イメージングG -タンパク質共役受容体（GPCR）を介するシグナル伝達事象その制御走キイロタマホコリカビ</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

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脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

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シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージング<em&gt;インビボ</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

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成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...