Name: photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells
Uploaded: 2019-07-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells at JoVE.com

이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81571719 및 81661168014, 81673014, 81870055), 상하이 시 과학 기술 위원회(18QA1402300 및 16XD1403100 및 16XD1403100) 및 국가 핵심 R&D 계획(21010Fa)의 지원을 받았습니다.

주의 사항: 아래에 제시된 프로토콜은 NIR 펨토초 레이저 및 독성 화학물질을 사용하는 것을 포함한다. 실험 절차에 의해 유발되는 모든 가능한 손해에 주의하십시오. 사용하기 전에 모든 관련 화학 물질 또는 기타 재료의 안전 데이터 시트를 읽으십시오. 레이저 소스를 작동하기 전에 레이저 시설의 안전 지침을 따르거나 전문가와 상의하여 안내하십시오.
1. 실험 ?...

<ol>
	<li>Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+cellular+signalling+networks+and+analysis+of+their+properties.">Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).</li><li>Kholodenko, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-signalling+dynamics+in+time+and+space.">Cell-signalling dynamics in time and space.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).</li><li>Scott, J. D., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+in+space+and+time:+where+proteins+come+together+and+when+they&#8217;re+apart.">Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they&#8217;re apart.</a> Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics.">Optogenetics.</a> Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li><li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+of+microbial+opsins+in+neuroscience.">Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience.</a> Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states.">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li><li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras/Erk+module.">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li><li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+mutations+and+targeted+drugs+can+disrupt+dynamic+signal+encoding+by+the+Ras-Erk+pathway.">Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway.</a> Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).</li><li>Steinbeck, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+enables+functional+analysis+of+human+embryonic+stem+cell&#8211;derived+grafts+in+a+Parkinson's+disease+model.">Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell&#8211;derived grafts in a Parkinson's disease model.</a> Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Hoover, E. E., Squier, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+multiphoton+microscopy+technology.">Advances in multiphoton microscopy technology.</a> Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).</li><li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432 (7019), 822 (2004).</li><li>Tirlapur, U. K., K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+targeted+transfection+by+femtosecond+laser.">Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser.</a> Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).</li><li>Shen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mechanics &amp; chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cellular-resolution+optical+perturbation+and+imaging+of+place+cell+firing+fields.">Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields.</a> Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+cellular+light+from+green+fluorescent+protein+by+a+femtosecond+laser.">Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser.</a> Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).</li><li>Smith, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+of+two+types+of+Ca2++waves+in+rat+pheochromocytoma+PC12+cells+by+ultrashort+pulsed+near-infrared+laser+irradiation.">Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation.</a> Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).</li><li>Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-to-neuron+signaling+in+response+to+photostimulation+with+a+femtosecond+laser.">Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser.</a> Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).</li><li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+across+gaps+in+non-excitable+cells+induced+by+femtosecond+laser+exposure.">Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+regulation+of+gene+expression+in+targeted+cells.">All-optical regulation of gene expression in targeted cells.</a> Scientific reports. 4, 5346 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivation+of+Extracellular-Signal-Regulated+Kinase+Signaling+in+Target+Cells+by+Femtosecond+Laser.">Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser.</a> Laser &amp; Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).</li><li>Yan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+generation+of+reactive+oxygen+species+by+femtosecond-laser+irradiation.">Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation.</a> Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion.">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li><li>Shi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+swelling+and+restorable+fragmentation+stimulated+by+femtosecond+laser.">Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser.</a> Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).</li><li>Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+propagation+in+vitro+of+poliomyelitis+viruses.+IV.+Viral+multiplication+in+a+stable+strain+of+human+malignant+epithelial+cells+(strain+HeLa)+derived+from+an+epidermoid+carcinoma+of+the+cervix.">Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix.</a> Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).</li><li>Chang, L., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+MAP+kinase+signalling+cascades.">Mammalian MAP kinase signalling cascades.</a> Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).</li><li>Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duration,+magnitude+and+compartmentalization+of+ERK+MAP+kinase+activity:+mechanisms+for+providing+signaling+specificity.">The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity.</a> Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flashes+in+single+mitochondria.">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134 (2), 279-290 (2008).</li><li>Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Flashes:+Elemental+Signaling+Events+in+Eukaryotic+Cells.">Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells.</a> Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).</li><li>Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+flashes:+new+insights+into+mitochondrial+ROS+signalling+and+beyond.">Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond.</a> The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).</li><li>Wang, S., Hu, M., He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+mitoflash+excited+by+femtosecond+laser.">Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser.</a> Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).</li></ol>

펨토초 레이저와 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템을 결합하여 광자극 전략을 시연합니다. 광자극은 그에 따라 Stim-B를 정의하여 2 광자 현미경으로 직접 작동 할 수 있습니다. 우리는 타겟 세포에서 ERK 신호 또는 mitoflashes를 트리거펨토초 레이저의 짧은 플래시를 활용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 상이한 자극 모드는 상이한 실험 목적 및 시스템에 따라 수행될 수 있다. Stim-A는 공?...

세포 신호 분자를 제어하는 기술은 생명 과학의 발전의 중요한 부분입니다. 전통적으로 가장 일반적으로 사용되는 방법은 약물 또는 생물학적 물질에 의한 생화학적 치료 1,2,3. 지난 10 년 동안, 광유전학의 발명은 세포 분자 신호 변조를위한 새로운 시대를 엽니 다. 유전자 공학에 의해 빛에 민감한 단백질을 가진 형질감염은 빛을 표적으로 하는 세포에 있는 각종 단백질 활동을 조절하는 강력한 공구가 됩니다. 이 기술은 신경 신호의 여기 및 억제, 유전자 발현 촉진, 세포 신호 패턴 조작, 다른 세포 운명및 병리학 적 조사 선도 4, 5와 같은 촉진적인 진전을 이루었습니다. ,6,7,8,9. 그러나 빛은 광유전학 적 단백질로 세포를 배회하여만 작동 할 수 있습니다. 현재 단계에서는 광유전학 외에 직접 세포 분자를 제어하는 빛을 가능하게하는 드문 방법이 존재합니다.
펨토초 레이저는 좋은 생물학적 안전성을 유지하면서 효율적인 다원화 여기를 제공함으로써 생물학적 연구를 발전시켰습니다. 다양한 광처리 전략을 전개하여 다광자 현미경, 현미경 검사법, 다광자 광유전학 응용 분야10,11,12,13 등 수많은 성과를 실현했습니다. ,14,15,16. 최근 조사에 따르면 펨토초 레이저 자극은 분자 신호 이벤트를 직접 유도하는 고효율 광학 방법으로 입증되었습니다. 그것은 안 구 체 망상에 단단히 초점을 맞춘 펨토 초 레이저 조사 (ER) ER에서 칼슘을 고갈 하 고 칼슘 방출 활성화 칼슘 (CRAC) 채널을 활성화 하는 세포에서 칼슘 신호를 형성 할 수 발견되었다 17. 이 사진 활성화 칼슘 신호는 세포의 여러 유형 사이에 확산 될 수있다18,19,20. 더욱이, 또한 활성화된 T세포(NFAT) 및 ERK 신호통로(21,22)의핵인자와 같은 세포 신호경로를 활성화시키는 기능도 있다. 세포에서 펨토초 레이저 노출의 강도와 국소화를 조정함으로써, 예를 들어, 미토콘드리아에 레이저를 집중시킴으로써, 미토콘드리아 형태및 분자 사건에 영향을 미칠 수 있다23,24, 25. 특히, 미토콘드리아 ROS 생성의 파열은 미토콘드리아 (mitoflashes)에서 형광섬으로 언급되는 사진 자극에 의해 흥분 될 수 있습니다.
따라서, 광자극 기술은 관련 생물학적 연구에 널리 적용될 수 있는 좋은 잠재력이다. 또한 현미경 검사법 외에 세포 신호 분자 및 기능을 제어하는 펨토초 레이저 응용 프로그램을 확장할 수 있는 좋은 기회이기도 합니다. 여기에서는 사진 의 기술적 세부 사항을 제공합니다. 광자극은 펨토초 레이저를 공초점 현미경에 결합하여 단일 표적 세포에 짧은 플래시 광자극을 제공함으로써 달성됩니다. 그것은 세포에서 효율적이고 제어 가능한 ERK 활성화를 시작할 수 있습니다. 광자극이 미토콘드리아 관 구조상에 위치하는 경우, 미토콘드리아 막 전위, 형태학, ROS 및 투과성 전이 기공, 모두 광자극에 의해 제어될 수 있다. 이 광자극 계획에 기초하여, 우리는 ERK 신호 경로를 활성화하고 헬라 세포에 있는 다중 미토콘드리아 사건에 영향을 미치는 상세한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 펨토초 레이저 자극을 표적 세포로 전달하는 과정을 설명합니다.
광자극 시스템은 펨토초 레이저 커플링을 통해 동시 자극및 연속 현미경 검사를 위해 공초점 현미경에 설치됩니다. 펨토초 레이저(파장: 1,040 nm, 반복 속도: 50MHz, 펄스 폭: 120 fs, 최대 출력 평균 전력: 1W)는 커플링 전에 두 개의 빔으로 분할됩니다. 하나는 한 쌍의 렌즈로 구성된 릴레이 망원경을 통해 안내됩니다. 이어서 회절 한계 초점(Stim-A)을 형성하기 위해 목표(60x, N.A. = 1.2, 수지 침지)의 후면 조리개에 직접 반영된다. 다른 하나는 공초점 현미경의 스캐닝 광학 경로에 반영되어 2광자 스캐닝 모드(Stim-B)로 작동한다. Stim-A는 시야 중심(FOV)에 고정 된 초점 점을 제공합니다. Stim-B는 FOV에서 미리 설계된 부분 공초점 스캐닝 영역입니다. 스팀-A 와 스팀-B는 그림 1A에나와 있다. DM(이색 거울) 아래의 CCD 카메라는 펨토초 레이저의 초점을 모니터링하기 위한 밝은 필드 이미징을 제공합니다.
다음 실험에 대 한 몇 가지 중요 한 필수 가 있습니다. 이 프로토콜에서 펨토초 광섬유 레이저 소스(1040 nm, 50 MHz, 120 fs)가 예로 사용된다. 실제로 대부분의 상용 펨토초 발진기는 펄스 폭이 200 fs보다 짧고 피크 전력 밀도가 1011 ~ 1012 W/cm2 의 수준 이상이어야하는 한 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Ti: 사파이어 레이저는 일반적으로 다광자 현미경 검사법에 사용되는 펨토초 레이저를 도 1B에나타내어 대체할 수 있다. 레이저 전력 및 기타 광자극 파라미터는 광학 파라미터(펄스 폭, 파장 및 반복 속도)가 서로 다른 펨토초 레이저에서 많이 다르기 때문에 조정되어야 하므로 다양한 다원화 여기 효율을 유도합니다.
펨토초 레이저 자극과 함께 공초점 현미경은 연속 세포 이미징을 제공하여 Stim-A 및 Stim-B 모드에서 분자 역학을 실시간으로 모니터링합니다. 두 광 자극 방식(Stim-A 및 Stim-B)은 밀리초 해상도의기계식 셔터에 의해 제어됩니다(그림 1).
Stim-A 모드에서는 레이저 초점의 위치가 FOV 의 중심에 고정됩니다. 릴레이 망원경은 수직 방향으로 두 렌즈 사이의 거리를 조정하여 공초점 이미징 평면에 위치하는 펨토초 레이저의 초점을 보장하기 위해 사용됩니다 (레이저 전파 방향, 공초점 이미징 평면에 수직 그림1). CCD 카메라의 밝은 필드 이미징에 의해, 레이저 초점의 직경을 측정할 수 있다(~2 μm, 도 2B). 공초점 이미징 프로세스 동안 자극 지속 시간과 노출 시간은 셔터에 의해 제어됩니다.
Stim-B 모드에서 자극 영역은 선, 다각형 또는 원과 같은 임의의 형태로 공초점 이미징 제어 소프트웨어에 수동으로 미리 할당될 수 있습니다. 셔터는 공초점 스캐닝 프로세스와 동기화됩니다. 공초점 이미징 제어 소프트웨어를 통해 설정된 미리 설계된 시간에 열립니다. 이어서, 자극 영역은 공초점 현미경으로 펨토초 레이저에 의해 스캔된다. 따라서, 샘플은 공초점 스캐닝 과정이 주어진 이미징 프레임에 들어갈 때 펨토초 레이저에 의해서만 자극된다.
광자극 시스템은 실험 대상자에 따라 역및 직립 야금 현미경 모두에 확립될 수 있다. 페트리 접시에서 배양 된 시험관 내 세포는 거꾸로 된 현미경으로 작업하는 것이 좋습니다. 동물, 특히 살아있는 동물의 뇌는 직립 현미경으로 더 적합합니다. 이 연구에서는, 우리는 거꾸로 된 현미경을 예로 들기. 페트리 접시의 덮개는 전체 실험 중에 열리지 않는다는 점에 유의해야합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>femtosecond laser</td>
			<td>Fianium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubation system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MIU-IBC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dish with imprinted grid</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERK-GFP</td>
			<td>addgene</td>
			<td>37145</td>
			<td>A gift from Rony Seger&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-cpYFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A gift from Heping Cheng&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mito-GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine (TMRM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Dilute in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P8430</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8200</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-eIF4E antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab76256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Bax antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab53154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome C antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab90529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&#38;L, Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photostimulation by femtosecond laser activates extracellular-signal-regulated kinase (erk) signaling or mitochondrial events in target cells

세포 정의 분자 사건의 직접적인 통제는 생명 과학에 중요합니다. 최근 펨토초 레이저 자극이 여러 세포 분자 신호 경로를 동시에 활성화할 수 있다는 연구 결과가 있습니다. 이 프로토콜에서는 펨토초 레이저를 공초점 현미경으로 결합하여 단단히 초점을 맞춘 레이저에 의해 세포를 정확하게 자극할 수 있음을 보여줍니다. 동시에 관찰 될 수있는 일부 분자 과정은 이후에 활성화됩니다. 우리는 헬라 세포에 있는 세포외 신호 조절 키나아제 (ERK) 신호 통로를 활성화하기 위하여 광자극의 상세한 프로토콜을 제시합니다. 반응성 산소 종 (ROS) 및 기타 미토콘드리아 이벤트의 미토콘드리아 섬광은 또한 특정 미토콘드리아 관 구조에 펨토초 레이저 펄스를 집중하는 경우에 자극될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 사진 자극 전에 세포를 전처리하고, 펨토초 레이저 플래시를 대상으로 광자극을 전달하고, 나중에 분자 변화를 관찰/식별하는 것이 포함됩니다. 이 프로토콜은 관련 생물학적 연구를 위한 모든 광학 도구를 나타냅니다.

광자극은 연속 공초점 스캐닝 현미경 검사법과 함께 동시에 수행 될 수있다. 광자극은 타임랩스 공초점 현미경 시퀀스에서 미리 정의된 모든 시간 슬롯에서 시작할 수 있습니다. 공초점 현미경 검사법은 형광화상진찰에 의해 세포 분자를 감시할 수 있습니다. 광자극 및 기타 역학에 대한 분자 반응은 이런 식으로 식별될 수 있습니다. 이론적으로 ERK가 활성화되면 세포질?...

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Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

단단히 초점을 맞춘 펨토초 레이저는 공초점 현미경 검사법에 결합되어 세포에 정확한 자극을 전달하여 실시간 관찰 및 광자극을 가능하게 합니다. 광자극은 ERK 신호 통로 및 반응성 산소 종의 미토콘드리아 섬광을 포함한 세포 분자 이벤트를 활성화할 수 있습니다.

펨토초 레이저에 의한 광자극은 대상 세포에서 세포외 신호 조절 키나아제(ERK) 신호 또는 미토콘드리아 이벤트를 활성화합니다.

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

광유전학과 같은 광학 적 방법은 세포 분자 신호의 정확한 변조를 제공 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 펨토초 레이저 자극에 의한 세포 신호 분자의 경구 광학 조작을 시연했습니다. 우리의 펨토초 레이저를 공초점 현미경으로 결합함으로써, 우리의 기술은 펨토초 레이저 자극및 공초점 현미경검사법에 의한 실시간 분자 동적 모니터링에 의해 단일 세포 또는 세포외 수준의 작동을 제공할 수 있습니다.이 방법은 펨토초 레이저를 적절한 방식으로 시스템에 결합하여 모든 형광 현미경 시스템에 적용될 수 있다. 처음으로 우리의 방법을 시도하는 사람을 위해, 레이저 시설의 별도의 지침을 따르거나 실험실 펨토 초 레이저 소스를 작동 할 때 전문가의 지침을 추구하시기 바랍니다. 시작하려면 펨토초 레이저와 공초점 현미경을 켭니다.반사 거울을 사용하여 펨토초 레이저 빔을 기계식 셔터를 통해 지시합니다. 다음으로, 한 쌍의 렌즈로 구성된 릴레이 망원경을 설정하여 전송 빔 폭을 확장합니다. 이는 목표의 뒷구와 일치해야 합니다.이제 반사 거울을 조종하여 확장된 빔을 현미경으로 정렬합니다. 여기서 지적한 두 개의 반사 거울을 조정하여 펨토초 레이저의 초점을 시야 의 중심으로 조정합니다. 마지막으로, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 레이저를 측정하고 조정합니다.표준 기술을 사용하여 배양 헬라 세포. 실험을 수행할 준비가 되면 첨부 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 ERK2-GFP로 세포를 변형시합니다. 다음으로, 레이저 스캐닝 공초점 현미경과 펨토초 레이저를 켭니다.레이저의 셔터가 닫혀 있는지 확인합니다. 그런 다음 현미경 소프트웨어를 엽니다. 488 나노미터에서 흥분 레이저를 설정하고 전력 레벨을 0.1 밀리와트로 설정합니다.이미징 크기를 512x 512픽셀로 설정하고 각 픽셀의 간격 시간을 2.4 마이크로초로 설정합니다. 그런 다음, 6초에 두 프레임 사이의 간격 시간을 설정하여 세포에 대한 사진 표백 및 사진 손상을 최소화합니다. 또한, 개별 실험에서 약 30분의 연속 현미경 검사를 제공하기 위해 총 이미징 프레임을 약 300프레임으로 설정합니다.인큐베이터에서 ERK2-GFP로 감염된 헬라 세포를 함유한 접시를 가져 와서 현미경 단계에 접시를 놓습니다. 소프트웨어에서 빠른 스캐닝 모드를 시작하고 목적을 조정하여 세포의 선명한 형광 이미지를 획득합니다. 그런 다음 빠른 스캐닝을 중지하고 CCD 카메라를 사용하여 밝은 필드 이미징 모드로 전환합니다.셔터를 열고 중계 망원경의 두 렌즈 사이의 거리를 조정하여 펨토초 레이저 초점의 직경이 약 2개의 미크론인지 확인합니다. 그런 다음 셔터를 닫고 조정을 완료합니다. 810 나노미터 레이저의 경우 15~40밀리와트에서 펨토초 레이저의 출력을 설정하거나 1040 나노미터 레이저의 경우 20~60밀리와트에 전력을 공급합니다.그런 다음 셔터 개통 시간을 05초에서 0.2초로 설정합니다. 빠른 스캐닝 모드를 사용하여 ERK2-GFP를 강력하게 표현하는 대상 셀을 선택합니다. 일단 발견되면, 밝은 필드 이미징에서 볼 의 중심에 있도록 선택한 대상 셀의 사이토솔 영역을 국소화하기 위해 단계를 이동합니다.중앙을 중심으로 시작 버튼을 클릭하여 연속 이미징을 시작합니다. 미리 정의된 시간 슬롯에서 셔터를 열어 펨토초 레이저 자극을 대상 셀에 전달합니다. 이미징 프로세스가 완료되면 추가 분석을 위해 이미징 데이터를 저장합니다.펨토초 레이저의 힘을 15~40밀리와트, 810나노미터, 20~60밀리와트, 1040나노미터로 시편에서 설정한다. 이어서, 인큐베이터로부터 ERK2-GFP로 감염된 세포를 함유한 접시를 가지고 현미경 단계에 놓는다. 빠른 스캐닝 모드를 사용하여 ERK2-GFP를 잘 표현하는 대상 셀을 선택합니다.그런 다음, 공초점 이미징 프로세스를 설정하고 화상 진찰 과정에서 자극 프레임으로 특수 스캐닝 프레임을 정의한다. 자극 프레임의 매개 변수를 정의합니다. 표적 세포내 핵에 가까운 사이토솔 지역에 2~3제곱미크론의 스캐닝 영역을 설정한다.총 검색 시간을 0.1초에서 0.2초로 설정합니다. 간격 시간을 6초로 설정하고 총 이미징 프레임을 약 300프레임으로 설정하여 약 30분의 연속 현미경 검사를 제공합니다. 추가 데이터 분석을 위해 이미징 데이터를 저장합니다.자극 프레임에서 레이저 스캐닝이 떨어질 때만 열리는 미리 정의된 사진 자극 영역에 따라 펨토초 레이저의 셔터를 공초점 스캐닝과 동기화합니다. 시작 버튼을 클릭하여 연속 현미경 이미징 프로세스를 시작합니다. 미토콘드리아 형태역학을 관찰하기 위해 미토-GFP를 가진 겔라 세포를 형광으로 표시하거나 미토콘드리아또는 미토-cpYFP를 사용하여 미토플라스트를 관찰한다.트랜스펙트 후 펨토초 레이저를 켜고 셔터가 닫히도록 합니다. 그런 다음 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 켭니다. 488 나노미터에서 흥분 레이저를 설정합니다.이어서, 488 나노미터 레이저의 전력 레벨을 0.1 밀리와트로 설정하였다. 또한 이미징 크기를 512x 512픽셀로 설정하고 각 프레임의 총 이미징 시간을 2.2초로 설정합니다. 그런 다음, 2프레임 사이의 간격 시간을 0초로 설정하고 총 이미징 프레임은 200프레임으로 설정하여 개별 실험에서 약 440초의 연속 현미경 을 제공합니다.미토 GFP 또는 미토콘드리아 표적 원형으로 변류된 노란 형광 단백질을 함유한 세포를 함유한 접시를 인큐베이터에서 꺼내 현미경 단계에 놓습니다. 펨토초 레이저의 초점이 시야 중앙에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 형광 이미징 창의 중앙에 참조 화살표를 설정하여 초점의 위치를 나타냅니다.다음으로, 810 나노미터에서 레이저로 5~30밀리와트에서 펨토초 레이저의 파워를 설정하고 1040 나노미터에서 레이저용 10~40밀리와트에 레이저를 장착한다. 셔터의 오프닝 시간을 05초에서 0.1초로 설정합니다. 빠른 스캐닝 모드를 사용하여 미토 GFP 또는 미토콘드리아 표적 원형 으로 변류된 황형 단백질을 잘 발현하는 표적 세포를 선택하십시오.실험 대상 셀에서 무작위로 하나의 미토콘드리온을 선택합니다. 다음으로, 현미경 단계를 이동하여 기준 화살표에 의해 표시된 바와 같이 빠른 스캐닝 모드로 시야의 중심에서 표적 미토콘드리아 관 구조를 국소화한다. 시작 버튼을 클릭하여 연속 이미징을 시작합니다.마지막으로, 미리 정의된 시간에 셔터를 열어 펨토컨드 레이저 자극을 표적 미토콘드리아 관 구조로 전달합니다. 이미징 프로세스가 완료될 때까지 기다린 다음 이미징 데이터를 저장하여 추가 데이터 분석을 합니다. ERK2는 이 프로토콜에 제시된 방법을 사용하여 펨토초 레이저의 짧은 플래시로 처리된 후 핵으로 배회합니다.ERK2-GFP 형광은 몇 분 동안 펨토초 레이저 자극 을 받은 후 최대값에 도달합니다. ERK2 분자는 핵에서 하류 기판을 활성화한 후 탈포화되고 ERK2는 핵 GFP 형광의 감소로 표시된 세포질로 돌아온다. ERK2는 여러 사진 자극에 의해 여러 번 활성화될 수 있다.따라서 여러 자극 사이의 간격 시간을 제어하여 ERK2 신호 패턴을 정밀하게 조작할 수 있다. 또한, ERK2는 자극된 셀 주위의 인접 한 세포에서 때때로 활성화 될 수 있다. 이러한 관찰은 일부 확산 분자가 인접한 세포에서 ERK2를 활성화하기 위해 펨토초 레이저로 처리된 세포에 의해 방출될 수 있음을 나타낸다.ERK2 다운스트림 단백질 eIF4E의 인광은 면역형광 현미경 검사법에 의해 개별화된 것으로 확인될 수 있다. 이 결과는 펨토초 레이저 자극이 ERK 신호 경로를 성공적으로 활성화할 수 있음을 나타냅니다. 미토콘드리아 산화 플래시 또는 미토프속눈썹은 미토콘드리아에서 복잡한 분자 역학으로부터 뿌리를 뿌리는 산화 파열입니다.이 사진 자극 체계를 구현하면 성공적인 미토플래시 여기가 발생했습니다. 이 사진 자극은 또한 미토콘드리아 형태의 단편화 및 복원뿐만 아니라 미토콘드리아 막 전위진동을 포함한 미토콘드리아 분자 역학의 품종을 보여줍니다. 사진 활성화 된 mitof속눈썹과 마찬가지로,이 미토콘드리아 이벤트는 다른 전력 강도와 다른 성능을 가지고 있습니다.가장 중요한 것은 펨토초 레이저의 초점, 크기 및 정밀도가 세포 내 자극의 특성인지 확인하는 것입니다. 근적외선 펨토초 레이저는 사용자에게 위험할 수 있습니다. 이 프로토콜을 따르는 경우 적절한 보호 기능을 착용하고 레이저가 광학 테이블에서 확산되는 것을 방지합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

연구

생물학

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (FCS)에 의해 살아있는 세포에서 Fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징<em&gt; 생체</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...